Summary
Drosophila melanogaster é um organismo modelo eficaz para explorar a base molecular da regulação da longevidade. Este protocolo irá discutir as etapas envolvidas na criação de um reprodutível, medição de base populacional de longevidade, bem como potenciais armadilhas e como evitá-los.
Abstract
O envelhecimento é um fenômeno que resulta na deterioração fisiológica constante em quase todos os organismos em que foi examinado, levando à redução do desempenho físico e aumento do risco de doenças. Envelhecimento individual se manifesta ao nível da população como um aumento dependente da idade de mortalidade, que é muitas vezes medido em laboratório, observando vida em grandes grupos de indivíduos da mesma idade. Experiências que visam quantificar a extensão em que as manipulações genéticas ou ambientais impacto esperança de vida dos organismos modelo simples foram coroados de êxito para a compreensão dos aspectos do envelhecimento que são conservadas entre taxa e para inspirar novas estratégias para prolongar vida útil e prevenção de doenças associadas à idade nos mamíferos .
A mosca do vinagre, Drosophila melanogaster, é um organismo modelo atractivo para estudar os mecanismos de envelhecimento devido ao seu tempo de vida relativamente curto, a criação conveniente, e genética fáceis.No entanto, medidas demográficas de envelhecimento, incluindo a idade específica de sobrevivência e mortalidade, são extremamente suscetíveis a variações ainda menores em delineamento experimental e meio ambiente, e para a manutenção de práticas estritas de laboratório para a duração dos experimentos de envelhecimento é necessária. Estas considerações, juntamente com a necessidade de praticar o controle cuidadoso do fundo genético, são essenciais para a geração de medições robustos. Na verdade, há muitas controvérsias em torno notáveis inferência a partir de experimentos de longevidade em leveduras, vermes, moscas e ratos que foram traçadas a artefatos ambientais ou genéticos 1-4. Neste protocolo, descrevemos um conjunto de procedimentos que foram otimizados ao longo de muitos anos de medir a longevidade em Drosophila utilizando frascos de laboratório. Descrevemos também o uso do software DLIFE, que foi desenvolvido pelo nosso laboratório e está disponível para download ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / software). DLIFE acelera o rendimento e promove as boas práticas, incorporando melhor projeto experimental, simplificar a manipulação mosca e coleta de dados, padronização e análise de dados. Também vamos discutir as muitas armadilhas em potencial no projeto, coleta e interpretação de dados de expectativa de vida, e nós fornecemos medidas para evitar esses perigos.
Protocol
Recomendamos armazenar alimentos experimentais, pasta de levedura e placas de agar de uva que aparecem no protocolo, a 4 ° C e utilizando-os dentro de 1-2 meses, desde que o molde e secura não tiver definido dentro das condições ambientais padrão, tanto para o larvar e adulto estágio envolve a manutenção de moscas em uma incubadora a 25 ° C com um ciclo de 12:12 horas de luz escura e 60% de humidade relativa.
1. Preparação de Alimentos Experimental
- Para o crescimento larval, usamos uma versão modificada Caltech Médio 5, que é abreviado neste protocolo como CT.
- Recomenda-se uma dieta de adultos de Drosophila (SY) que consiste em açúcar (sacarose) e levedura (levedura de cerveja inteiro liofilizado) em uma base de agar a 2%, que foi fervida, suplementado com antibióticos e agentes anti-fúngicos, e distribuído (10 ml por frasco) 6. Alimento deve ser deixado solidificar e evaporar durante 12-24 horas antes do armazenamento. Uma vez que o ambiente nutriente pode substancialmente longevidade impacto, consistência nos processos de cozimento é fundamental, tanto dentro de um experimento e para a comparação entre os experimentos.
- Se um agente farmacológico é para ser adicionado ao alimento para adultos, esta droga pode ser misturado em um pequeno lote de alimentos e em camadas (2 ml) na superfície da comida, com os frascos de controlo que receberam camadas contendo apenas veículo.
2. Preparação de uma pasta de levedura viva
Combine 5-6 ml de água com 3 g de levedura seca activa e misturar bem. A consistência da pasta de levedura deve ser a de uma manteiga de amendoim lisa.
3. Preparação de uma placa de agar de uva
- Adicionar um pacote de uma pré-mistura de agar de uva em 500 mL de água destilada num balão de 1000 ml e seguir as instruções da embalagem para dissolver a mistura de agar de uva.
- Verter cuidadosamente uma espessa camada de a mistura em placas de 100 mm de Petri, evitando a formação de bolhas. Um pacote de pré-mistura produz cerca de 14 graágar placas PE.
- Deixar os meios arrefecer e solidificar a temperatura ambiente, com tampas de 15 min. As placas podem ser mantidas a 4 ° C, envolvido em película de plástico, ou utilizado imediatamente.
4. Coleta de ovos sincronizados
Todos os meios utilizados no presente protocolo, isto é, de levedura, de placas de ágar de uva, CT e 10% de alimento SY, deve estar à temperatura ambiente.
- Espalhe uma camada de 2-3 cm de diâmetro de levedura cole em uma placa de ágar de uva e reserve.
- Coloque uma gaiola grande coleção de ovos em uma almofada de CO 2 com a malha lateral-down para anestesiar as moscas. À base de nitrogênio anestesia é uma alternativa para o CO 2, usada por alguns laboratórios, que pode produzir resultados de alta qualidade 7.
- Utilizando um funil, transferir 150-200 pares de moscas dentro da jaula recolha de ovos.
- Colocar a placa de agar de uva para cobrir a extremidade aberta da gaiola, e fixá-lo com uma tampa de extremidade.
- Coloque a gaiola do seu lado até moscas acordar.Em seguida, manter a gaiola, com o lado da placa de agar de uvas para baixo, na incubadora durante a noite.
- No dia seguinte, a placa de troca de uva com um prato de uva recém-fermentado. Colocar somente cerca de 1 cm de diâmetro de massa de levedura sobre a superfície da placa. Descarte o 1 º placa de uva dia.
- Permitir que os embriões de recolher na superfície da placa de agar de uva para 16-22 hr. Uma vez feito, recolher a placa de ágar de uva e descartar as moscas pai.
- Lava-se a superfície das placas de agar de uva com 1x Tampão fosfato salino (PBS). Os ovos podem ser mobilizados por gentilmente raspando com um cotonete. Tomar cuidado para não danificar o início, ou raspar finos pedaços de agar para fora da superfície da placa. Com o auxílio de um funil, despeje os ovos lavados para um tubo cónico de 15 ml.
- Deixe os ovos se depositam no fundo do tubo e decantar o sobrenadante, tendo o cuidado de não perder qualquer ovos. O volume restante deve ser em torno de 2-3 ml.
- Adicionar 8-10 ml de PBS ao tubo e repetir o passo 2-3 acima morvezes e para lavar os ovos até o sobrenadante é clara. Livrar-se de levedura residual é a chave nesta etapa.
- Após a lavagem, drenar todo o sobrenadante até que o volume remanescente é de 2 ml. Alíquota de 32 ul de ovos em garrafas CT usando uma ponteira grande furo. Ovos na ponta da pipeta deve ser compacto, com pouco ou nenhum líquido aspirado. Isto pode ser alcançado através da inserção da ponta da pipeta em profundidade o assentamento de ovo e rapidamente libertar o êmbolo para aspirar.
- Lugar semeado CT garrafas de volta na incubadora durante todo o desenvolvimento da mosca.
5. Recolha de Idade de correspondência adulto voa
- Adultos normalmente eclose a partir do dia 9 em diante. Descarte as moscas que surgiram no primeiro dia e garrafas lugar de volta na noite incubadora. Essa prática vai evitar a seleção inadvertida para emergentes iniciais e permitir a recolha de um número máximo de moscas sincronizados.
- 16-22 horas mais tarde, transferir o adulto dias de idade voa intgarrafas de alimentos Ø 10% Sy. Se necessário, um outro lote podem ser recolhidos no dia seguinte.
- Retorno voa de volta para a incubadora e permitir moscas para atingir a maturidade sexual e companheiro por dois dias. Gravar no dia da transferência para frascos de 10% SY como o primeiro dia de vida adulta.
6. Classificando Moscas e configuração Experimento Longevidade
- Anestesiar pequenos grupos de moscas sobre a almofada de anestésico, os machos e fêmeas de classificação em dois grupos, usando um pincel. Se usando CO 2, é fundamental para minimizar a exposição para evitar possíveis problemas de saúde de longa duração que podem comprometer a integridade da experiência longevidade.
- Coloque 30 moscas do mesmo sexo em frascos individuais. Supondo que nenhum cromossomo balanceador na população e descendência saudável, cada garrafa deve produzir cerca de 3-4 frascos de cada sexo. Alíquotas de moscas em frascos individuais não deve durar mais do que 3-4 minutos, de modo que, no total, as moscas são apenas expostos a anestesia durante um máximo de9-10 min.
- Repita os passos de 6,1-6,2 até que haja 8-10 frasco repetições para cada sexo e tratamento experimental.
7. Configurando a planilha Excel para controlar o Experimento Longevidade
- Recomendamos randomizar posição frasco, em vez de frascos de agrupamento por condição experimental, a fim de evitar imprecisões associadas à localização frasco dentro da incubadora e para obscurecer a identidade do frasco para o experimentador. Para fazer isso, primeiro atribuir um ID aleatório numérica para cada frasco em um programa de planilha, em seguida, organizar os frascos em bandejas por número de identificação. Se você estiver usando o software de gerenciamento de DLIFE experiência, siga o tutorial sobre configuração da experiência para gerar o número de identificação para cada frasco.
- (Opcional) Se você estiver usando um leitor de RFID ou leitor de código de barras em associação com DLIFE, anexar uma tag RFID ou de código de barras a cada frasco e associar a marca com identificação numérica do frasco em DLIFE. O programa irá reconhecer cada frasco quando digitalizados com um leitore orientar uma para gravar os dados no local correto em uma planilha. O uso de um leitor de etiquetas em conjunto com DLIFE reduz significativamente os dados época de coleta e erro de gravação.
8. Manter o experimento Longevidade
Os frascos contendo alimentos frescos devem estar à temperatura ambiente para cada transferência.
- Durante o período experimental, as moscas transferir para frascos contendo novos alimentos frescos cada 2 dias (fêmeas jovens), ou 3 vezes por semana (machos ou fêmeas> 3 semanas de idade). Este passo assegura que o ambiente de alimentação para fêmeas jovens não é perturbada pela presença de larvas. Esta transferência deverá ser concluída sem anestesia, o que pode causar a morte aguda, especialmente em moscas mais velhas (Pletcher, observações pessoais).
- Durante cada transferência frasco, registrar a idade, contar as moscas mortas no frasco de idade, e as moscas mortas que são transportados para o novo frasco. Grave esta informação separadamente emduas colunas em uma planilha (ou DLIFE ou sua própria planilha). Isto irá garantir que as moscas não são realizadas duas vezes contadas. O número total de mortes (mortos + realizada) deveria pelo menos igual ao número de moscas realizadas a partir da transferência anterior. Subtrair o número de moscas anteriormente desenvolvidas a partir do número total de mortes para determinar o número de mortes por novas.
- Uma mosca é considerado certo-censurada se deixasse o experimento antes da morte natural através de fuga ou morte acidental. Animais saem da experiência desta forma deve ser inserido em uma coluna separada no dia em que a mosca saiu do experimento. Censurado moscas não são contabilizados como mortos (veja abaixo).
- Continuar a repetir os passos 8,1-8,2 até o último sobrevivente está morto. Esteja ciente de que, como a idade moscas, algumas moscas podem mentir sobre a sua volta e aparecem mortos devido a sua inatividade. Portanto, quando a contagem moscas transportadas (morto), toque no lado dos frascos para determinar se existem movimentos das pernas. Se assim for, thesmoscas eletrônicos ainda estão vivos. No caso em que as moscas permanecem presos à comida no frasco de idade, mas vivos, eles não devem ser contados como mortos e deve ser resgatado por mais tocando do frasco para retirar a mosca. Censurando moscas que deve ser usado com cuidado, uma vez que pode resultar em viés experimental.
9. Análise de Dados
- A curva de sobrevivência mostra a probabilidade de que um indivíduo sobrevive para uma dada idade e normalmente é calculado usando uma abordagem de Kaplan-Meier (Figura 1) 8. Na ausência de dados da direita censurados, a fórmula pode ser simplificada tal que a sobrevivência específica da idade com a idade de x (S x) é determinado dividindo-se o número de indivíduos vivos no início de um período censo na idade x (N x) pelo número total de moscas no experimento (N 0) em que S x N x = / N 0. 9,2) Sobrevivência curvas são a forma mais comum de apresentação de dados, e elespode ser testado para a igualdade entre grupos usando um teste de log-rank. Inferência razoável pode ser desenhado a partir de tão pouco quanto 50-100 indivíduos de uma coorte. A sobrevivência é uma medida cumulativa, contudo, e, por conseguinte, que não são as mortes relacionadas com o envelhecimento, tais como os primeiros anos de vida, irá diminuir a sobrevivência ao longo do tempo de vida o que torna difícil a efeitos específicos para averiguar o envelhecimento.
- Um método de visualização de dados é a segunda função de mortalidade específica por idade, o que mostra o risco de morrer por cada intervalo de idade e apresenta uma descrição mais matizada dos dados de sobrevivência 9,10. Medidas de mortalidade são independentes um do outro para a idade, e a forma da curva de mortalidade é útil para inferir sobre a dinâmica do envelhecimento, em particular quando os tratamentos são ajustados durante a vida adulta. Estimativas de mortalidade específicas por idade, no entanto, não têm precisão e exatidão com amostras pequenas, e muitas vezes exigem vários-para-muitos centenas de indivíduos por coorte para uma es confiáveltimate 11.
- Outros métodos para estimar diferenças de longevidade incluem paramétrico (eg Gompertz) e semi-paramétricos (por exemplo, a regressão de Cox) modelos. Estes modelos podem ser poderosos, mas deve ser aplicado com cautela por causa das suposições feitas sobre a forma das curvas de mortalidade e da natureza dos efeitos do tratamento, o que poderia levar a inferência incorreta 11,12.
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Representative Results
Um esquema simplificado do protocolo é apresentada na Figura 1, em que os passos principais são delineadas. A parte do protocolo de sincronização podem ser utilizados para ensaios diferentes que necessitam de moscas adultas pareados por idade.
As curvas de sobrevivência típicas de moscas do tipo selvagem são mostradas na Figura 2a, utilizando o software de gestão de DLIFE experiência (Figura 2b, c). Machos adultos geralmente vivem mais curto, com ambas as populações atingir uma longevidade média e mediana de> 50 dias em um alimento SY 10% a 25 ° C. Note-se que a sobrevivência continua alta no início do experimento e depois cai exponencialmente.
Drosophila vida útil é afectada por condições ambientais, tais como temperatura e dieta. Figura 3a mostra que os machos adultos geralmente vivem consideravelmente mais curta que a temperatura é aumentada. Da mesma forma, o efeito da dieta na vida útil é apresentado na Figura 3b
A densidade de coortes durante o desenvolvimento podem influenciar a vida adulta e alterar tempo de desenvolvimento. Aqui vamos mostrar um exemplo de como diferentes densidades de ovos sincronizados afetar o desenvolvimento larval. Como mostrado na Figura 4, o rendimento de mosca adulta é pobre e a superfície do alimento é susceptível de secagem, quando o número de ovos, é demasiado baixa. Na outra extremidade do espectro, é retardado o desenvolvimento larvar no superlotadas garrafas, e o rendimento de moscas adultas é reduzido.
A curva de sobrevivência do grupo como um todo, pode ser significativamente influenciada por efeitos anómalos frasco, como mostrado na Figura 5. Dados de sobrevivência irregulares para frascos individuais pode ter várias causas, como a qualidade dos alimentos pobres ou bacteriana / fúngica acumulação e infecção. Embora tais mortes anómalas cuma inclinação a medida de sobrevivência da população, não existe uma métrica simples para determinar adequadamente que um frasco deve ser excluído do experimento. Estas situações são, portanto, melhor evitar por práticas de manejo boas e atenuado pelo uso de uma amostra grande.
A Figura 6 mostra exemplos de condições de frascos que podem conduzir a mortes anómalas. De um modo geral, qualquer condição que pode conduzir a fendas pequenas onde moscas pode ficar preso e morrer deve ser evitado. Os exemplos incluem: bolhas no alimento secura, no alimento que leva a diminuir para longe da parede do frasco, e fissuras no alimento são mostrados na Figura 5a (um exemplo suave com uma única bolha), Figura 5b e 5c Figura, respectivamente . Alimentos excessivamente seco, como se mostra na figura 5b e 5c Figura deve ser cuidadosamente capotou durante as transferências, como o alimento pode desalojar e recolher sobre as moscas no nfrasco ew. O crescimento bacteriano na superfície da comida pode levar a uma infecção ou a retenção física e, portanto, pode aumentar a mortalidade. Algumas bactérias na superfície da comida parecem transparentes e brilhantes, como se há transpiração a partir da alimentação (não mostrado), enquanto que outros tipos de bactérias irá manifestar como colónias brancas (Figura 5d). Frascos que apresentem alguma destas condições deveria ser notado e ainda considerado quando os dados são interpretados. Em geral, enfatizamos que a atenção o cuidado de criação em ambas as fases de larva e adulto pode apoiar a longevidade e saúde de moscas adultas e reduzir a ocorrência de problemas que levam a causas ambíguas de morte na vida adulta.
Figura 1. Esquemática simplificada de um ensaio de tempo de vida de Drosophila.
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Figura 2. (A) curvas de tempo de vida de w representativos fêmea de controlo 1118 (círculos) e de adulto (quadrados) macho voa a 25 ° C em um alimento SY10%. (B, C) Representante capturas de tela do software DLIFE.
Figura 3. Efeitos da temperatura (A) e dieta (B) no adulto vida útil. A. Adulto controle (Canton S) moscas macho foram mantidas até a idade adulta a 18 ° C, 25 ° C, ou 29 ° CB controle Adulto (w 1118) moscas fêmeas foram expostos a um ou SY 15% ou 5% SY dieta.
Figura 4. Dia 9 do desenvolvimento (a 25 ° C) de ovos sincronizado, aliquotadas em frascos de comida de TC. Volume da alíquota contendo embrião-é como mostrado abaixo de cada garrafa.
Figura 5. Trama representativas do software DLIFE mostrando sobrevivência por frasco. A seta indica um único frasco anómala dentro de um grupo.
Figura 6. Exemplos de qualidade de alimentos de qualidade inferior. A. bolhas na superfície dos alimentos. Food B. encolheu para longe da borda do frasco. C. Rachaduras no alimento. Bactérias D. acumulação sobre a superfície do alimento.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado descreve um método para produzir medições reprodutíveis da longevidade da Drosophila, que é adaptável para a avaliação de intervenções farmacológicas, genéticos e ambientais. Aspectos cruciais do protocolo incluem controlando cuidadosamente o ambiente de desenvolvimento larval, minimizando o estresse do adulto, e minimizando o viés entre os grupos experimentais e controles. Apresentamos também a utilização do software de gestão DLIFE vida experiência. Por simplesmente anexar um código de barras ou etiqueta RFID para cada frasco, o programa DLIFE vai ajudar na aquisição de dados para cada medida e em traçar a curva de sobrevivência. Enquanto é actualmente o mais adequado para estudos de mosca lifespan usando frascos, esta ferramenta de gestão de experiência pode ser facilmente adaptado para o uso em outros organismos, com diferentes tipos de câmaras de população, ou de medidas adicionais de sobrevivência, incluindo a resistência à tensão e à toxicidade da droga.
Prior de iniciar qualquer avaliação longevidade, é preciso primeiro cuidadosamente controlar a produção de estoques parentais. Variabilidade genética é um factor importante, como é a saúde das estirpes parentais. Esses fatores levaram a controvérsia pública considerável associada com os primeiros estudos que relataram reguladores longevidade putativos 13. O pesquisador tem várias opções para minimizar os efeitos atribuíveis a variabilidade genética. Para as manipulações genéticas, todas as estirpes geneticamente modificadas de fundo deve ser controlada, quer através de retrocruzamento de uma estirpe de controlo (pelo menos 6 vezes), ou utilizando sistemas induzíveis (por exemplo, alelos, sensíveis à temperatura ou droga-induzida a expressão do transgene). O GeneSwitch e Tet-nos sistemas 14,15 são populares e permitir a comparação direta de moscas com a mesma formação genética em que o transgene é induzidas ou não induzido. Para todos os sistemas indutíveis, adequados controlos contemporâneos são necessárias para evitar confounds associado com o indutor. Falta de controle para o fundo genético quase sempre resulta em vigor híbrido, o que pode estender o tempo na geração F1 de um cruzamento entre duas linhagens diferentes por razões não relacionadas com a manipulação destinadas 13. Este fator é de especial preocupação ao usar o sistema GAL4-UAS. Para intervenções ambientais (por exemplo, tratamento da toxicodependência, dieta, temperatura, etc), é aconselhável para estudar os efeitos da intervenção sobre mais de uma estirpe. Finalmente, ambos os 16 anos parental e estresse 17 pode influenciar a longevidade da geração F1, e por esta razão, adultos jovens saudáveis deve ser escolhido para a produção de ovos.
Aspectos importantes do controle do ambiente larval / pupal incluem a prevenção da superlotação e da manutenção de um ambiente controlado com regulação estrita do claro-escuro períodos, umidade e temperatura. Estes fatores afetam tanto o tempo de desenvolvimento ea qualidade física dos adultos resultantes. Adversos ambientes larvais, tais como a densidade larval elevada, pode levar à activação de factores de tensão-induzida (por exemplo, a expressão da proteína de choque térmico) que são conhecidos por influenciar a longevidade do adulto 18.
Na fase adulta, a cuidadosa atenção ao meio ambiente continua a ser essencial. A escolha da dieta isoladamente pode influenciar muito tempo de vida e pode interagir com fatores genéticos para produzir dieta efeitos específicos sobre a longevidade. Além disso, algumas alternativas alimentares comuns de base (extracto de levedura em vez da levedura de cerveja inteiro liofilizado) podem encurtar a vida drasticamente 19, deixando em aberto a possibilidade de que o alimento em si está a causar o stress organismal que pode prejudicar a avaliação da longevidade. Neste artigo, destacamos fontes potenciais de estresse no ambiente de dieta incluindo anomalias físicas nos alimentos (por exemplo, bolhas, rachaduras, espuma, bactérias, etc) que pode physically prender os animais. Substituição regular de comida velha com alimentos frescos (pelo menos três vezes por semana) pode superar muitas destas dificuldades. Além disso, a temperatura de 20, humidade (observações pessoais), iluminação 21, e a presença de membros da mesma espécie (ambiente social) 22 pode ser modulada quer tempo de vida, e a atenção para controlar estes factores dentro do experimento é importante para evitar os erros nos resultados. Embora o número de moscas dentro de um frasco diminui com o tempo, verificou-se que a utilização de anestesia para ajustar o número de moscas pode aumentar a mortalidade de um modo dependente da idade (Pletcher, observações pessoais), e não se recomenda este procedimento. A posição exacta dos tubos, e em uma incubadora é também um factor, mesmo num ambiente controlado, aparentemente. Distribuição física randomizado de grupos experimentais com controles podem mitigar viés associado com a colocação de frasco e é necessário para a inferência estatística adequada. Mesmo comcondições cuidadosamente controladas, pequenas diferenças podem ser observadas entre os experimentos e a utilização de controlos dentro de-experimental é essencial.
Abordagens de alimentação alternativas têm sido propostas para a análise de tempo de vida, incluindo uma abordagem de alimentação capilar (método CAFE) 23. Este método se destaca na habilidade para fornecer medições precisas do consumo de alimentos, mas que resulta em marcadamente de curta duração moscas 24. Tensões potenciais associados com o ambiente de alimentação devem ser considerados ao avaliar a relação combinada entre dieta e fatores genéticos de longevidade geral.
Análise demográfica, incluindo o cálculo de sobrevivência e curvas de mortalidade podem revelar muitas informações sobre a dinâmica do envelhecimento da população. A curva de sobrevivência típico irá permanecer relativamente estável durante um longo período no início da vida e aumentar a sua taxa de declínio em idades mais velhas, o que corresponde a um período de f baixa mortalidadeollowed por um período de um aumento exponencial na mortalidade. Um ambiente estressante normalmente irá se manifestar como um excesso de mortes prematuras na população e um mergulho anômalo na curva de sobrevivência. Embora um tal resultado pode indicar diferenças significativas entre os tratamentos, não será normalmente robusta para a replicação. Recomendamos, portanto, pelo menos dois independentes (ou seja, não contemporânea) replicar as experiências ser executado antes de qualquer conclusão firme são desenhados. Pode ser que o esforço adicional para aumentar o tamanho da amostra, o controlo das condições de criação, e melhorar a saúde dos estoques parentais é necessária.
Direito censura (retirar os animais do experimento que escapam ou são dados como mortos por causas acidentais) de animais que morrem de condições ambientais de estresse deve ser aplicada com extrema cautela. Estritamente falando, a censura deve ocorrer de forma aleatória entre os tratamentos experimentais, e se o interventi experimentalmodula em sensibilidade ao estresse, pode-se, inadvertidamente, aplicar o tratamento em nível de seleção para a população. Como regra geral, evitar a presença de factores que podem produzir a morte precoce ambígua (principalmente associada com a fonte de alimentação) é melhor do que censura, ea censura só deve ser aplicado a organismos que foram observados para morrer ou escapar durante o manuseamento físico.
Uma consideração final é a avaliação de significância estatística. Enquanto grandes tamanhos de amostra de coorte fornecer energia impressionante de distinguir pequenas diferenças entre os tratamentos, a importância potencial biológico de tal diferença deve também ser considerada. Com as experiências longevidade tamanho razoável, as diferenças tão baixo quanto 1-2% são muitas vezes altamente significativa, mas o impacto global da intervenção sobre o estado de saúde pode ser menor. Assim, tanto a significância estatística e biológica deve ser considerado na interpretação dos resultados globais do experimento. Inferioridadecia sobre o processo de envelhecimento a partir de experiências de sobrevivência pode ser aumentada por meio de medidas relacionadas com a idade de declínios em medidas de saúde comportamental ou fisiológica, incluindo escalada capacidade 25 e integridade da parede gastrintestinal 7.
Em resumo, o organismo modelo Drosophila uma opção atraente para o estudo de mecanismos de envelhecimento. Com uma técnica experimental cuidadoso, análise demográfica robusto pode fornecer informações sobre o impacto de fatores farmacológicos e genéticos sobre o processo de envelhecimento.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi suportado pelo financiamento do Medical Ellison Foundation (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) e NIH R01AG030593 (SDP). Este trabalho utilizou os recursos do Envelhecimento Drosophila Core (DAC) do Centro de Choque Nathan de Excelência em biologia do envelhecimento financiado pelo Instituto Nacional do Envelhecimento P30-AG-013283 ( http://www.nih.gov/ ). Os autores gostariam de agradecer ao Laboratório Pletcher para discussões úteis e particularmente Brian Chung para a leitura crítica do manuscrito. Nós gostaríamos de agradecer Nick Asher e Kathryn Borowicz para a assistência com a coleta de dados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
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