Summary

Efficiente immunoprecipitazione della cromatina utilizzando Limitare quantità di biomassa

Published: May 01, 2013
doi:

Summary

Descriviamo un metodo robusto per immunoprecipitazione della cromatina utilizzando cellule T primarie. Il metodo si basa su approcci standard, ma utilizza uno specifico insieme di condizioni e reagenti che migliorano l'efficienza per una limitata quantità di cellule. Importante, una descrizione dettagliata della fase di analisi dei dati è presentato.

Abstract

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un metodo ampiamente utilizzato per determinare le interazioni delle diverse proteine ​​con il DNA in cromatina delle cellule viventi. Gli esempi includono sequenza-specifici di DNA binding fattori di trascrizione, istoni ed i loro diversi stati di modifica, enzimi come la RNA polimerasi e fattori accessori e componenti di riparazione del DNA. Nonostante la sua ubiquità, vi è una mancanza di up-to-date, metodologie dettagliate per entrambi preparazione banco di materiale e per l'analisi accurata permettendo metriche quantitative di interazione. A causa di questa mancanza di informazioni, e anche perché, come ogni immunoprecipitazione, le condizioni devono essere ri-ottimizzato per una nuova serie di condizioni sperimentali, il saggio di ChIP è suscettibile di risultati inesatti o mal quantitativa.

Il nostro protocollo deriva in ultima analisi dal lavoro seminale sul fattore di trascrizione: interazioni DNA 1,2, ma incorpora una serie di miglioramenti per sensibività e riproducibilità per difficili da ottenere i tipi di cellule. Il protocollo è stato usato con successo 3,4, sia utilizzando qPCR per quantificare arricchimento DNA, oppure utilizzando una variante semi-quantitativa del sottostante protocollo.

Questa analisi quantitativa di materiale amplificato per PCR viene eseguita computazionalmente, e rappresenta un fattore limitante nel saggio. Controlli importanti e altre considerazioni includono l'uso di un anticorpo isotipo-abbinato, così come la valutazione di una regione di controllo del DNA genomico, come ad esempio una regione intergenica predetto di non essere vincolata dalla proteina in studio (o anticipato di non mostrare i cambiamenti in le condizioni sperimentali). Inoltre, una curva standard di materiali di input per ogni campione ChIP è usato per derivare i livelli assoluti di arricchimento nel materiale sperimentale. Utilizzo di curve standard aiuta a tenere conto delle differenze tra le serie di primer, indipendentemente da come sono progettati con cura, e anche l'efficienza differirerenze in tutto il range di concentrazioni modello per un singolo set primer. Il nostro protocollo è diverso dagli altri che sono disponibili in 5-8 che coprono estensivamente la, fase successiva analisi.

Protocol

1. Isolamento del mouse CD4 naïve splenica cellule T Sacrifica il mouse in maniera umana coerente con Institutional Animal Care e utilizzo Comitato protocolli (IACUC). Sezionare la milza e posizionarlo nella capsula di Petri contenente 10 ml di DMEM con 10% FBS. Schiacciare la milza con estremità glassati di due vetrini per liberare le splenociti. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 xg (~ 1.200 rpm per una centrifuga c…

Representative Results

L'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) protocollo presentato qui i controlli per le differenze, se del caso, nella quantità di DNA utilizzati in PCR mediante l'utilizzo di una coppia di primer che amplifica una regione legata di genoma, quindi servire come un "controllo del carico". Nell'esempio illustrato nella figura 3, abbiamo utilizzato la regione codificante del gene ACTB topo come una regione non legato alla nostra proteina di interesse e del sito di legame N…

Discussion

Il protocollo di cui sopra fornisce un metodo robusto di quantificare con precisione l'arricchimento del DNA da linfociti primari che utilizzano chip. Un importante motivo per la robustezza in questo protocollo è l'inserimento di biologico replica. Il protocollo precedente utilizza tre repliche, l'arricchimento per il quale viene calcolato in modo indipendente. Le uscite vengono quindi mediati per fornire un grado di arricchimento e deviazioni standard calcolate per fornire una misura della variabilità. Pe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH CA141009 e GM39067. Ringraziamo E. Parnell e R. Yarrington per i commenti sulla parte scritta.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Formaldehyde Sigma F-8775 Store at RT
Phosphate Buffered Saline Hyclone SH30256.01 Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets Roche 04693116001 Store at 4 °C
Protein G magnetic beads Active Motif 101945 Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml) EMD Millipore 556746 Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml) Roche 03115879001 Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase Invitrogen 10966-034 Store at -20 °C
SYBR Green I Invitrogen S7567 Store at -20 °C
1 M Glycine Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40) Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS) Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl) Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl) Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl) Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0) Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA) Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3) Prepare fresh
5 M NaCl Store at RT
0.5 M EDTA Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5 Store at RT
Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator Becton Dickinson Model: 421105
Magnetic Stand Promega Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Masonix Sonicator 3000 QSonica Model: S3000
UV Spectrophotometer NanoDrop Technologies ND-1000
Heating Block VWR 13259-030
Rotator VWR 80085-692
Refrigerated bench top centrifuge Beckman Coulter Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge Eppendorf 5415 D
Table of Equipment

References

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Cite This Article
Tantin, D., Voth, W. P., Shakya, A. Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass. J. Vis. Exp. (75), e50064, doi:10.3791/50064 (2013).

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