Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مناعي لونين كفاءة استخدام كميات محدودة من الكتلة الحيوية

Published: May 1, 2013 doi: 10.3791/50064
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Utah School of Medicine

Summary

نحن تصف طريقة قوية لونين مناعي باستخدام خلايا T الأولية. تأسست هذه الطريقة على النهج القياسية، ولكن يستخدم مجموعة محددة من الظروف والكواشف التي تعمل على تحسين كفاءة لكميات محدودة من الخلايا. الأهم من ذلك، يتم تقديم وصفا مفصلا لمرحلة تحليل البيانات.

Abstract

لونين مناعي (رقاقة) هو وسيلة على نطاق واسع المستخدمة لتحديد تفاعلات البروتينات المختلفة مع الحمض النووي في لونين من الخلايا الحية. ومن الأمثلة على ذلك تسلسل محدد الحمض النووي ملزم النسخ العوامل، histones ودولهم تعديل مختلفة، والإنزيمات مثل بلمرة RNA والعوامل المساعدة، ومكونات إصلاح الحمض النووي. على الرغم من الوجود المطلق لها، هناك نقص يصل إلى التاريخ، منهجيات تفصيلية لكلا إعداد مقاعد البدلاء من المواد وتحليل دقيق يسمح المقاييس الكمية للتفاعل. ونظرا لهذا النقص في المعلومات، وأيضا لأنه، مثل أي مناعي، وظروف يجب إعادة الأمثل لمجموعات جديدة من الظروف التجريبية، ومقايسة الشذرة هو عرضة للنتائج غير دقيقة أو الكمي على نحو رديء.

مشتق بروتوكول لدينا في نهاية المطاف من العمل المنوي على عامل النسخ: التفاعلات الحمض النووي 1،2، ولكن يشتمل على عدد من التحسينات لsensitivity واستنساخ للحصول يصعب أنواع الخلايا. وقد تم استخدام بروتوكول بنجاح 3،4، على حد سواء باستخدام QPCR لقياس تخصيب الحمض النووي، أو باستخدام متغير شبه الكمي للبروتوكول أدناه.

يتم عمل هذا التحليل الكمي للمواد PCR-تضخيم حسابيا، ويمثل عاملا مقيدا في مقايسة. وتشمل الضوابط المهمة وغيرها من الاعتبارات استخدام الأجسام المضادة نمط إسوي المطابقة، وكذلك تقييم لمنطقة سيطرة الحمض النووي الجيني، مثل المنطقة بين الجينات وتوقع ألا تكون ملزمة للبروتين قيد الدراسة (أو المتوقع لا لإظهار التغييرات تحت الظروف التجريبية). وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام منحنى القياسية للمواد المدخلات لكل عينة الشذرة لاستخلاص المستويات المطلقة للتخصيب في المواد التجريبية. استخدام منحنيات معيار يساعد على مراعاة الاختلافات بين مجموعات التمهيدي، بغض النظر عن كيفية بعناية أنها مصممة، وأيضا كفاءة تختلفences في جميع أنحاء مجموعة من تركيزات قالب لمجموعة التمهيدي واحد. بروتوكول لدينا يختلف عن غيرها من الجهات التي تتوفر 5-8 في أننا تغطية على نطاق واسع في مرحلة لاحقة، وتحليل.

Protocol

1. العزلة من الفأر CD4 السذاجة الطحال خلايا T

  1. تضحية الماوس بطريقة إنسانية متسقة مع رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية (IACUC) بروتوكولات الاستخدام. تشريح الطحال ووضعه في طبق بتري تحتوي على 10 مل من DMEM مع FBS 10٪.
  2. سحق الطحال باستخدام إنتهاء متجمد اثنين من الشرائح الزجاجية للافراج عن splenocytes. نقل تعليق الخلية في أنبوب 15 مل المخروطية.
  3. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة لجهاز للطرد المركزي السريرية مع قطر الدوار نموذجي) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. Resuspend الخلايا في 2 مل العازلة ACK إلى ليز خلايا الدم الحمراء، 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). وقف رد الفعل بإضافة 8 مل من DMEM مع FBS.
  5. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  6. resuspend الخلايا في 5 مل من DMEM تحتوي على FBS ويمر عبر 70 ميكرومتر شبكة مرشح دينار بحريني (فالكون، القط # 352350). عد الخلايا والمضي قدماإلى العزلة من CD4 السذاجة الخلايا التائية باستخدام CD4 العزلة مجموعة (Miltenyi، القط # 130-095-248) باستخدام إرشادات الشركة المصنعة. جمع السذاجة الخلايا التائية CD4 بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. resuspend الخلايا في 10 مل من DMEM مع FBS.

2. إعداد لونين

  1. إضافة 37٪ الفورمالديهايد إلى تركيز النهائي من 1٪ إلى تعليق خلية في DMEM والصخور بلطف في RT (على سبيل المثال باستخدام Nutator) لمدة 15 دقيقة لعبور الارتباط DNA: مجمعات البروتين.
  2. وقف يشابك بإضافة 1 M الجلايسين إلى تركيز النهائي من 125 ملم. مواصلة لموسيقى الروك لمدة 5 دقائق على RT.
  3. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. غسل الخلايا عن طريق إعادة التعليق في 5 مل من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني. غسل في الجليد الباردة PBS تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني مجموع 3 مرات، وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية.
  5. resuspend الخلايا في 1 ملالجليد الباردة العازلة تحلل الخلية التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني. احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة. كفاءة تحلل الخلايا يمكن تحديده عن طريق إعادة التعليق قسامة صغيرة من الخلايا في 0.4٪ محلول أزرق التريبان (سيغما، القط # T8154) ومراقبة مع المجهر.
  6. جمع نوى بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج (عادة ~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل بعناية طاف.
  7. Resuspend ونوى في 500 ميكرولتر من العازلة تحلل النووية التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني. احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة.
  8. يصوتن الخلايا باستخدام Sonicator Misonix 3،000، مسبار حجم 1.6 ملم: مستوى الناتج 4، 15 ثانية انفجر، 4 مرات على الجليد. يجب أن تبرد كل عينة على الجليد لمدة 1-2 دقيقة قبل sonicating مرة أخرى لمنع ارتفاع درجة حرارة العينات. ارتفاع درجة الحرارة يمكن أن يسبب انعكاس من الروابط الصليب.
  9. أجهزة الطرد المركزي لونين sonicated في 16،000 XG (~ 13،200 دورة في الدقيقة في microcentrifuge) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  10. تأخذ 20 قسامة ميكرولتر من supern واضحةatant، إضافة الحمض النووي صبغ التحميل والتحقق من الحمض النووي sonicated من قبل الكهربائي من خلال 2٪ agarose هلام (الحجم المثالي من الحمض النووي sonicated بالنسبة لمعظم التطبيقات هو 200-500 BP).
  11. تحديد تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية. لونين المنفصمة يمكن استخدامها على الفور لإعداد رد فعل مناعي لونين أو تخزينها في -80 درجة مئوية. عادة ما نحصل على 7.5-10 DNA ميكروغرام 2-3 × 10 6 CD4 تنقية خلايا T في الماوس.

3. لونين مناعي (يجب أن تتم جميع خطوات للخروج في 0-4 درجة مئوية)

  1. تمييع لونين sonicated إلى تركيز الحمض النووي ميكروغرام / مل 5-10 (إجمالي حجم = 1 مل) في المخزن تخفيف الشذرة مع مثبطات الأنزيم البروتيني.
  2. وفر 100 ميكرولتر (10٪) كإدخال. تخزين على الجليد.
  3. قسامة 450 ميكرولتر كل إلى قسمين 1.7 مل أنابيب microfuge وصفت بأنها سيطرة نمط إسوي (الماوس أو أرنب مفتش) والضد من الفائدة. إذا تم استخدام الأجسام المضادة متعددة من نفس نمط إسوي، وهي مقاولات نمط إسوي واحدرأ ستكون كافية لأداء هذا التحليل. وسوف تحتاج الضوابط نمط إسوي متعددة إذا تم استخدام الأجسام المضادة من مصدر حيوانية مختلفة أو نمط إسوي.
  4. إضافة 2-5 ميكروغرام من الأجسام المضادة المحددة، اعتمادا على خصوصية الأجسام المضادة المستخدمة، أو سيطرة نمط إسوي للأنابيب منها.
  5. موسيقى الروك في الأنابيب باستخدام Nutator بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية للسماح تشكيل المجمعات الكروماتين الأجسام المضادة.
  6. إضافة 25 ميكرولتر من بروتين G حبات المغناطيسي (01:01 الطين من الخرز مع وقف التنفيذ) إلى الخليط أعلاه وتسمح لموسيقى الروك لا يقل عن 2 ساعة في 4 درجات مئوية. حبات من بائع لدينا يمكن أن تستخدم مباشرة.
  7. وضع أنابيب microfuge على الوقوف المغناطيسي والسماح حبات لجمع على الجانب الممغنطة.
  8. بعناية إزالة حل عن طريق الشفط من دون إزعاج الخرز.
  9. إضافة 1 مل من منخفض الملح محلول الغسيل والسماح لموسيقى الروك بلطف لمدة 5 دقائق على nutator. جمع حبات باستخدام موقفا المغناطيسية وإزالة الحل يغسل. أكرر مرة.
  10. إضافة 1 مل من ارتفاع الملح محلول الغسيل والسماح لموسيقى الروك لمدة 5 دقائق على nutator. جمع حبات باستخدام الوقوف المغناطيسي وإزالة الحل يغسل. أكرر مرة.
  11. إضافة 1 مل من كلوريد الليثيوم حل غسل والسماح لموسيقى الروك لمدة 5 دقائق على nutator. جمع حبات باستخدام الوقوف المغناطيسي وإزالة الحل يغسل. أكرر مرة. استخدام LiCl يحسن إزالة فعالة للتفاعلات لونين غير محددة مع الخرز.
  12. إضافة 1 مل من محلول TE والسماح لموسيقى الروك لمدة 5 دقائق على nutator. جمع حبات باستخدام الوقوف المغناطيسي وإزالة الحل يغسل.
  13. أزل الحمض النووي من الخرز بإضافة 250 ميكرولتر من شطف العازلة. موسيقى الروك لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ماصة قبالة شطافة وحفظ هذه المواد في الجديدة 1.7 مل microfuge أنبوب. كرر مرة أخرى والجمع بين كل من elutions. تجاهل الخرز.
  14. على عكس الروابط عبر إضافة 5 M كلوريد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 0.3 M و 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز A (20 م ز / مل) على الحمض النووي مزال. إضافة 400 ميكرولتر من شطف العازلة إلى المدخلات المحفوظة في الخطوة 3.2، لجعل حجم 500 ميكرولتر. إلى المدخلات إضافة كلوريد الصوديوم إلى 0.3 M، 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز A، 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA، 20 ميكرولتر من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.5 و 1 ميكرولتر من بروتين K (20 ملغ / مل).
  15. احتضان الأنابيب بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية في كتلة التدفئة الجافة. لتجنب التبخر من العينات، ختم أو وضع الوزن على أنابيب لمنعهم من فتح. ويمكن أيضا فرن التهجين استخدامها.
  16. السماح للأنابيب بارد لRT. إضافة 1 مل الإيثانول بنسبة 100٪ واحتضان 2 ساعة بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية إلى الحمض النووي يعجل.
  17. أنابيب الطرد المركزي في 16،000 XG لمدة 15 دقيقة لتكوير الحمض النووي. غسل بيليه الحمض النووي مرة واحدة مع الايثانول 70٪ والهواء الجاف بيليه. Resuspend وبيليه الحمض النووي في 100 ميليلتر من الماء المقطر تعقيمها.
  18. تنقية الحمض النووي باستخدام الأعمدة تدور QiaQuick وأزل في حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر من شطف العازلة. هذا الحمض النووي جاهز للاستخدام لPCR.
"> 4. إعداد رد فعل PCR (يجب أن تتم جميع خطوات للخروج على الجليد)

  1. جمع كل عينات من الحمض النووي من الشذرة وما يقابلها من عينات الإدخال. أيضا، وجمع كل الكواشف PCR والاشعال للمنطقة المستهدفة وكذلك منطقة التحكم. استخدام "hotstart" طق البلمرة DNA. سوف نستخدم فحص SYBR القائم الأخضر لقياس تضخيم الحمض النووي في هذا الإجراء، ولكن QPCR مجموعات mastermix يمكن استخدامها إذا لزم الأمر.
  2. جعل التخفيف المتسلسل من الحمض النووي المدخلات لتوليد منحنى القياسية في التحليل QPCR: على سبيل المثال 10٪، 1٪ و 0.1٪ و 0.01٪ في شطف العازلة (من الأعمدة تدور QiaQuick في الخطوة 3.18). يمكن تركيز مجموعة ومقدار من هذا المعيار مجموعة قالب منحنى تختلف استنادا إلى المستويات المتوقعة من تخصيب رقاقة، الخ الاستغناء 10 ميكرولتر من عينات الحمض النووي الإدخال في الآبار كل من لوحة 96 جيدا (Genemate، القط # T-3182-1 )، في مكررة.
  3. الاستغناء عن 10 مل رقاقة الحمض النووي من سيطرة نمط إسوي وكذلك الأجسام المضادة المحددة في كل منهاآبار، في ثلاث نسخ.
  4. تقديم "مزيج الرئيسي" تحتوي إما الاشعال الهدف أو الاشعال التحكم (0.1 تركيز النهائي ميكرومتر لكل التمهيدي) والاستغناء 10 ميكرولتر في آبار منها. على سبيل المثال، في قالب أدناه الاستغناء ميكس ماجستير التي تحتوي على الاشعال المستهدفة في الآبار وضع علامة خضراء والاستغناء مزيج الرئيسي مع الاشعال التحكم في الآبار وضع علامة حمراء.
  5. تغطية لوحة PCR مع الضوئية البلاستيكية فيلم الختم وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج في جهاز للطرد المركزي السريرية (~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 1 دقيقة في RT لجمع كل شيء في أسفل البئر.
  6. بدء رد فعل PCR. وسوف نستخدم LightCycler 480 II (روش) التشغيل LightCycler 480SW 1.5 برنامج لتشغيل QPCR في هذا المثال.

ما قبل الحضانة: 1 دورة: 95 ° C / 5 دقائق.

التضخيم: 40-45 دورات: 94 ° C / 5 ثانية، 60 ° C / 5 ثانية، 72 ° C/10 ثانية (الصلب يجب أن تكون درجة حرارة 2-3 درجة مئوية أقل من درجة حرارة انصهار(ه) من الاشعال).

منحنى ذوبان: 1 دورة.

التبريد: 1 دورة.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 10٪ مساهمة 10٪ مساهمة نمط إسوي محدد
B 1٪ مساهمة 1٪ مساهمة نمط إسوي محدد
C 0.1٪ مساهمة 0.1٪ مساهمة نمط إسوي محدد
D 0.01٪ مساهمة 0.01٪ مساهمة
E 10٪ مساهمة 10٪ مساهمة نمط إسوي محدد
F 1٪ مساهمة 1٪ مساهمة نمط إسوي محدد
G 0.1٪ مساهمة 0.1٪ مساهمة نمط إسوي محدد
H 0.01٪ مساهمة 0.01٪ مساهمة

الأخضر: استخدام الاشعال المنطقة المستهدفة.

الأحمر: استخدام التحكم الاشعال المنطقة.

5. تحليل

  1. برنامج البرنامج QPCR لتقدير حجم الكمية المطلقة من الحمض النووي. الأهم من ذلك، استخدام منحنى القياسية لأقحم كميات الحمض النووي في عينات محددة ونمط إسوي غير معروف يسمح للتقييم ومطابقة لجودة وكفاءة جميع التمهيدي يضع أكثر من مجموعة من التركيزات التي وجدت في العينات. وعلاوة على ذلك، فإنه يوفر أيضا موره طريقة موثوقة لتحويل (C أو C ر ع) القيم الكلوروكوين إلى نتائج تخصيب أضعاف النسبية النهائي من الطرق usingΔΔCq وذات الصلة.
  2. الذهاب إلى المحرر عينة، وعلامة على الآبار التي تحتوي على عينات من مختلف المدخلات التخفيفات (10٪، 1٪ و 0.1٪ و 0.01٪) مع القيم منحنى مستواهم. أيضا تسمية الآبار مع رقاقة عينات غير معروفة، تماما كما وضعت لوحة PCR خارج. في البرامج المماثلة المستخدمة في آلات QPCR أخرى، تعين مجموعات فرعية المقابلة لردود الفعل لكل زوج التمهيدي، وقيمة منحنى القياسية والعينة الضابطة والتجريبية نمط إسوي وفقا لذلك.
  3. في البرنامج LightCycler، انتقل إلى المحرر فرعية، وعلامة على مجموعات فرعية بما في ذلك الآبار مع عينات المدخلات فضلا عن رقاقة عينات مجهولة. سيتم كميا عينات غير معروفة باستخدام منحنى القياسية الناتجة عن تركيزات معروفة من عينات لتحليل المدخلات. في البرامج المماثلة المستخدمة في آلات QPCR أخرى، المكلف مجموعات فرعية الموافقonding لجميع ردود الفعل لكل أزواج التمهيدي.
  4. بعد التضخيم PCR اكتمال إجراء التحليل مع "عبس Quant/2nd المشتقة ماكس" وحدد فرعية لتحليل واضغط على موافق. في البرامج المماثلة المستخدمة في آلات QPCR الأخرى، لتحويل قيمة الكلوروكوين لكمية الحمض النووي في كل مجموعة فرعية.
  5. اضغط على "حساب" والتي سوف تولد منحنى قياسي باستخدام تركيزات معروفة من عينات المدخلات وسيعرض الكمية المطلقة من الحاضرين الحمض النووي في العينات غير معروف.
  6. إذا كانت نوعية الحمض النووي المنفصمة جيدة، وإذا كان الاشعال تربط خصيصا إلى المنطقة المستهدفة، ينبغي أن تكون كفاءة PCR يقرب من 2.
  7. إجراء تحليل منحنى ذوبان مع "تيم داعيا" لنفس المجموعة الثانوية، إذا كانت متوفرة. ذروة واحدة تشير إلى أنه تم تضخيم منتج معين واحد فقط. ويمكن أيضا أن التضخيم من الحمض النووي محددة يتم اختبارها من قبل electrophoresing المنتج PCR جنبا إلى جنب مع سلم ال DNA من خلال هلام الاغاروز.
  8. تصدير البيانات في علامة تبويب-ملف نصي محدد، والتي يمكن فتحها في Microsoft Excel لمزيد من التحليل.
  9. باستخدام Microsoft Excel، تقسيم كمية الحمض النووي للالضد محددة مع سيطرة نمط إسوي لالاشعال المستهدفة. كرر هذه الخطوة لالاشعال منطقة التحكم. إذا تم استخدام الأجسام المضادة متعددة من نفس نمط إسوي لimmunoprecipitations مختلفة، وتطبيع كل من هذه مع القيم من سيطرة نمط إسوي نفسه. وعلاوة على ذلك، إذا تم استخدامه عدة أزواج التمهيدي المستهدفة، ويجب استخدام كميات الحمض النووي من التمهيدي تحكم واحد مجموعة الزوج لتطبيع كل هدف (الشكلان 1 و 2). تمثل القيم إخراج مناعي الأجسام المضادة المحددة تخصيب أضعاف في كل الموقع النسبي لغير محددة مناعي خلفية الأجسام المضادة.
  10. تقسيم تخصيب أضعاف (إلى نمط إسوي التحكم) لالاشعال المستهدفة مع تخصيب أضعاف (إلى نمط إسوي التحكم) من أجل السيطرة الاشعال المنطقة للحصول على تخصيب نسبة إلىمراقبة المنطقة غير منضم (الشكل 1). الأهم من ذلك، لاحظ أنه نظرا لجيل من المنحنيات القياسية مع مجموع DNA المدخلات لكل عينة، كل من القيم مناعي فوق محرف من منحنيات معيار يتم تطبيع بالفعل، والتعبير عنها، وجزء من المدخلات المشاركات بواسطة برنامج الجهاز.
  11. إذا كان التشدد في المخازن المؤقتة المستخدمة لمناعي أو غسل مرتفع جدا، فمن الممكن أن التضخيم قوية من عينات immunoprecipitated مع الأجسام المضادة المحددة سوف يلاحظ، في حين التضخيم من سيطرة نمط إسوي immunoprecipitated لن وحظ العينات. في مثل هذا السيناريو، فمن الأفضل أن طرح كمية من نمط إسوي رقاقة التحكم من الشذرة الأجسام المضادة المحددة لكل من المنطقة المستهدفة والمنطقة غير منضم. ويمكن حساب تخصيب النسبي بقسمة الفرق للمنطقة المستهدفة من قبل الفرق لمنطقة غير منضم (الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ومناعي لونين (رقاقة) بروتوكول المعروضة هنا ضوابط لالاختلافات، إن وجدت، في كمية من الحمض النووي المستخدمة في PCR من خلال استخدام زوج التمهيدي أن يضخم منطقة غير منضم من الجينوم، وبالتالي بمثابة "مراقبة التحميل". في المثال هو موضح في الشكل (3)، وقد استخدمنا المنطقة الترميز من الفأرة Actb الجينات باعتبارها غير منضم المنطقة إلى البروتين لدينا من الفائدة وعامل موقع NFAT النسخ ملزم على الماوس IL2 المروج والمنطقة المستهدفة. بدلا من ذلك، المنطقة عدة kilobases المنبع أو المصب من المنطقة المستهدفة معروفة لديهم اي ملزم من البروتين من الفائدة ويمكن اختيار لهذا الغرض. عند تصميم زوج التمهيدي للمنطقة المستهدفة، والحجم الأمثل من الناتج PCR ما يقرب من 100-200 سنة مضت. ومن المهم أيضا للتحقق حسابيا أن هذه الاشعال لا تلزم أي مكان آخر في الجينوم.

تخصيب النسبية للبروتين منضمة إلى فرقويمكن مقارنة مناطق erent من الجينوم إذا يتم اختيار نفس مجموعة مراقبة نمط إسوي والاجسام المضادة المحددة. سوف تخصيب للبروتينات مختلفة على نفس المنطقة المستهدفة تعتمد على خصوصية وتقارب من الأجسام المضادة المستخدمة وكذلك كمية من البروتين محددة ملزمة الحمض النووي. على سبيل المثال، سوف تخصيب النسبي في حالة من رقائق يؤديها لhistones العودة عادة قيمة تخصيب أعلى بالمقارنة مع عامل النسخ التي قد ربط الحمض النووي ردا على الإشارات الخلوية المختلفة. إذا كانت خصوصية من الأجسام المضادة هو جيد، ونحن عادة ما نلاحظ 2-10 تخصيب أضعاف على المنطقة تحكم غير منضم (الشكلان 3 و 4).

الشكل 1
الشكل 1. تخطيط التجريبية التي تصف العمليات الحسابية للحصول على تعصبيستخدم إيف إثراء رقاقة ل الأجسام المضادة المحددة في الموقع المستهدف. الكمي PCR للحصول على كميات الحمض النووي في العينات الشذرة immunoprecipitated باستخدام الأجسام المضادة المحددة ومراقبة نمط إسوي لها. يتم تنفيذ الكمي PCR باستخدام بادئات تمتد تسلسل الهدف والمنطقة تحكم غير منضم من الجينوم. لكل عينة الشذرة، يتم تنفيذ PCR في ثلاث نسخ، وأشارت والتقنية مكررات A و B و C، ويتم احتساب تخصيب النسبية لكل تكرار كما هو موضح في البروتوكول. يتم تنفيذ العمليات الحسابية لمتوسط ​​الناتج القيم الفنية. يمكن أيضا تحليل التباين في هذه الخطوة، وبشكل مثالي ينبغي أن تكون منخفضة. الحسابات خطأ فني لكن ليست مدرجة في الصيغة النهائية لحساب الخطأ بين البيولوجية مكررات. بدلا من ذلك، الاختلاف البيولوجي المقاسة نفسها أيضا تحتوي في داخلها اختلاف التقنية. مكررات ثلاثة التجريبية (في المربعات الملونة الأصفر والأخضر والبنفسجي) وتستخدم في التجربة الشذرة للحصول على AV erage إشارة الشذرة وانحرافها المعياري (SD). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. طريقة بديلة لحساب تخصيب الشذرة. وفي الحالات التي تكون فيها كمية من الحمض النووي immunoprecipitated من الأجسام المضادة نمط إسوي هو amplication منخفضة للغاية وQPCR والفقراء، وهذه الكمية من الحمض النووي يمكن أن تطرح من كمية الحمض النووي immunoprecipitated باستخدام الأجسام المضادة المحددة للحصول على أضعاف تخصيب لكل تكرار التقنية. يجب أن تستخدم هذه الطريقة من الحساب في جميع التجريبية ثلاثة مكررات للحصول على متوسط ​​إشارة الشذرة والانحراف المعياري لها (SD)، كما هو موضح في الشكل رقم 1.

EP-together.within الصفحات = "دائما"> الشكل (3)
الشكل (3). لقطة من جدول بيانات Microsoft Excel تظهر الحسابات للحصول على تخصيب النسبية. البيانات من ثلاثة يكرر التجريبية (في المربعات الملونة الأصفر والأخضر والبنفسجي) مع ثلاثة التقنية مكررات كل كان يستخدم لحساب تخصيب أضعاف. وصفت استخدام بروتوكول الحساب المبين في الشكل رقم 1 في جدول البيانات هذا. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 4
الشكل 4. تخصيب النسبية للعامل النسخ NFAT في IL2المروج. تم عزل خلايا CD4 T التقليدية الخلايا (TCON) والتنظيمية CD4 T خلايا (Tregs) من الفئران Foxp3EGFP. وحفز جزء صغير من الخلايا TCON مع سلطة النقد الفلسطينية وIonomycin لمدة 30 دقيقة. تم تنفيذ الشذرة كما هو موضح في بروتوكول تجريبي. البيانات المقدمة هنا هي من ثلاثة يكرر تجريبية مع ثلاثة مكررات الفنية لكل منهما. ويصور تخصيب النسبية للعوامل النسخ NFATc1 وNFATc2 على الماوس IL2 المروج في هذين النوعين من الخلايا كما تخصيب أضعاف خلال منطقة غير منضم 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وينص البروتوكول أعلاه وسيلة قوية من قياس بدقة تخصيب DNA من الخلايا الليمفاوية الأولية باستخدام رقاقة. وأحد الأسباب الرئيسية لمتانة في هذا البروتوكول هو إدراج البيولوجية مكررات. يستخدم بروتوكول أعلاه ثلاث مكررات، إثراء للوالذي يحسب بشكل مستقل. ثم يتم حساب متوسط ​​مخرجات لتوفير درجة من تخصيب اليورانيوم والانحرافات المعيارية محسوبة لتوفير قدر من التباين. لكل عينة، ثلاثة التقنية مكررات تجرى أيضا للقضاء على التباين في التعامل مع العينة، PCR التضخيم، وما إلى ذلك كمية من التباين في تكرار التقنية هو أقل بكثير عادة من تلك التي لوحظت بين العينات البيولوجية المختلفة. والسبب الثاني لقوة هو إدراج الضوابط الفنية متعددة، بما في ذلك الأجسام المضادة نمط إسوي المطابقة السيطرة، واستخدام منحنى DNA الإدخال القياسي، واستخدام AMPLICON التحكم المقابلة لمنطقة الجيني غير محددة.

= "jove_content"> القيود من الأسلوب أعلاه هي مماثلة لتلك التي واجهتها عموما باستخدام رقاقة. الأسلوب يعاني من ضعف بعض الشيء القرار المكانية، العامل المحدد كونها القص من شظايا الحمض النووي عن طريق صوتنة. ولذلك، فإن حل السلطة من الأسلوب هو فقط ما يقرب من 500 شركة بريتيش بتروليوم من الحمض النووي. يمكن أن التجارب التي تتطلب دقة أعلى الاستفادة من micrococcal نوكلياز الهضم 8، أو الهضم نوكلياز خارجية من شظايا استردادها (رقاقة EXO) 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، الاستعدادات الشذرة المذكورة أعلاه بالإضافة إلى التسلسل عالية الإنتاجية من شظايا استردادها (ChIPseq، ورقاقة وما يليها أو الشذرة وما يليها) 11،12 في مكان QPCR، وتنتج عينات من شظايا اليورانيوم المنفصمة بشكل مختلف، وتقاطع والتي قد تكون تؤخذ على أنها موقع حسن النية من التفاعل. ومع ذلك، فإن الطريقة المعروضة هنا يوفر وسيلة قوية من بعناية ودقة قياس جمعية الحمض النووي مع عوامل النسخ، مكونات جسيم نووي، وزارة الدفاعhistones ified وبروتينات أخرى في مواقع محددة من الفائدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح CA141009 وGM39067. نشكر E. بارنيل وR. Yarrington للتعليق على الجزء المكتوب.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formaldehyde Sigma F-8775 Store at RT
Phosphate Buffered Saline Hyclone SH30256.01 Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets Roche 04693116001 Store at 4 °C
Protein G magnetic beads Active Motif 101945 Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml) EMD Millipore 556746 Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml) Roche 03115879001 Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase Invitrogen 10966-034 Store at -20 °C
SYBR Green I Invitrogen S7567 Store at -20 °C
1 M Glycine Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40) Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS) Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl) Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl) Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl) Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0) Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA) Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3) Prepare fresh
5 M NaCl Store at RT
0.5 M EDTA Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5 Store at RT
Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator Becton Dickinson Model: 421105
Magnetic Stand Promega Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Masonix Sonicator 3000 QSonica Model: S3000
UV Spectrophotometer NanoDrop Technologies ND-1000
Heating Block VWR 13259-030
Rotator VWR 80085-692
Refrigerated bench top centrifuge Beckman Coulter Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge Eppendorf 5415 D
Table of Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).
  2. Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 37-47 (2002).
  3. Li, Q., et al. Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity. J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).
  4. Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states. The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).
  5. Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).
  6. Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. Genome-wide localization of replication factors. Methods. 57, 187-195 (2012).
  7. O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).
  8. Sikes, M. L., et al. A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation. Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
  10. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
  11. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
  12. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4, 651-657 (2007).

Tags

علم الأحياء الجزيئية، العدد 75، علم الوراثة، علم الأحياء الخلوي، الهندسة الطبية الحيوية، علم الأحياء الدقيقة، علم المناعة والكيمياء الحيوية، والبروتينات، وعلوم الحياة، والنماذج الحيوانية، لونين مناعي، ورقاقة، لونين، مناعي، تنظيم الجينات، تي اللمفاويات، عامل النسخ، لونين التعديل، DNA ، الكمي PCR، PCR، والخلايا، والعزلة، نموذج حيواني
مناعي لونين كفاءة استخدام كميات محدودة من الكتلة الحيوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tantin, D., Voth, W. P., Shakya, A.… More

Tantin, D., Voth, W. P., Shakya, A. Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass. J. Vis. Exp. (75), e50064, doi:10.3791/50064 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter