T-celler uttrykker en CD19-spesifikt chimeric antigen reseptor (CAR) er tilført som utprøvende behandling på B-celle maligniteter i våre første i menneskelige genterapiforsøk. Vi beskriver genetisk modifisering av T-celler ved hjelp<em> Sleeping Beauty</em> (SB)-systemet å innføre CD19-spesifikke CAR og selektiv forplantning på designer CD19 + kunstige antigenpresenterende celler.
Styrken av klinisk-grade T-celler kan forbedres ved å kombinere genterapi med immunterapi å konstruere en biologisk produkt med potensial for overlegen (i) anerkjennelse av tumorassosierte antigener (TAA), (ii) etter infusjon persistens, (iii) potensial for migrering til tumor nettsteder, og (iv) evne til å resirkulere effektorfunksjoner i svulsten mikromiljøet. De fleste tilnærminger til genetisk manipulering av T-celler konstruert for menneskelig bruk har brukt retrovirus og lentivirus for den stabile uttrykk for CAR 1-3. Denne tilnærmingen, selv kompatibel med dagens Good Manufacturing Practice (GMP), kan være dyrt som det er avhengig av produksjon og frigjøring av klinisk-grade rekombinant virus fra et begrenset antall produksjonsanlegg. Elektro-overføring av Nonviral plasmider er en tiltalende alternativ til transduksjon siden DNA arter kan produseres til klinisk klasse ved ca 1/10 th kostnaden for recombinmaur GMP-klasse virus. For å forbedre effektiviteten av integrasjon vi tilpasset Sleeping Beauty (SB) transposon og transposase for menneskelig bruk 4-8. Vår SB systemet bruker to DNA plasmider som består av en transposon koder for et gen av interesse (f.eks 2. generasjons CD19-spesifikk CAR transgenet, betegnet CD19RCD28) og en transposase (f.eks SB11) som setter transgenet inn TA dinucleotide gjentar 9-11 . Å generere klinisk tilstrekkelig antall genmodifiserte T celler bruker vi K562-avledede kunstige antigenpresenterende celler (AAPC) (klon # 4) modifiserte for å uttrykke et TAA (f.eks CD19) så vel som T-celle-costimulatory molekyler CD86, CD137L, en membran-bundet versjon av interleukin (IL) -15 (peptid fusjonert til modifisert IgG4 Fc regionen) og CD64 (Fc-γ reseptor 1) for lasting av monoklonale antistoffer (mAb) 12. I denne rapporten viser vi de prosedyrer som kan gjennomføres i compliance med cGMP å generere CD19-spesifikk CAR + T celler egnet for menneskelig bruk. Dette ble oppnådd ved den synkrone elektro-overføring av to DNA plasmider, en SB transposon (CD19RCD28) og en SB transposase (SB11) etterfulgt av gjenfinning av stabile integrants ved hver-7-dagers tilsetninger (stimulering syklus) av γ-bestrålt AAPC (klone # 4) i nærvær av løselig rekombinant humant IL-2 og IL-21 13. Vanligvis 4 sykluser (28 dager med kontinuerlig kultur) er gjennomført for å generere klinisk tiltalende antall T-celler som stabilt uttrykker CAR. Denne metode for å produksjon klinisk-grade CD19-spesifikke T-celler kan brukes til T-celler avledet fra perifert blod (PB) eller navlestrengsblod (UCB). Videre kan denne tilnærmingen bli brukt til å generere T-celler til ulike tumortyper ved sammenkobling spesifisiteten av introdusert CAR med uttrykk for TAA, anerkjent av bilen, på AAPC.
Transposon og transposase systemer, for eksempel fra piggyBac 12,19 og SB 18,20-22, er ikke-virale tilnærminger til genterapi som er et alternativ til viral-mediert transduksjon av klinisk karakter CAR + T celler. SB ble valgt som genoverføring system basert på dens potensial for menneskelig genterapi 1,6,23. Vi utviklet den doble teknologier for SB transponering (å innføre en CAR) og rekursiv tillegg av γ-bestrålt AAPC (for å hente genmodifiserte T-celler stabilt uttrykker en CAR) til å tjene som plattform teknologier i produksjon av TAA-spesifikke T-celler i samsvar med cGMP for fase I / II-studier (figur 4). Etter 28 dager (fire 7-dagers stimulering sykluser) av co-kulturen på γ-bestrålt AAPC, er vi vanligvis i stand til å generere minst ~ 10 10 genmodifiserte T-celler egnet for menneskelig bruk. Etter behov, kan ytterligere stimulering sykluser foretas to generere større antall genmodifiserte T-celler. Videre, hvis mindre CAR + T-celler er nødvendig, kan tilnærmingen til elektroporering og forplantning skaleres tilbake ansette færre kyvetter og fremføring bare en sub-sett av de tallmessig ekspanderte T-cellene for påfølgende runder av proliferasjonen AAPC ved begynnelsen av hver Stimulering syklus. Flertallet av de electroporated og spres T-celler høstet for infusjon stabilt uttrykke CAR. Den utvekst av CD4 + og CD8 + T-celler som uttrykker vår 2 nd generasjon CAR har celler med et minne / naiv fenotype og viser tre kjennetegnene på re-regisserte spesifisitet. For det første, de genmodifiserte T-celler spesifikt lyse CD19 + mål, dernest produsere IFN-γ respons på CD19 + stimulator celler og for det tredje, spre svar på CD19 + mater celler, alt i en CAR-avhengig måte 13,18. Vår tilnærming til integrertspiste en CAR transgene av elektro-overføring av ikke-virale DNA plasmider fra SB-systemet kan foretas på hvilende primære T celler avledet fra PB og UCB. Vi og andre har genmodifiserte K562 celler for å tjene som AAPC å effektivt forplante klinisk tilstrekkelig antall av T-celler for infusjon 24,25. Den AAPC og vevskultur miljø (f.eks tilsetningen av IL-21) er blitt er blitt modifisert for å generere pasient-og giver-avledet CD19-spesifikke T-celler for infusjon etter hematopoetisk stamcelletransplantasjon (tabell 1) 13,18. Vi kan produsere CAR + T celler fra PB bare oppnås ved venepunksjon som unngår kostnadene, ubehag, og ulemper med å skaffe MNC fra PB ved aferese. Evnen å utlede et stort antall CAR + T celler fra et lite antall MNC er spesielt attraktivt for infusjonen T celler etter allogen UCB transplantasjon. Den lille størrelsen og anonymitet på neonatal donor utelukker re-Tilgang til dette individ ved en senere tidspunkt og kun begrensede antall slaktet MNC er tilgjengelig som utgangsmateriale for T celle produksjon å unngå å forstyrre hematopoiesis. Ytterligere fremskritt i produksjonsprosessen er for tiden i gang med å inkludere en høy gjennomstrømming electroporation enheten kombinert med en helt stengt WAVE bioreaktor for å minimere håndtering. Samlet, er SB og AAPC tiltalende plattformer for å generere CD19-spesifikk CAR + T-celler som kan tilpasses for å generere et stort antall genmodifiserte T-celler som kan gjenkjenne alternative celle-overflate TAA i samsvar med cGMP.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke dr. Carl juni (University of Pennsylvania) for å få hjelp generere og gi AAPC klone # 4 og Dr. Perry Hackett (University of Minnesota) for å få hjelp med SB-systemet.
Grant støtte: Cancer Center Kjerne Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411); Albert J Ward Foundation; Burroughs Wellcome fondet, Gillson Longenbaugh Foundation; Cancer Prevention og Research Institute of Texas, CLL Global Research Foundation; Department of Defense, Estate of Noelan L. Bibler, Harry T. Mangurian, Jr, Fond for leukemi Immunterapi, Institute of Personalized Cancer Therapy, leukemi og lymfom Society, lymfom Research Foundation; MDACC søster Institution Network fondet, Miller Foundation; Mr. Herb Simons, Mr. og Mrs. Joe H. Scales, Mr. Thomas Scott, Utsmykkingsfondet for Cancer Research, Pediatric Cancer Research Foundation; Produksjon assistance for Cellular Terapi (PACT), William Lawrence og Blanche Hughes Barnas Foundation.
Reagents | Vendor | Catalogue number | |||||||||||||
Reagents | |||||||||||||||
DNA plasmid expressing GFP (pmaxGFP) | Lonza | VPA-1002 (kit) | |||||||||||||
PBS | Sigma | D8537 | |||||||||||||
CliniMACS PBS-EDTA | Miltenyi Biotec | 70026 | |||||||||||||
HyQ RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30096.01 | |||||||||||||
Phenol Free RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30605.01 | |||||||||||||
Hyclone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007003HI | |||||||||||||
GlutaMAX (100x) | Gibco | 3505-061 | |||||||||||||
Ficoll-Paque | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-02 | |||||||||||||
Recombinant human IL-21 | PeproTech | AF-200-21 | |||||||||||||
Recombinant human IL-2 (Proleukin) | Novartis | NDC 65483-116-07 | |||||||||||||
Human T cell Kit (Nucleofector Solution) | Lonza | VPA-1002 | |||||||||||||
CliniMACS CD56 Reagent | Miltenyi | 70206 | |||||||||||||
FITC-conjugated to mouse mAb specific for human CD3 | BD Biosciences | 349201 | |||||||||||||
APC-conjugated to mouse mAb specific for human CD4 | BD Biosciences | 340443 | |||||||||||||
PerCPCy5.5-conjugated to mouse mAb specific for human CD8 | BD Biosciences | 341051 | |||||||||||||
PE-conjugated to F(ab’)2 fragment of goat antibody specific for human Fcγ | Invitrogen | H10104 | |||||||||||||
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |||||||||||||
Disposables | |||||||||||||||
12-well plate | Corning | 3513 | |||||||||||||
T-75 cm2 flask | Corning | 430641 | |||||||||||||
Culture bags | Vue Life | 290C; 750C | |||||||||||||
50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||
Amaxa Nuceleofector II | Lonza | AAB-1001 | |||||||||||||
Cellometer | Nexcelom Bioscience | Cellometer Vision | |||||||||||||
Sorvall Legend RT Centrifuge | Sorvall | 75004377 | |||||||||||||
BD FACS Calibur | BD Biosciences | 342975 | |||||||||||||
Controlled rate freezer | Planer | Kryo 750 | |||||||||||||
Irradiator | CIS bio International | IBL-437 C#09433 | |||||||||||||
Complete Culture Media (CCM) (stored at 4 °C for up to 30 days) Flow Cytometry Buffer (stored at 4 °C for up to 30 days) |