CD19 별 키메라 항원 수용체 (자동차)를 표현하는 T 세포는 우리의 첫번째 인 인간 유전자 치료 시험에서 B-세포 malignancies의 investigational 치료로 주입됩니다. 우리는을 사용하여 T 세포의 유전자 변형을 설명<em> 잠자는 숲속의 미녀</em디자이너 CD19 + 인공 항원 제시 세포에 CD19 별 자동차 및 선택적 전파를 소개하는> (SB) 시스템.
임상 급 T 세포의 효력은 종양 – 관련 항원의 탁월한은 (i) 인식 (TAAs), 주입 후 (II) 끈기 (III)의 가능성이있는 생물학적 제품을 처리하기 위해 immunotherapy과 유전자 치료를 조합하여 향상시킬 수 있습니다 종양이 사이트 마이그레이션 및 종양 microenvironment 내에서 효과기 기능을 재활용 (IV) 능력에 대한 잠재적. 인간 응용 프로그램에 대한 설계 T 세포의 유전자 조작에 가장 접근은 차량 1-3의 안정 표현 레트로 바이러스와 lentivirus를 사용했습니다. 이 생산 시설의 제한된 수의에서 임상 수준의 재조합 바이러스의 제조 및 출시에 의존으로이 방법은,하지만 현재 좋은 제조 관행 (GMP)을 준수은 비용이 많이들 수있다. DNA의 종 10분의 1 일 recombin의 비용 약의 임상 학년으로 생성 될 수 있기 때문에 nonviral plasmids의 전자 전송은 전달에 대한 매력적인 대안입니다개미 GMP 수준의 바이러스. 우리가 인간의 응용 4-8에 뷰티 (SB) transposon과 transposase 잠자는 숲속의 적응 통합의 효율성을 향상시킬 수 있도록 지원합니다. 우리 SB 시스템은 관심의 유전자 (CD19RCD28 지정 예 2 차 생성 CD19 특정 자동차 transgene)와 TA의 다이 뉴클레오타이드에 transgene이 9-11를 반복 삽입 transposase (예 : SB11)에 대한 코딩 transposon로 구성이 DNA의 plasmids를 사용 . 우리가 TAA (예 : CD19)뿐만 아니라 T 세포 costimulatory 분자 CD86, CD137L을 표현하도록 수정 K562-파생 인공 항원 제시 세포를 (aAPC) (클론 # 4)을 사용하여 유전자 변형 T 세포의 임상 – 충분한 숫자를 생성하려면 단클론 항체의로드에 대한 인터루킨 (IL) -15 (펩타이드는 수정 IgG4 FC 영역에 융합) 및 CD64 (FC-γ 수용체 1) 막 바인딩 된 버전 (적인 mAb) 12. 이 보고서에서, 우리는 complia에서 수행 할 수있는 절차를 설명과 nce CD19 별 CAR + 인간 응용 프로그램에 적합한 T 세포를 생성 할 수 cGMP. 이것은 γ-방사능 aAPC의 모든 – 7 일 추가 (자극을주기)에 의해 안정 integrants의 검색에 이어 두 DNA의 plasmids, SB transposon (CD19RCD28)와 SB transposase (SB11)의 전자 전달 동기에 의해 달성되었다 (클론 # 4) 수용성 재조합 인간 IL-2 및 IL-21 13의 존재 인치 일반적으로 4 사이클 (연속 문화 28 일)이 안정적으로 차를 표현 T 세포의 임상 – 매력적인 번호를 생성하기 위해 수행됩니다. 제조 임상 급 CD19 특정 T 세포에이 방법론은 말초 혈 (PB) 또는 탯줄 혈액 (UCB)에서 파생 된 T 세포에 적용 할 수 있습니다. 또한이 접근 방식은 aAPC에서 자동차로 인정 TAA, 표현과 소개 자동차의 특이성을 페어링하여 다양한 종양 유형에 대한 T 세포를 생성 할 무력화 할 수 있습니다.
Transposon 및 piggyBac 12,19 및 SB 18,20-22에서와 같은 transposase 시스템, 임상 학년 차의 바이러스로 인한 전달 + T 세포에 대한 대안 유전자 치료에 대한 비 바이러스 성 방법입니다. SB는 인간의 유전자 치료 1,6,23위한 잠재력을 바탕으로 유전자 전달 시스템으로 선정되었습니다. 우리는 SB의 전위 (차를 소개)와 준수 TAA 특정 T 세포의 제조에 플랫폼 기술의 역할을하도록 γ-방사능 aAPC의 재귀 추가 (안정적으로 차를 표현하는 유전자 변형 T 세포를 검색)의 이중 기술을 개발 단계 I / II 시험을위한 cGMP (그림 4)와. γ-방사능 aAPC의 공동 문화 28 일 (4 7 일간 자극을주기) 후, 우리는 일반적으로 인간의 응용 프로그램에 대한 최소한 ~ 10 10 유전자 변형 T 세포가 적절한 생성 할 수 있습니다. 필요에 따라 추가 자극을주기는 t을 수행 할 수 있습니다O 유전자 변형 T 세포의 큰 숫자를 생성합니다. 적은 자동차 + T 세포가 필요한 경우 또한, electroporation 및 전파에 대한 접근 방식은 다시 적은 큐벳을 채용 각의 시작 부분에서 앞으로 aAPC에서 확산의 후속 라운드에 대한 숫자 확대 T 세포의 단지 하위 집합을 들고 크기를 조정 할 수 있습니다 자극주기. 대부분의 electroporated 및 주입 안정적으로 차를 표현을위한 수확 T 세포를 증식. CD4의 가지가 + 및 2 차 생성 차를 표현하는 CD8 + T 세포는 메모리 / 순진한 표현형과 세포를 포함하고 재 감독 특이성 세 특징을 나타냅니다. 첫째, 유전자 변형 T 세포는 특히, 둘째 CD19 + 목표를 lyse CD19 + stimulator 세포에 대한 응답으로 IFN-γ를 생산 그리고 셋째는, CD19에 대한 응답으로 세포 분열 따위에 의해 번식 + 피더 세포, 자동차에 의존 방식으로 13,18의 모든합니다. integr에 대한 우리의 접근 방식SB 시스템에서 비 바이러스 성 DNA의 plasmids의 전자 송금 자동차 transgene을 먹은는 PB와 UCB에서 파생 된 동작 기본 T 세포에서 수행 할 수 있습니다. 우리와 다른 유전자 aAPC 효율적으로 주입 24,25에 대한 T 세포의 임상 – 충분한 숫자를 전파하는 역할을 K562 세포를 수정했습니다. aAPC 및 조직 문화 환경 (예 : IL-21의 추가)을 생성하도록 수정 된 된 환자와 조혈 줄기 세포 이식 후 주입을위한 CD19 특정 T 세포 (표 1) 13,18을 기증 – 파생. 우리는 자동차를 생성 할 수 있습니다 + PB의 T 세포는 단순히 비용, 불편 함, 그리고 apheresis에 의해 PB에서 MNC를 획득 불편을 방지하는 venipuncture하여 얻을. CAR 많은 수의 + MNC의 작은 숫자에서 T 세포를 유도 할 수있는 능력은 특히 allogeneic UCB 이식 후 T 세포를 기적에 호소하고 있습니다. 신생아 기증자의 작은 크기와 익명 재 precludes- 액세스 이후 시점에서이 개인을하고 수확 MNC의 제한된 숫자는 조혈을 방해하지 않도록 T 세포 제조를위한 재료를 시작하기로 사용할 수 있습니다. 제조 공정에 대한 더 진보는 현재 취급을 최소화하기 위해 완전히 폐쇄 WAVE의 생물 반응기와 결합 높은 처리량 electroporation 장치를 포함 진행되고 있습니다. 집계에서 SB와 aAPC는 플랫폼 CD19 별 CAR + cGMP 준수 대체 세포 표면 TAAs를 인식 할 수 유전자 변형 T 세포의 큰 숫자를 생성하도록 구성 할 수 있습니다 T 세포를 생성하는 호소하고 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 도움이 SB 시스템과 관련하여 도움이 aAPC 클론 # 4, 박사 페리 해킷을 (미네소타 대학) 생성 및 제공하는 박사 칼 6 월 (펜실베니아 대학) 감사드립니다.
기금 지원 : 암 센터 코어 그랜트 (CA16672), RO1 (CA124782, CA120956, CA141303), R33 (CA116127), P01 (CA148600), 포자 (CA136411), 앨버트 J 구 재단, 버로우즈 웰컴 기금, Gillson Longenbaugh 재단, 암 예방 텍사스의 연구소, CLL 글로벌 연구 재단, 국방부, Noelan L. Bibler의 부동산, 해리 T. Mangurian, 주니어, 백혈병 Immunotherapy을위한 기금, 개인 암 치료 연구소, 백혈병 및 림프종 학회, 림프종 연구 재단, MDACC의 자매 기관 네트워크 기금, 밀러 재단 씨는 허브 Simon 씨, 씨, 부인 조 H. 저울, 토마스 씨 스콧, 암 연구에 대한 국립 재단, 소아 암 연구 재단, 생산 Assistanc윌리엄 로렌스와 블랜치 휴즈 어린이 재단, 세포 치료 (협정)에 대한 전자.
Reagents | Vendor | Catalogue number | |||||||||||||
Reagents | |||||||||||||||
DNA plasmid expressing GFP (pmaxGFP) | Lonza | VPA-1002 (kit) | |||||||||||||
PBS | Sigma | D8537 | |||||||||||||
CliniMACS PBS-EDTA | Miltenyi Biotec | 70026 | |||||||||||||
HyQ RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30096.01 | |||||||||||||
Phenol Free RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30605.01 | |||||||||||||
Hyclone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007003HI | |||||||||||||
GlutaMAX (100x) | Gibco | 3505-061 | |||||||||||||
Ficoll-Paque | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-02 | |||||||||||||
Recombinant human IL-21 | PeproTech | AF-200-21 | |||||||||||||
Recombinant human IL-2 (Proleukin) | Novartis | NDC 65483-116-07 | |||||||||||||
Human T cell Kit (Nucleofector Solution) | Lonza | VPA-1002 | |||||||||||||
CliniMACS CD56 Reagent | Miltenyi | 70206 | |||||||||||||
FITC-conjugated to mouse mAb specific for human CD3 | BD Biosciences | 349201 | |||||||||||||
APC-conjugated to mouse mAb specific for human CD4 | BD Biosciences | 340443 | |||||||||||||
PerCPCy5.5-conjugated to mouse mAb specific for human CD8 | BD Biosciences | 341051 | |||||||||||||
PE-conjugated to F(ab’)2 fragment of goat antibody specific for human Fcγ | Invitrogen | H10104 | |||||||||||||
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |||||||||||||
Disposables | |||||||||||||||
12-well plate | Corning | 3513 | |||||||||||||
T-75 cm2 flask | Corning | 430641 | |||||||||||||
Culture bags | Vue Life | 290C; 750C | |||||||||||||
50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||
Amaxa Nuceleofector II | Lonza | AAB-1001 | |||||||||||||
Cellometer | Nexcelom Bioscience | Cellometer Vision | |||||||||||||
Sorvall Legend RT Centrifuge | Sorvall | 75004377 | |||||||||||||
BD FACS Calibur | BD Biosciences | 342975 | |||||||||||||
Controlled rate freezer | Planer | Kryo 750 | |||||||||||||
Irradiator | CIS bio International | IBL-437 C#09433 | |||||||||||||
Complete Culture Media (CCM) (stored at 4 °C for up to 30 days) Flow Cytometry Buffer (stored at 4 °C for up to 30 days) |