Summary
Drosophila melanogaster는 장수 규제의 분자 기초를 탐험하기위한 강력한 모델 생물이다. 이 프로토콜은 재현, 장수뿐만 아니라 잠재적 인 함정의 인구 기반의 측정 방법과 그들을 피하기 위해를 생성하는 단계에 대해 설명합니다.
Abstract
노화는 감소 물리적 성능을 이끌어가 검사를 마쳤있는 거의 모든 생물의 꾸준한 생리 저하의 결과, 질병의 위험을 증가하는 현상입니다. 개인 노화는 종종 나이에 일치하는 개인의 큰 무리에서 관찰 수명에 의해 실험실에서 측정 나이에 따라 사망에 증가로 인구 수준에서 명단입니다. 범위를 수량화을 추구 실험 간단한 모델 생물의 유전자 나 환경 조작 영향 수명은 수명을 연장하고 포유류 나이 관련 질병을 예방하기위한 taxa에서와 감동을 새로운 전략에 대한 보존 아르 노화의 측면을 이해하는 매우 성공적인하는 방법 .
식초 파리, Drosophila melanogaster는 자사의 상대적으로 짧은 수명, 편리한 축산 및 손쉬운 유전학에 의한 노화의 메커니즘을 연구하기위한 매력적인 모델 생물이다.그러나, 나이 별 생존과 사망 등의 노화의 인구 통계 학적 조치는, 실험 설계 및 환경에도 작은 변화에 매우 민감하며, 노화 실험 기간 동안 엄격한 실험실 관행의 유지 보수가 필요합니다. 함께 유전 배경의주의 통제를 연습 할 필요가있는이 고려, 강력한 측정을 생성하기위한 필수적입니다. 사실, 효모의 수명 실험, 웜, 파리, 환경이나 유전 유물 1-4으로 추적 된 생쥐에서 추론을 둘러싼 많은 중요한 논쟁이 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 실험실 유리 병을 사용하여 Drosophila의 장수를 측정 오랜 세월에 걸쳐 최적화 된 절차의 집합을 설명합니다. 우리는 또한 실험실에서 개발 및 다운로드 (사용할 수 있습니다되었습니다 dLife 소프트웨어의 사용을 설명 http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / 소프트웨어). dLife는 처리량을 가속화하고 즉시 처리 및 데이터 수집을 단순화하고, 데이터 분석을 표준화, 통합 최적의 실험 설계에 의해 좋은 관행을 촉진합니다. 우리는 또한 설계, 수집 및 수명 데이터의 해석에 많은 잠재적 인 함정을 논의 할 것이다, 우리는 이러한 위험을 방지하기위한 조치를 제공합니다.
Protocol
우리는 4 ° C에서의 프로토콜에 나타납니다 실험 식품, 효모 붙여 넣기, 그리고 포도 한천 플레이트를 저장 및 금형과 건조는 애벌레의 성인 모두 표준 환경 조건 들어 설정하지 않은 한, 1~2개월 이내에를 사용하는 것이 좋습니다 12시 12분 시간 등 어두운주기와 60 % 상대 습도 25 ° C에서 보육에 파리의 유지를 포함 무대.
1. 실험 식품의 작성
- 애벌레의 성장을위한, 우리는 중부 표준시로이 프로토콜에 축약 된 수정 칼 테크 보통 5를 사용합니다.
- 우리는 (10 설탕 (자당)과 항생제 및 안티 곰팡이 요원과 보충 삶은 된 2 % 한천베이스에 효모 (동결 건조 된 전체 맥주의 효모)로 구성 성인 Drosophila (SY)에 대한식이 요법을 추천하고, 분산 ML 당 유리 병) 6. 음식은 고체화 및 저장하기 전에 12-24 시간에 증발 할 수 있어야합니다. 영양 환경 substan 수 있기 때문에요리 과정에서 tially 영향 장수, 일관성이 실험에서와 실험 사이의 비교를 위해 모두 필수적입니다.
- 약리 에이전트가 성인 음식에 추가 할 경우,이 약물은 혼자 차량을 포함하는 레이어를 수신 제어 튜브로 음식 표면에 음식과 계층의 작은 배치 (2 ML)로 혼합 할 수 있습니다.
2. 라이브 효모 붙여 넣기의 작성
활성 건조 효모의 3g에 물을 5-6 ML을 결합하여 잘 섞는다. 효모 붙여 넣기의 일관성은 부드러운 땅콩 버터의해야합니다.
3. 포도 한천 플레이트의 작성
- 1000 ML 플라스크에 증류수 500 ML에 포도 한천 premix의 패킷을 추가하고 포도 한천 믹스를 분해하기 위해 패킷의 지시 사항을 따르십시오.
- 거품 형성을 피하고있는 동안주의 깊게 100mm 배양 접시에 혼합물의 두꺼운 층을 부어. premix 중 하나 패킷 약 14 GRA를 생산PE 한천 플레이트.
- 미디어 냉각과 15 분에에 뚜껑을 실내 온도에 막혀 보자. 플레이트는 4에서 유지 될 수 있습니다 ° C, 플라스틱 랩에 싸서, 또는 즉시 사용됩니다.
4. 동기화 계란 수집
이 프로토콜에 사용 된 모든 미디어, 즉 효모, 포도 한천 플레이트, CT와 10 % SY 식품은 실온에서해야합니다.
- 포도 한천 플레이트에 붙여 넣으 효모의 2-3cm 직경 레이어를 확산하고 옆으로 설정합니다.
- 파리를 마취 아래로 메쉬 측과 CO 2 패드에서 큰 계란 수집 케이지를 놓습니다. 질소 기반 마취 고품질 검색 할 때 7 생산할 수있는 실험실에서 사용하는 CO 2에 대한 대안입니다.
- 유입 경로 사용하여 계란 수집 케이지에 파리 1백50~2백쌍를 전송할 수 있습니다.
- 새장 열린 끝을 커버하고 엔드 캡과 보호를 위해 포도 한천 플레이트를 배치합니다.
- 파리 일어 났을 때까지 그 쪽의 새장을 놓는다.그런 다음, 밤새 보육에, 아래 케이지, 포도 한천 플레이트 측을 유지.
- 다음 날, 새로 yeasted 포도 판과 포도 판을 교체. 만 판의 표면에 효모 붙여 넣기의 약 1 cm의 직경을 넣어. 1 일 포도 판을 폐기하십시오.
- 배아는 16-22 시간의 포도 한천 플레이트의 표면에 수집 할 수 있습니다. 완료되면 포도 한천 플레이트를 수집하고 부모 파리를 폐기하십시오.
- 1X 인산과 포도 한천 플레이트의 표면을 씻어 식염 (PBS)는 버퍼. 달걀은 부드럽게 면봉으로 스크랩으로 동원 할 수 있습니다. 스크래치, 손상 않도록주의를, 또는 접시의 표면에 묻은 한천의 얇은 조각을 다 쳤어요. 유입 경로의 도움으로 15 ML 원뿔 튜브에 씻은 계란을 부어.
- 달걀 튜브의 바닥에 정착하고 계란을 잃지 않도록주의하는 것 표면에 뜨는을 부어 보자. 나머지 볼륨 2-3 ML 주변에 있어야합니다.
- 관에 PBS의 8-10 ML를 추가하고 위의 단계 2-3를 반복 mor표면에 뜨는가 명확 할 때까지 전자 시간은 철저하게 계란을 씻어합니다. 잔여 효모를 제거하면이 단계에서 열쇠입니다.
- 나머지 볼륨은 2 ML 때까지 세척 한 후 모든 표면에 뜨는을 배수한다. 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여 중부 표준시 병에 나누어지는 계란의 32 μl합니다. 피펫 팁의 알은 흡입없이 액체 거의 함께 소형해야합니다. 이것은 계란 정착에 깊은 피펫 팁을 삽입하고 신속하게 기음 할 수있는 플런저를 출시함으로써 달성 될 수있다.
- 장소 시드 CT도 플라이 개발을 통해 보육에 다시 병.
5. 나이 검색 성인의 컬렉션은 파리
- 성인은 일반적으로 일에서 9 이후를 eclose합니다. 보육의 밤에 다시 첫 날과 장소 병에 등장한 파리 폐기하십시오. 이 연습은 초기 emergents에 대한 부주의 선택을 방지하고 동기화 파리의 최대 수의 모음에 대한 수 있습니다.
- 16-22 시간 후, 하루 지난 어른 INT 날아 전송O 10% SY 식품 병. 필요한 경우, 다른 배치는 다음 날 수령하실 수 있습니다.
- 돌아 가기 인큐베이터에 다시 이동하고 파리는 이틀 동안 성적 성숙과 짝을 도달 할 수 있습니다. 성인의 첫날을 10 %로 SY 병에 전송의 하루를 기록합니다.
6. 파리 정렬과 장수 실험 설정
- 붓을 사용하여 두 그룹으로 다음 마취 패드에 파리의 작은 그룹, 정렬 남성과 여성을 마취. CO 2를 사용하는 경우, 그것은 장수 실험의 무결성을 손상 할 수 있습니다 가능한 오래 지속 건강 문제를 방지하기 위해 노출을 최소화하는 것이 중요합니다.
- 개별 병에 같은 성별의 30 파리를 놓습니다. 인구 및 건강 자손에 균형의 염색체 특별한 일 없으면, 각 병은 각 성 3-4 병 주위를 생산해야합니다. 개인 튜브에 파리가 Aliquoting하면 총에 파리 만의 최대 마취에 노출되어 있도록, 3-4 분보다 더 이상을지지한다9-10 분.
- 8-10 병이 각 성별 및 실험 치료 복제가 때까지 반복 6.1-6.2 단계를 반복합니다.
7. 장수 실험을 추적하는 Excel 스프레드 시트를 설정
- 우리는 보육의 약병 위치와 관련된 편견을 방지하고 실험에 약병 ID를 가리는하기 위해 실험 조건에서 유리 병의 위치가 아닌 그룹화 병을 randomizing하시기 바랍니다. 이 작업을 수행하려면 먼저 스프레드 시트 프로그램의 각 유리 병에 무작위로 숫자 ID를 할당 한 다음 ID 번호로 트레이에 튜브를 배열합니다. 당신이 dLife 실험 관리 소프트웨어를 사용하는 경우, 각 유리 병의 ID 번호를 생성하는 실험 설정에 자습서를 따르십시오.
- 당신이 RFID 리더 또는 dLife과 관련하여 바코드 리더를 사용하는 경우 (선택 사항) 각 유리 병에 RFID 나 바코드 태그를 첨부하여 dLife에있는 유리 병의 숫자 ID와 태그를 연결합니다. 리더로 스캔 할 때이 프로그램은 각 병을 인식 할 수와 스프레드 시트에서 올바른 위치에 데이터를 기록 한을지도. dLife와 함께 태그 리더의 사용이 크게 데이터 수집 시간을 기록 오류를 줄일 수 있습니다.
8. 장수 실험을 유지
신선한 음식을 포함하는 튜브는 각 전송에 대한 실온에서해야합니다.
- 실험 기간 동안, 새로운 병로 전송 파리는 신선한 음식을 포함하는 매 2 일 (젊은 여성), 또는 3 회 (남성 또는 여성 시대> 3 주). 이 단계는 젊은 여성의 먹이 환경이 애벌레의 존재에 의해 중단되지 않도록합니다. 이 전송은 특히 오래된 파리 (Pletcher, 개인 관찰)에, 급성 사망률을 일으킬 수있는 마취없이 완료해야합니다.
- 각 유리 병 전송하는 동안, 나이를 기록 오래된 병에 죽은 파리를 계산하고, 새로운 유리 병에 수행 된 죽은 파리. 에 별도로 정보를 기록스프레드 시트의 두 열 (dLife 고객님의 스프레드 시트 중). 이 수행 파리를 두 번 계산되지 않도록합니다. 사망자의 총 수는 (죽은 + 수행)해야 이전 전송에서 수행 파리의 적어도 동일한 번호입니다. 새 사망자의 수를 결정하기 위해 사망자의 총 개수에서 이전에 수행 파리의 수를 뺍니다.
- 이 탈출하거나 우발적 인 살인을 통해 자연사하기 전에 실험을 떠난 경우 플라이는 마우스 오른쪽 검열로 간주됩니다. 이 방법으로 실험을 종료 동물은 파리가 실험을 종료하는 날에 별도의 항목으로 입력해야합니다. 검열 파리는 (아래) 죽음의 장소로 기록되지 않습니다.
- 최후의 생존자가 죽을 때까지 단계 8.1-8.2를 반복하고 있습니다. 파리 시대로, 일부 파리가 자신의 뒤쪽에 누워 자신의 inactiveness으로 인해 죽은 나타날 수 있음에 유의해야합니다. 따라서 (죽은) 수행 파리를 계산하면, 다리 움직임이 있는지 확인하기 위해 병의 측면을 터치하세요. 만약 그렇다면, thes전자 파리는 아직 살아 있습니다. 파리는 기존의 유리 병 만 살아에서 식품에 붙어 남아있는 경우에, 그들은 죽음의 장소로 간주되어서는 안됩니다 및 추가 플라이를 제거하기 위해 병을 활용하여 구출해야합니다. 이 실험 바이어스 될 수 있으므로 검열 등 파리는주의와 함께 사용되어야합니다.
9. 데이터 분석
- survivorship 곡선은 개인이 주어진 세에 남아 일반적으로 카플란 - 마이어 방식 (그림 1) 8을 사용하여 계산되는 확률을 표시합니다. 마우스 오른쪽 검열 데이터의 부재에서 수식이 세 X (S X)에서 그러한 그 나이 별 survivorship을 단순화 할 수는 세 X (N x)를에서 인구 조사 시간의 시작에서 살아 개인의 수를 나누어 결정됩니다 실험에서 파리의 총 개수 (N 0)에 의해, S X = N X / N 0. 9.2) Survivorship 곡선은 데이터 프리젠 테이션의 가장 일반적인 형태이며로그 순위 테스트를 사용하여 그룹 간의 평등을 테스트 할 수 있습니다. 합리적인 추론이 일대에서 50-100 개인처럼 몇에서 얻을 수 있습니다. Survivorship 그러나 누적 측정이며, 따라서 이러한 평생에 일찍 노화 관련없는 죽음은, 노화와 관련된 규명 효과가 어렵게 수명에 걸쳐 survivorship를 놓으면됩니다.
- 두 번째 데이터 시각화 방법은 각 연령 간격을 통해 죽음의 위험을 표시하고 생존 데이터 9,10의 더 nuanced 설명을 제시 시대 별 사망률 기능입니다. 사망률 조치 한 세에서 다른 독립적이며, 치료는 성인 생활 동안 조정됩니다 특히 때 사망률 곡선의 모양은 노화의 역학에 대한 추론에 유용합니다. 나이 별 사망률의 추정하지만, 작은 샘플 크기와 정밀도와 정확성이 부족하고, 종종 신뢰할 수있는 에스에 대한 일대 당 개인의 여러 일대 수백이 필요합니다11 timate.
- 장수의 차이를 계산하는 다른 방법은 파라 메트릭 (예 : Gompertz) 및 준 파라 메트릭 (예 : 콕스 회귀) 모델이 포함되어 있습니다. 이 모델은 강력한 될 수 있지만, 때문에 사망률 곡선의 모양과 잘못된 추론 11,12으로 이어질 수 치료 효과의 자연 현상에 대해 한 가정의주의 적용해야합니다.
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Representative Results
프로토콜의 단순화 된 구조는 주요 단계가 설명되어 그림 1에 표시됩니다. 프로토콜의 동기화 부분은 연령 일치 파리 성충을 필요로 다양한 assays에 사용하실 수 있습니다.
야생 형 파리의 전형적인 survivorship 곡선은 dLife 실험 관리 소프트웨어 (그림 2B, C)를 사용하여, 그림 2A에 표시됩니다. 성인 남성은 일반적으로 모두 인구가 25 ° C.에 10 % SY 식품에> 50 일 평균과 중간 장수를 달성과 함께 짧은 생활 survivorship은 실험의 초기 부분에서 높은 유지하고 기하 급수적으로 거부합니다.
Drosophila 수명은 같은 온도와 다이어트 등의 환경 조건에 의해 영향을받습니다.도 3a는 온도가 증가함에 따라 성인 남성이 일반적으로 현저하게 단축을 사는 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, 수명에 다이어트의 효과는 그림 3B에 표시됩니다
개발하는 동안 동료의 밀도는 성인 수명에 영향을 미치는 발달 타이밍을 변경할 수 있습니다. 여기 동기화 계란의 서로 다른 밀도는 애벌레의 개발에 영향을 미칠 방법의 예를 보여줍니다. 그림 4에 도시 된 바와 같이, 성인 플라이 수율이 떨어집니다 음식 표면은 알 수가 너무 낮은 경우 건조에 민감합니다. 스펙트럼의 다른 쪽 끝에서 애벌레의 개발은 끝났-북적 병에 저능아가 있으며, 파리 성충의 수익율이 감소된다.
그림 5와 같이 전체 일대의 survivorship 곡선은 변형 된 유리 병 효과에 의해 크게 영향을받을 수 있습니다. 개인 튜브에 대한 부정기 생존 데이터는 낮은 식품 품질 또는 곰팡이 / 세균 축적과 감염 등 여러 원인이있을 수 있습니다. 이러한 변형 된 사망자 C 동안인구 survivorship 측정 왜곡, 적절하게 병이 실험에서 제외해야한다는 결정하기위한 간단한 통계는 없다. 이러한 상황 따라서 가장 좋은 처리 절차에 의해 피할 수 있으며 대형 샘플 크기를 사용하여 완화됩니다.
그림 6은 변칙 사망으로 이어질 수있는 유리 병 조건의 예를 보여줍니다. 일반적으로 파리가 발생 할 수 있습니다 작은 크레바스로 이어질하고 죽을 수있는 조건은 피해야합니다. 예는 다음과 같습니다 유리 병 벽에서 떨어져 축소하고, 식품에 균열로 연결 식품에 식품, 건조에 거품이 각각 그림 5A (하나의 거품과 부드러운 예), 그림 5B 및도 5C에 표시됩니다 . 음식이 N에서 파리로 이동시키다과 축소 할 수 있습니다뿐만 그림 5B 및도 5C에 도시 된 바와 같이 과도하게 건조 식품은 조심스럽게 이동하는 동안 뒤집혀해야으의 유리 병입니다. 식품의 표면에 세균 성장은 감염 또는 물리적 함정 수사로 이어질 수 있으며, 따라서 사망률을 증가시킬 수 있습니다. 음식에서 땀이 (미도시)에있을 경우 같은 박테리아의 다른 유형이 흰색 식민지 (그림 5D) 등 되는거야 동안 식품의 표면에 일부 박테리아는 투명하고 반짝이는 나타납니다. 이러한 조건 중 하나를 전시 병이 언급하고 데이터를 해석 할 때 추가로 고려되어야한다. 일반적으로, 우리는 애벌레의 성인 단계 모두에서 농업에 해당 세심한주의를 강조하는 것은 파리 성충의 수명과 건강을 지원하고 나중에 인생에서 죽음의 모호한 원인으로 이어지는 문제의 발생을 줄일 수 있습니다.
그림 1. Drosophila 수명 분석의 단순화 된 도식.
그림 2. (A) w 1118 컨트롤 암 (원)과 남성 (사각형) 성인 대표 수명 곡선은 SY10 % 식품에 25 ° C에서 이동합니다. dLife 소프트웨어의 (B, C) 대표 스크린 샷.
그림 3. 온도의 영향 (A)와 (B) 성인 수명에 다이어트. A. 성인 제어 (광동 S) 남성 파리는 18 성인을 통해 유지되었다가 ° C, 25 ° C, 또는 29 ° CB 성인 제어 (w 1118) 여성 파리는 15 % SY 또는 5% SY 다이어트 중에 노출되었다.
그림 4. 개발 9 일 (25 ° C) 중부 표준시 식품 병에 aliquoted 동기화 계란의. V배아 함유의 나누어지는의 olume은 각 병 아래에 표시됩니다.
그림 5. 약병에 의해 survivorship를 표시하는 dLife 소프트웨어의 대표 줄거리. 화살표는 그룹 내에서 하나의 변형 된 유리 병을 나타냅니다.
6 그림. 차선 식품 품질의 예입니다. A.이 음식 표면에 거품. B. 식품이 약병의 가장자리에서 떨어져 감소. C.는 음식에 균열. 식품의 표면에 D. 박테리아가 축적.
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Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 유전자, 약리, 환경 개입의 평가에 적용 할 수 있습니다 Drosophila에 성인 장수의 재현 측정을 생산하는 방법을 설명합니다. 프로토콜의 중요한 측면을주의 깊게, 애벌레의 개발 환경을 제어하는 성인 스트레스를 최소화하고, 실험 그룹과 통제에서 바이어스를 최소화 등이 있습니다. 우리는 또한 dLife 수명 실험 관리 소프트웨어의 사용을 제시한다. 단순히 각 유리 병에 바코드 또는 RFID 태그를 부착하여 dLife 프로그램은 각 측정을 위해 데이터 수집을 지원하고 survivorship 곡선을 음모에 있습니다. 가 현재 병을 사용하여 플라이 수명 연구에 가장 적합하지만,이 실험 관리 도구는 쉽게 인구 챔버, 또는 스트레스 저항과 약물 독성 등의 생존의 추가 조치에 대해 서로 다른 유형, 다른 생물에 사용 적용 할 수 있습니다.
피모든 장수 평가를 시작으로 rior 한 먼저주의 깊게 부모 주식의 생산을 제어해야합니다. 부모 긴장의 건강은으로 유전자 다양성이 중요한 요소입니다. 이러한 요소 putative 장수 규제에게 13보고 초기 연구와 관련된 많은 대중 논쟁으로 이어 왔습니다. 연구진은 유전 적 배경에 변화에 기인 영향을 최소화 할 수있는 몇 가지 옵션이 있습니다. 유전자 조작 들어, 모든 유전자 조작 종자는 제어 부담을 어느 backcrossing을 통해 배경 - 제어 (적어도 6 회) 또는 inducible 시스템 (예를 들면, 온도에 민감한 대립 유전자 또는 약물 inducible의 transgene 표현)를 사용해야합니다. GeneSwitch 및 시스템 14,15 Tet-에가 인기가 있고, transgene이 중 유도하거나 유도되지 않은 동일한 유전 배경으로 파리의 직접 비교를 할 수 있습니다. 모든 inducible 시스템의 경우, 적절한 현재의 컨트롤이 confou을 방지해야합니다NDS는 유도 인자와 연관된. 의도 조작 13 무관 한 이유로 두 가지 변종 사이의 십자가의 F1 세대 수명을 연장 할 수 있습니다 하이브리드 활력의 결과는 거의 항상 유전 배경에 대한 제어 할 수 실패했습니다. GAL4-UAS 시스템을 사용하는 경우이 요소는 특정 관심사입니다. 환경 개입의 경우 (예를 들어, 약물 치료, 다이어트, 온도, 등)은 하나 이상의 변형에 대한 개입의 효과를 공부하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 부모 연령 16 스트레스 17 모두 F1 세대의 수명에 영향을 미칠 수 있으며, 이런 이유로, 건강한 젊은 성인은 계란 생산을 위해 선택해야합니다.
pupal / 애벌레의 환경을 제어하는 중요한 측면은 인구 과잉의 예방 및 빛 어두운 기간, 습도 및 온도의 엄격한 규정에 통제 된 환경의 유지가 포함되어 있습니다. 이러한 요소는 개발자의 타이밍 모두에 영향을 미칩니다elopment하고 그 결과 성인의 물리적 품질. 이러한 높은 애벌레의 밀도와 같은 불리한 애벌레의 환경, 성인 장수에게 18 영향을하는 것으로 알려진 스트레스 inducible 요소의 활성화 (예를 들어, 열 충격 단백질 표현)로 이어질 수 있습니다.
성인 단계에서 환경에 세심한주의가 필요한 남아 있습니다. 혼자 다이어트의 선택이 크게 수명에 영향을 미칠 수 있으며, 장수의 다이어트 별 효과를 생산하는 유전자 요소와 상호 작용할 수 있습니다. 또한, 몇 가지 일반적인 음식의 기본 대안 (효모 대신 동결 건조 된 전체 맥주의 효모의 추출)은 극적으로 음식 자체가 장수의 평가를 감소시킬 수 있습니다 organismal 스트레스의 원인이되는 가능성을 열어 놓고, 수명 19 단축 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 주실 수있는 식품에 물리적 이상 (예를 들어, 거품, 거품, 균열, 박테리아 등)을 포함하여식이 환경에서 스트레스의 잠재적 소스를 강조 표시 한hysically 동물을 모함. 신선한 음식과 오래된 음식 (적어도 3 번 주)의 정기 교체는 이러한 어려움을 많이 극복 할 수 있습니다. 또한, 온도 20, 습도 (개인 관찰), 조명 21과 conspecifics의 존재 (사회 환경) 22은 수명을 조절 할 수 있으며, 실험에서 이러한 요소를 제어에 대한 관심은 결과에 바이어스를 방지하는 것이 중요합니다. 병에서 파리의 수가 시간이 감소하는 동안, 우리는 파리의 수를 조정하는 마취의 사용 연령에 따라 달라 방식 (Pletcher, 개인 관찰)에서 사망률을 증가시킬 수있는 것으로 나타났습니다, 우리는이 절차를 권장하지 않습니다. 보육의 병의 정확한 위치는 겉보기 제어 환경에서, 또한 요소입니다. 컨트롤 실험 그룹의 무작위 물류는 유리 병 배치와 관련된 적절한 통계 추론에 필요한 바이어스를 완화 할 수 있습니다. 도로주의 깊게 통제 조건은 약간의 차이는 실험 사이에 준수하고 내 - 실험 컨트롤의 사용은 필수적입니다 수 있습니다.
대체 먹이 접근 방법은 모세관 공급 방식 (CAFE 방법) 23 등의 수명 분석을 위해 제안되었습니다. 식품 소비의 정확한 측정을 제공 할 수있는 능력이 방법은 탁월한하지만 현저히 일시적인 파리 24에 결과를 표시합니다. 다이어트 및 전반적인 장수의 유전 적 요인 사이의 결합 관계를 평가할 때 먹이 환경과 관련된 잠재적 인 응력이 고려되어야합니다.
survivorship과 사망률 곡선은 고령화의 역학에 대한 많은 정보를 공개 할 수의 계산을 포함 인구 통계 학적 분석. 전형적인 survivorship 곡선은 초기 삶에서 오랜 기간 동안 상대적으로 평면 남아 낮은 사망률 (F)의 기간에 해당하는 세 연령의 감소의 속도를 증가합니다사망률의 기하 급수적 인 증가의 기간에 의해 ollowed. 스트레스 환경은 인구 survivorship 곡선의 변형 수영의 초기 사망의 초과로 매니페스트 보통 것이다. 이러한 결과는 치료 사이에 상당한 차이를 나타낼 수 있지만, 일반적으로 복제 강력한되지 않습니다. 따라서 우리는 어떤 회사 결론이 그려되기 전에 적어도 두 개의 독립적 인 (즉, 비 동시) 복제 실험 실행하는 것이 좋습니다. 그것은 표본의 크기를 증가 축산 조건을 제어하고, 부모 주식의 건강이 필요합니다 개선 방향이 추가 노력이 될 수 있습니다.
마우스 오른쪽 검열 (실험이 탈출에서 동물을 제거하거나 사고 원인의 사망 추정) 스트레스 환경 조건에서 죽는 동물의는 극단적 인주의 적용해야합니다. 엄밀히 말하자면, 검열은 실험 치료에서 무작위로 발생해야합니다 경우 실험 interventi변조 응력 감도에, 하나는 실수로 인구에 치료 수준의 선택을 적용 할 수 있습니다. 일반적으로, (주로 식품 소스와 연결) 모호한 조기 사망을 생산할 수 요인의 존재를 회피하는 것은 검열보다 더 나은이며, 검열은 물리적 처리하는 동안 죽거나 도망 관찰되었다 생물체에 적용해야합니다.
마지막 고려 사항은 통계적으로 유의미한의 평가입니다. 대형 일대 샘플 크기 트리트먼트 사이의 작은 차이를 구별 할 인상적인 능력을 제공하지만, 이러한 차이의 가능성 생물학적 중요성도 고려되어야합니다. 합리적인 크기의 장수 실험을 통해, 1-2 %의 낮은 차이는 종종 매우 통계적으로 의미가 있지만, 건강 상태에 대한 개입의 전반적인 영향은 사소한 수 있습니다. 실험의 전반적인 결과를 해석 할 때 그러므로, 모두 통계적 및 생물학적 중요성을 고려해야합니다. Infe생존 실험에서 노화 과정에 대한 rence는 능력 25 위장 벽의 무결성 7 등산 등의 행동 또는 생리 건강 대책에 연령 관련 감소의 대책으로 증대 될 수있다.
요약하면, Drosophila 모델 생물 노화의 메커니즘을 연구하기위한 매력적인 선택입니다. 주의 실험 기법을 통해 강력한 인구 통계 학적 분석은 노화 과정에 대한 약리 및 유전 요인의 영향에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 엘리슨 의료 재단 (SDP에서 자금이 지원 된 http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR)와 NIH R01AG030593 (SDP). 이 작품은 P30-AG-013283 (노화의 국립 연구소에 의해 자금 지원을 노화의 생물학에 우수의 나단 충격 센터의 Drosophila 노화 코어 (DAC)의 자원을 활용 http://www.nih.gov/을 ). 저자는 원고의 중요한 읽기에 도움이 토론 및 특히 브라이언 정에 대한 Pletcher 연구소 감사드립니다. 우리는 데이터 수집과 지원을 닉 아셀과 캐서린 Borowicz을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
References
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