Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Измерение продолжительности жизни в doi: 10.3791/50068 Published: January 7, 2013

Summary

Дрозофилы является мощным организмом модель для изучения молекулярных основ долголетия регулирования. Этот протокол будет обсудить этапы создания воспроизводимых населения на основе измерения продолжительности жизни, а также потенциальные подводные камни и как их избежать.

Abstract

Старение представляет собой явление, которое приводит к ухудшению устойчивые физиологические почти во всех организмах, в котором она была рассмотрена, приводит к снижению физической работоспособности и повышение риска заболевания. Индивидуальные старения проявляются на популяционном уровне как увеличение возрастной смертности, которая часто измеряется в лаборатории наблюдений продолжительность жизни в большой когорты соответствующего возраста лиц. Эксперименты, направленные на количественную оценку степени, в которой генетических или экологических манипуляций влияние продолжительности жизни в простых модельных организмов был весьма успешным для понимания аспектов старения, которые сохраняются на таксонов и вдохновляющие новые стратегии для продления срока службы и предотвращения связанных с возрастом заболевания у млекопитающих .

Уксус мухи, дрозофилы, является привлекательным организма моделью для изучения механизмов старения благодаря своей относительно короткой продолжительности жизни, удобные животноводство, генетика и поверхностным.Тем не менее, меры демографической старения, в том числе возраст-специфическая выживаемость и смертность, чрезвычайно восприимчивы к даже незначительные изменения в опытно-конструкторских и окружающей среды, а также поддержание строгой лабораторной практике для продолжительности старения эксперименты не требуется. Эти соображения, а также необходимость заниматься тщательным контролем генетического фона, необходимые для создания надежных измерений. Действительно, есть много известных споров вокруг вывода из долголетие экспериментов дрожжей, червей, мух и мышей, которые были прослежены окружающей среды или генетическими артефакты 1-4. В этом протоколе, мы описываем набор процедур, которые были оптимизированы на протяжении многих лет измерения продолжительности жизни дрозофилы с использованием лабораторных флаконах. Мы также описываем использование программного обеспечения dLife, которая была разработана нашей лаборатории и доступен для загрузки ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / программное обеспечение). dLife ускоряет пропускную способность и способствует хорошей практики путем включения в оптимальном опытно-конструкторских, что упрощает обработку лету и сбора данных, стандартизация и анализ данных. Мы также обсудим много потенциальных ловушек в области проектирования, сбора и интерпретации данных, продолжительность жизни, и мы предпримем шаги, чтобы избежать этих опасностей.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Мы рекомендуем хранить экспериментальные продукты, дрожжи пасту, и виноградные агаром, которые появляются в протоколе при 4 ° С и использовании их в течение 1-2 месяцев, пока плесень и сухости не установлен дюйма, стандартное экологические условия как для личинок и взрослых этап включает поддержание мух в термостате при 25 ° C с 12:12 часов света темными цикла и относительной влажности 60%.

1. Подготовка экспериментального питания

  1. Для роста личинок, мы используем модифицированный Caltech Средний 5, которое является сокращенным в этом протоколе, как КТ.
  2. Мы рекомендуем диету для взрослых Drosophila (SY), который состоит из сахара (сахарозы) и дрожжей (дрожжи лиофилизированный все пивные) в 2% агара база, которая была варят с добавлением антибиотиков и противогрибковых агентов, и распространяться (10 мл на флакон) 6. Питание должно быть позволено укрепить и испаряются в течение 12-24 ч перед хранением. Потому что питательная среда может существенносущественно влияние долголетие, согласованность процессов приготовления необходимо как внутри, так и эксперимент для сравнения экспериментов.
  3. Если фармакологического агента должна быть добавлена ​​к взрослой пище, этот препарат может быть смешан в небольшую партию продовольствия и слоистые (2 мл) на еду поверхности, с контролем флаконы получения слоев, содержащих транспортного средства.

2. Подготовка Онлайн-Paste дрожжей

Комбинат 5-6 мл воды с 3 г активных сухих дрожжей и хорошо перемешать. Консистенция пасты дрожжей должно быть, что гладкого арахисового масла.

3. Подготовка винограда пластины агара

  1. Добавить пакет винограда премикс агара в 500 мл дистиллированной воды в 1000 мл колбу и следуйте инструкциям на пакете, чтобы растворить смесь виноградного агар.
  2. Аккуратно залить толстым слоем смеси в 100 мм чашки Петри, избегая образования пузырьков. Один пакет премикс производит около 14 грапластины PE агар.
  3. Пусть СМИ остыть и затвердеть при комнатной температуре с крышкой на 15 мин. Плиты можно хранить при температуре 4 ° C, завернутые в полиэтиленовую пленку или использовать немедленно.

4. Коллекция синхронному яйца

Все средства массовой информации, используемые в настоящем протоколе, т.е. дрожжи, виноградные агаром, КТ и 10% SY пищу, должна быть комнатной температуры.

  1. Нанесите 2-3 см в диаметре слой пасты на дрожжах винограда пластины агара и отложите в сторону.
  2. Поместите большой клетке сбор яиц на CO 2 площадки с сеткой стороной вниз, чтобы обезболить мух. На основе азота анестезия является альтернативой CO 2, используемые некоторыми лабораториями, которые могут производить высококачественные результаты 7.
  3. С помощью воронки, передавать 150-200 пар мух в клетку сбор яиц.
  4. Поместите виноград пластины агара, чтобы покрыть открытый конец клетки и закрепить крышку.
  5. Положите в клетку на его стороне, пока мухи просыпаются.Тогда, держать в клетке, виноград стороне пластины агара вниз, в инкубаторе в течение ночи.
  6. На следующий день, замените винограда пластина с новой дрожжевого винограда пластины. Только положить около 1 см в диаметре дрожжей пасты на поверхность пластины. Откажитесь от 1-го дня винограда пластины.
  7. Разрешить эмбрионов собрать на поверхности винограда пластины агара для 16-22 час. После этого, сбор винограда пластины агара и отказаться от родителя мух.
  8. Вымойте поверхность виноградного агаром с 1x фосфатным буферным раствором (PBS). Яйца могут быть мобилизованы, мягко очищая с помощью ватного тампона. Будьте осторожны, не царапины, повреждения или соскоблить тонкие кусочки агара с поверхности пластины. С помощью воронки, залить промытые яйца в 15 мл коническую трубку.
  9. Пусть яйца оседают на дно пробирки и слейте супернатант, стараясь не потерять ни яиц. Оставшийся объем должен быть около 2-3 мл.
  10. Добавить 8-10 мл PBS в трубку и повторите шаг 2-3 море раз тщательно мыть яйца, пока супернатант ясно. Как избавиться от остаточных дрожжей является ключевым в этом шаге.
  11. После стирки, слить всю оставшуюся супернатанта до объема 2 мл. Алиготе 32 мкл яиц в бутылки КТ с использованием широкого отверстия пипетки. Яйца в кончике пипетки должны быть компактными, с немного ни к жидким придыханием. Это может быть достигнуто путем введения пипетки в глубь яйца урегулирования и быстро отпустив поршень для аспирации.
  12. Место семенами CT сосуды в инкубаторе на протяжении развития лету.

5. Коллекция соответствующего возраста взрослых мух

  1. Взрослые, как правило, eclose с 9 дня вперед. Откажитесь от мух, которые появились в первый день и место бутылки обратно в ночь инкубатора. Такая практика позволит избежать случайного отбора для ранней полупогруженными и позволяет для сбора максимального количества синхронизированы мух.
  2. 16-22 час позже, передает дневных взрослых мух Int• 10% бутылок SY пищи. Если необходимо, еще одну партию могут быть собраны на следующий день.
  3. Вернуться летит обратно в инкубатор и позволяют мухи достигают половой зрелости и спариваются в течение двух дней. Запишите день передачи до 10% SY бутылки, как в первый день взрослой жизни.

6. Сортировка мух и настройка долголетия эксперимент

  1. Anesthetize небольших групп мух на площадку анестезии, затем отсортировать самцов и самок на две группы, используя кисть. При использовании CO 2, очень важно, чтобы свести к минимуму воздействие для предотвращения возможного длительного вопросов здравоохранения, которые могут нарушить целостность долголетия эксперимент.
  2. Место 30 мух того же пола в отдельных флаконах. При отсутствии балансировки хромосом в популяции и здорового потомства, каждая бутылка должна производить около 3-4 флаконов каждого пола. Аликвоты и мух в отдельных флаконах займет не более 3-4 минут, так что, в общем, мухи только подвергается анестезии в течение максимум9-10 мин.
  3. Повторите шаги 6.1-6.2, пока есть 8-10 флакона повторяет для каждого пола и экспериментального лечения.

7. Настройка таблиц Excel для отслеживания долголетия эксперимент

  1. Мы рекомендуем случайной флаконе позиции, а не группировки флаконов экспериментальные условия для того, чтобы избежать предвзятости, связанных с флаконе место в инкубаторе и, чтобы скрыть флаконе личности экспериментатора. Чтобы сделать это, сначала назначить рандомизированных численный идентификатор для каждого флакона в программе электронных таблиц, а затем организовать флаконов в лотках по номеру. Если вы используете управление dLife эксперимента программное обеспечение, следуйте учебник по эксперименте установку для получения идентификационного номера для каждого флакона.
  2. (Необязательно) Если вы используете читателя RFID считыватель штрих-кода или в связи с dLife, прикрепить RFID или штрих-кода тег для каждого флакона и связать тег с числовым ID флакон в dLife. Программа распознает каждого флакона при сканировании с читателеми направляют один для записи данных в нужном месте в таблице. Использование тега читателя в сочетании с dLife значительно уменьшает данные о времени сбора и регистрации ошибок.

8. Поддержание долголетия эксперимент

Флаконах, содержащих свежие продукты должны быть комнатной температуры для каждой передачи.

  1. Во время экспериментального периода, передача мухи на новые флаконы, содержащие свежие продукты каждые 2 дня (молодые женщины), или 3 раза в неделю (мужчин или женщин> 3-недельного возраста). Этот шаг будет гарантировать, что кормление условий для молодых женщин не нарушается присутствием личинок. Эта передача должна быть завершена без анестезии, которая может вызвать острую смертность, особенно у пожилых мух (Pletcher, личных наблюдений).
  2. В каждом флаконе передачи, записывать возраст, кол-во мертвых мух в старом флаконе, и мертвых мух, которые проводятся в новый флакон. Запишите эту информацию отдельно вдва столбца в таблице (либо dLife или ваши собственные электронные таблицы). Это гарантирует, что проведенные мухи не учтены дважды. Общее число погибших (умерших + осуществляться) должны, по крайней мере, равным количеству перевезенных мух от предыдущей передачи. Вычитание числа ранее осуществлялась мух от общего числа смертей, чтобы определить количество новых смертей.
  3. Муха считается правой цензуре, если он покинул эксперимент до естественной смерти через побега или смерти от несчастного случая. Животные выходе из эксперимента, таким образом, должны быть введены в отдельной колонке в тот день, летом вышел из эксперимента. Цензура мухи не регистрируются как мертвых (см. ниже).
  4. Продолжайте повторять шаги 8.1-8.2 до последнего выжившего мертв. Помните, что, как возраст мухи, некоторые мухи может лежать на спине и появляются мертвые из-за их бездеятельность. Поэтому при подсчете осуществляется (мертвые) мухи, нажмите на стороне флакона, чтобы определить, есть ли движения ног. Если это так, Фесэлектронной мух еще живы. В случае, когда мухи застревают в пищу в старом флаконе, но живы, они не должны считаться мертвыми и должна быть спасена дальнейшее прослушивание флакон, чтобы выбить лету. Цензура в таких мух следует использовать с осторожностью, так как это может привести к экспериментальным уклоном.

9. Анализ данных

  1. Выживаемости кривая показывает вероятность того, что отдельные доживает до определенного возраста и, как правило, рассчитывается на основе Kaplan-Meier подхода (рис. 1) 8. В отсутствие правой цензуре данных, формула может быть упрощена так, что возрастные выживаемость в возрасте х (S х) определяется путем деления числа людей живыми в начале переписи временем в возрасте х (N х) от общего количества мух в эксперименте (N 0), S = N х х / N 0. 9,2) кривые выживаемости являются наиболее распространенной формой представления данных, и онимогут быть проверены на равенство между группами с использованием лог-рангового критерия. Разумный вывод можно сделать из всего лишь 50-100 особей в когорте. Выживаемость является кумулятивным мера, однако, и поэтому смерть, не связанных со старением, таких, как в раннем возрасте, приведет к снижению выживаемости на протяжении всей жизни делает его трудно определить конкретный эффект старения.
  2. Второй метод визуализации данных является возрастной смертности функция, которая отображает риск смерти по каждой возрастной интервал и представляет собой более тонкий описания данных о выживаемости 9,10. Смертность меры являются независимыми от одной эпохи к другой, и форма кривой смертности полезен для вывода о динамике старения, особенно когда лечение корректируется в течение взрослой жизни. Оценки возрастной смертности, однако, не хватает как точность и аккуратность с небольшим размером выборки, и часто требуют нескольких до многих сотен людей в когорту для надежного эс-timate 11.
  3. Другие методы оценки долговечности различия включают в себя параметрические (например, Гомпертца) и полу-параметрическим (например регрессии Кокса) моделей. Эти модели могут быть мощным, но следует применять с осторожностью из-за предположений о форме кривых смертности и характер эффектов лечения, которые могли бы привести к неправильным выводом 11,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Упрощенная схема протокола представлена ​​на рисунке 1, где ключевые шаги описаны. Синхронизация части протокола могут быть использованы для различных анализов, которые требуют соответствующего возраста мух взрослых.

Типичные кривые выживаемости дикого типа мухи показано на рисунке 2а, используя управление dLife эксперимент программного обеспечения (рис. 2, б). Взрослые самцы обычно живут короче, с обеих популяций достижения средней и средней продолжительности жизни> 50 дней на 10% пищу SY при 25 ° C. Обратите внимание, что выживаемость остается высокой в ​​начале эксперимента, а затем снижается в геометрической прогрессии.

Drosophila продолжительность жизни зависит от условий окружающей среды, таких как температура и диеты. Рис. 3а показывает, что взрослые самцы обычно живут значительно короче, поскольку при повышении температуры. Кроме того, влияние диеты на продолжительность жизни представлена ​​на рисунке 3b

Плотность когорт в процессе развития могут влиять на продолжительность жизни взрослых и изменять сроки развития. Здесь мы покажем пример того, как разные плотности синхронизированных яйца влияют на развитие личинок. Как показано на рисунке 4, выход взрослой мухи плохо, и еда поверхность восприимчива к сушке, когда число яиц является слишком низкой. На другом конце спектра, развитие личинок задерживается в переполненном бутылки, и выход из взрослых мух снижается.

Кривая выживаемости в когорте в целом может быть значительно повлияли на аномальные эффекты флакона, как показано на рисунке 5. Нерегулярные данные выживания для отдельных флаконах может иметь несколько причин, таких как плохое качество пищи или бактериальной / грибковой инфекции и накопления. Хотя такая аномальная смертность вкосых мера выживания населения, есть не простая метрика для надлежащего определения того, что флакон должны быть исключены из эксперимента. Эти ситуации Поэтому лучше избегать хорошей практики обработки и устранить с помощью большого размера выборки.

На рисунке 6 показаны примеры флаконе условия, которые могут привести к аномальному смерти. В общем, любое состояние, которое может привести к небольшой трещине, где мухи может застрять и умереть следует избегать. Примеры включают в себя: пузыри в пищу, сухость в пищу, что приводит к сокращению от флакона стены, и трещины в пищевой показаны на рисунке 5а (мягкий пример с одного пузыря), 5б, 5в и рис, соответственно, . Чрезмерно сухой корм, как показано на рисунке 5б и 5в Рисунок должен быть тщательно перевернулся во время передачи, так как пища может выбить и свернуть на мух в пEW флаконе. Рост бактерий на поверхности пищи может привести к заражению или физический захват и, следовательно, может увеличить смертность. Некоторые бактерии на поверхности пищи появляются прозрачные и блестящие, как будто есть пот с пищей (не показано), в то время как другие виды бактерий, проявятся в виде белых колоний (рис. 5г). Флаконы выставке любое из этих условий следует отметить и далее считается, когда данные интерпретируются. В общем, мы подчеркиваем, что особое внимание на животноводство как в личиночной и взрослой стадиях может поддерживать долголетие и здоровье взрослых мух и уменьшить возникновение проблем, ведущих к неоднозначным причин смерти в дальнейшей жизни.

Рисунок 1
Рисунок 1. Упрощенная схема анализа Drosophila жизни.

"Рисунок Рисунок 2. (A) представитель жизни кривые W 1118 женщин-контроль (кружки) и мужской (квадраты) взрослых мух при 25 ° C на SY10% пищи. (B, C) Представительство скриншоты dLife программного обеспечения.

Рисунок 3
Рисунок 3. Влияние температуры (A) и диета (B) на взрослых продолжительность жизни. А. взрослых контроля (Canton S) самцов мух были сохранены до зрелого возраста при 18 ° C, 25 ° C или 29 ° CB взрослых контроля (W 1118) женский мухи подвергались либо 15% SY или 5% SY диеты.

Рисунок 4
Рисунок 4. 9 день развития (при 25 ° C), синхронизированных яйца, аликвоты в бутылки CT пищи. Volume эмбриона содержащего аликвоту, как показано ниже каждой бутылки.

Рисунок 5
Рисунок 5. Представитель участка из dLife программное обеспечение выживаемости показывает на флакон. Стрелка указывает одном флаконе аномальной внутри группы.

Рисунок 6
Рисунок 6. Примеры оптимального качества продуктов питания. А. пузырьков на поверхности пищи. В. Продовольственная сократилось расстояние от края флакона. С. Трещины в пищу. D. Бактерии накоплению на поверхности пищи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протокол, представленные здесь описывается способ получения воспроизводимых результатов измерений взрослого долголетия у дрозофилы, которая приспособлена для оценки генетических, фармакологических и экологических мероприятий. Crucial аспектов протокола включает тщательно контролируя личиночной среды разработки, сводя к минимуму взрослых стресс, и минимизации смещения через экспериментальных групп и элементов управления. Мы представляем также использование опыта dLife программного обеспечения для управления продолжительностью жизни. Просто подключая штрих-кода или RFID тег для каждого флакона, программа dLife будет оказывать помощь в получение данных для каждого измерения и построения кривой выживаемости. В то время как в настоящее время наиболее подходящим для исследования лету срок службы использовании флакона, этот инструмент управления экспериментом может быть легко адаптирован для использования в других организмах, с различными типами камер населения, или для дополнительных мерах выживания, в том числе стрессоустойчивость и токсичности препарата.

PРИОР началом любого долголетия оценку, нужно сначала тщательно контролировать производство родительских запасов. Генетическая изменчивость является важным фактором, так как это здоровье родительских штаммов. Эти факторы привели к значительному общественные противоречия, связанные с ранних исследованиях сообщалось, что предполагаемый регуляторами продолжительности жизни 13. Исследователь имеет несколько вариантов, чтобы минимизировать последствия связаны с изменчивостью генетического фона. Для генетических манипуляций, все генетически модифицированные штаммы должны быть фон контролируется либо через возвратное скрещивание с контрольным штаммом (по крайней мере 6 раз) или с помощью индуцибельной системы (например, чувствительных к температуре аллелей или наркотиками индуцибельной экспрессии трансгенов). GeneSwitch и Тет-систем 14,15 популярны и позволяет прямое сравнение мух с тем же генетическим фоном, в котором трансген либо вызваны или не индуцируется. Для всех индуцибельной системы, соответствующей одновременные контроль необходим, чтобы избежать confouNDS связаны с индуктором. Неспособность контролировать генетический фон почти всегда приводит к гибридной силы, которая может продлить продолжительность жизни в F1 поколения кресте между двумя различными штаммами по причинам, не связанным с предполагаемой манипуляции 13. Этот фактор имеет особое значение при использовании GAL4-UAS системы. Для экологических мероприятий (например, медикаментозного лечения, диеты, температуры и т.д.), целесообразно изучить влияние вмешательства на более чем одного штамма. Наконец, оба родительских 16-летнего возраста и стресса 17 может влиять на продолжительность жизни поколения F1, и по этой причине, здоровые молодые люди должны быть выбраны для производства яиц.

Важные аспекты управления личиночной / куколки окружающей среды включают предотвращение переполнения и поддержания контролируемой среде с жесткого регулирования светлого и темного периодов, влажности и температуры. Эти факторы будут влиять как на сроках разработчикаelopment и физические качества получаемого взрослых. Побочные личиночной средах, таких как высокие плотности личинок, может привести к активации стресс-индуцируемых факторов (например, белок теплового шока выражении), что, как известно, влияют взрослых долголетия 18.

Во взрослой фазе, внимательное отношение к окружающей среде остается существенным. Выбор только диета может сильно повлиять на продолжительность жизни и может взаимодействовать с генетическими факторами для получения диеты специфическое воздействие на долголетие. Кроме того, некоторые общие кормовой базы альтернатив (дрожжевой экстракт дрожжей вместо лиофилизированной все пивные) может значительно сократить срок службы 19, оставляя открытой возможность того, что сама еда вызывает стресс организмов, которые могут ослабить оценки долговечности. В этой статье мы выделили потенциальные источники стресса в диетических окружающей среды, включая физические аномалии в пищу (например, пузырьки, пена, трещины, бактерии и т.д.), которые могут рhysically поймать животных. Регулярная замена старых пищу свежей пищи (по крайней мере, три раза в неделю) можно преодолеть многие из этих трудностей. Кроме того, температура 20, влажность (личные наблюдения), освещение 21, и присутствие сородичей (социальная среда) 22 могут модулировать жизни, и внимание к борьбе с этими факторами в рамках эксперимента важно, чтобы избежать предвзятости в результатах. В то время как количество мух в флаконе уменьшается со временем, мы обнаружили, что использование анестезии, чтобы регулировать количество мух может увеличить смертность в возрасте-зависимым способом (Pletcher, личных наблюдений), и мы не рекомендовали эту процедуру. Точное положение флаконов в инкубаторе, также является фактором, даже в, казалось бы, контролируемой среде. Рандомизированное физическое распределение экспериментальных группах с элементами управления может смягчить смещения, связанные с размещением и флаконов для правильного статистического вывода. Даже стщательно контролируемых условиях, небольшие различия можно наблюдать между экспериментами и использование в эксперименте-контроль имеет важное значение.

Альтернативные подходы кормления были предложены для анализа продолжительности жизни в том числе капиллярных подход подачи (CAFE метод) 23. Этот метод отличается в способности обеспечить точное измерение потребления продуктов питания, но это приводит к заметно недолго мух 24. Потенциальные стрессы, связанные с кормлением окружающей среды необходимо учитывать при оценке комбинированного связь между диетой и генетических факторов в общей продолжительности жизни.

Демографический анализ, в том числе Расчет выживаемости и смертности кривые можно выявить много информации о динамике старения населения. Типичная кривая выживаемости будет оставаться относительно квартиру на длительный период в начале жизни и увеличить ее скорость снижения в пожилом возрасте, что соответствует периоду низкой смертности Followed периодом экспоненциального роста смертности. Стрессовых условиях будет обычно проявляется в виде избыточного ранней смертности среди населения и аномальное падение в выживаемости кривой. Хотя такой результат может указывать на существенные различия между процедурами, она не будет как правило, устойчивы к репликации. Поэтому мы рекомендуем, по крайней мере, два независимых (т.е. не одновременные) повторных экспериментах быть выполнены прежде, чем любая фирма заключения взяты. Вполне возможно, что дополнительные усилия в направлении увеличения размера выборки, управление хозяйством условиях, и улучшение здоровья родительских запасов не требуется.

Правой кнопкой цензуры (изъятия животных из эксперимента, что побег или умершим от случайных причин) животных, которые умирают от стрессовых условиях окружающей среды следует применять с крайней осторожностью. Строго говоря, цензура должна произойти случайно через экспериментальные методы лечения, и если экспериментальные ИНТЕРВЕНЦИОННАЯна модулирует напряжение чувствительностью, можно ненароком применять лечение выбора уровня населения. Как правило, избегая при наличии факторов, которые могли бы производить неоднозначное ранней смерти (в первую очередь связан с источником питания) лучше, чем цензура, а цензура должна быть применена только к организмам, которые наблюдались умереть или сбежать во время физической обработки.

Окончательного рассмотрения является оценка статистической значимости. В то время как большие размеры образца когорты обеспечивает впечатляющую мощность различать мелкие различия между процедурами, потенциальная биологическая значимость такого различия также должны быть рассмотрены. С разумной экспериментов долголетие, различия столь же низко как 1-2% зачастую весьма статистически значимыми, но в целом влияние вмешательства на состояние здоровья могут быть незначительными. Таким образом, статистической и биологическое значение необходимо учитывать при интерпретации общих результатов эксперимента. Инфеrence о процессе старения от выживания эксперименты могут быть дополнены мерами возрастного снижения поведенческих или физиологических медико-санитарные меры, в том числе способность преодолевать 25 и желудочно-кишечного целостности стенки 7.

Таким образом, организм Drosophila модели привлекательным выбором для изучения механизмов старения. При тщательной экспериментальной техники, надежные демографический анализ может дать представление о воздействии фармакологических и генетических факторов на процесс старения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана финансирование от Эллисон Медицинский фонд (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (НИЛ, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) и NIH R01AG030593 (SDP). Эта работа использовала ресурсы Drosophila старения Core (DAC) Центра Натан Шок выдающиеся достижения в области биологии старения финансируется Национальным институтом старения P30-AG-013283 ( http://www.nih.gov/ ). Авторы хотели бы поблагодарить Pletcher лаборатории за полезные обсуждения и особенно Брайан Чунг за критическое прочтение рукописи. Мы хотели бы поблагодарить Ника Ашер и Кэтрин Borowicz за помощь в сборе данных.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active Dry Yeast Fleishmann’s Yeast 2192
Grape Agar Powder Premix Genesee Scientific 47-102
Large Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-101
Large Replacement End Caps Genesee Scientific 59-103
6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene Genesee Scientific 32-130
Flugs Closures for Stock Bottles Genesee Scientific 49-100
Drosophila Vials, Wide, Polystrene Genesee Scientific 32-117
Flugs Closures for Wide Vials Genesee Scientific 49-101
Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul Denville Scientific P1105-CP
Flystuff Flypad, Standard Size Genesee Scientific 59-114
BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; Fisher Scientific 08-757-12
Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow Fisher Scientific 10-200-47
PBS pH 7.4 10x Invitrogen 70011044
Gelidium Agar Mooragar n/a
Brewer's Yeast MP Biomedicals 0290331280
Granulated Sugar Kroger n/a
Tegosept Genesee Scientific 20-266 Fly Food Preservative
Propionic Acid, 99% Acros Organics 149300025 Fly Food Preservative
Kanamycin Sulfate ISC BioExpress 0408-10G
Tetracycline HCl VWR 80058-724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
  2. Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an 'aging gene' in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
  3. Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
  4. Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging? PLoS One. 6, e26891 (2011).
  5. Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
  6. Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
  7. Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
  8. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
  9. Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
  10. Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
  11. Promislow,, Tatar,, Pletcher,, Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
  12. Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
  13. Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
  14. Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
  15. Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
  16. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
  17. Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
  18. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
  19. Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
  20. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
  21. Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
  22. Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
  23. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
  24. Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
  25. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
Измерение продолжительности жизни в<em&gt; Дрозофилы</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (71), e50068, doi:10.3791/50068 (2013).More

Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (71), e50068, doi:10.3791/50068 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter