T细胞表达CD19-特异性嵌合抗原受体(CAR)被注入我们的第一个人类基因治疗试验中研究治疗B细胞恶性肿瘤。我们描述了使用基因改造的T细胞<em>睡美人</em(SB)系统地介绍具体的CD19-CAR和选择性传播的名牌CD19 +人工抗原提呈细胞。
临床级T细胞的效力,可以提高结合基因治疗,免疫治疗造出一种生物制品与潜在的优越的(ⅰ)识别的肿瘤相关抗原(TAAS),(ⅱ)持续输注后,(ⅲ)迁移到肿瘤部位,及(iv)能够回收的效应功能,在肿瘤微环境的潜力。大多数T细胞工程为人类应用遗传操作方法使用逆转录病毒和慢病毒的稳定表达CAR 1-3。这种方法虽然符合现行良好生产规范(GMP),可以是昂贵的,因为它依赖于临床级的重组病毒数量有限的生产设施的制造和释放。由于DNA物种可以产生临床级在约1/10的成本尿激酶原,电转移的非病毒质粒是一个有吸引力的替代转导蚂蚁GMP级的病毒。为了提高效率的整合,我们人类应用4-8适应睡美人 (SB)转座子和转。我们的SB系统使用两个DNA包含编码感兴趣的基因( 例如, 第二代CD19-特异性CAR转基因,CD19RCD28指定)和一个转座( 例如,SB11)的转基因插入到TA二核苷酸重复9-11转座子的质粒。要生成临床足够数量的转基因的T细胞中,我们使用K562-衍生的人工抗原呈递细胞(人工APC)(克隆#4)修饰以表达一个TAA( 例如 CD19)以及T细胞共刺激分子CD86和CD137L,一个膜结合版本的白细胞介素(IL)-15(肽融合改良的IgG4 Fc区域)和CD64(FC-γ受体1)为加载的单克隆抗体(单抗)12。在这份报告中,我们将演示程序,可以进行compliaNCE与cGMP产生特定的CAR + CD19-T细胞适合人类应用。这是通过两个DNA质粒,一个SB的座子(CD19RCD28)和稳定的整合体通过检索一个SB转座(SB11),然后每7天增加(刺激周期),γ-照射人工APC同步电转移(克隆#4)的存在下,可溶性重组人IL-2和IL-21的13。通常为4个周期(28天连续培养)进行稳定表达CAR的T细胞,产生临床上有吸引力的数字。可以应用这种方法来制造的临床级CD19-特异性T细胞衍生的T细胞从外周血(PB)或脐带血(UCB)。此外,这种方法可以被利用来产生不同类型的肿瘤的T细胞配对的特殊性,介绍了车载表达的TAA,通过CAR的认可,在人工APC。
转座子和转座系统,如从piggyBac转12,19和SB 18,20-22,非病毒性的基因治疗的方法,是一个替代病毒临床级CAR + T细胞介导的转导。其潜在的人类基因治疗1,6,23的基因转移系统的基础上被选择了作为对SB。我们开发的SB换位(引入一个CAR)和递归添加γ照射人工APC(检索转基因的T细胞的稳定表达一个CAR)作为符合TAA-特异性T细胞在制造平台技术的双重技术与cGMP的I / II期临床试验( 图4)。 γ照射人工APC上共培养28天(4 7天刺激周期)后,我们通常能够生成适合人类应用至少〜10 10转基因的T细胞。根据需要,可以进行额外的刺激周期吨Ø产生大量的转基因T细胞。此外,如果需要更少CAR + T细胞,电穿孔和传播的方法可以被缩减雇用较少的比色皿和弘扬只是一个在开始时,每个子集的数值扩展的T细胞增殖对人工APC随后的几轮刺激周期。大部分的电穿孔,并传播的T细胞输注稳定表达的CAR收获。的产物,CD4 +和CD8 + T细胞表达我们的第二代车包括内存/天真的表型的细胞,并表现出三个特点重新定向的特异性。首先,转基因的T细胞的具体裂解CD19 +的目标,第二,响应于CD19 +刺激细胞产生IFN-γ,和,第三,增殖响应于CD19 +饲养细胞,所有在CAR-依赖性13,18。我们的方法结合吃了转基因CAR通过电子转移的非病毒DNA质粒的SB系统,可以进行静态主要来自PB和UCB的T细胞。我们和其他转基因K562细胞作为AAPC有效地传播的临床足够数量的T细胞输注24,25。人工APC和组织文化环境( 例如增加了IL-21)已被修改,以产生患者和供体来源的CD19-特异性T细胞输注造血干细胞移植后( 表1)13,18。我们可以生产汽车+ T细胞PB简单地通过静脉穿刺,避免了由单采获得MNC从PB的成本,不适和不便。注入同种异基因脐血移植后T细胞的能力获得大量的CAR + T细胞,少量的跨国公司特别有吸引力。体积小,不愿透露姓名的新生儿捐助防止再访问这个人在以后的时间点,只有数量有限的收获MNC可作为起始原料制造T细胞与造血,以避免干扰。制造过程中的进一步前进到目前正在进行中包括一个高吞吐量加上一个完全封闭的WAVE生物反应器,以尽量减少处理的电穿孔的移动设备。骨料,SB和人工APC呼吁平台以产生CD19-特异性CAR + T细胞,可以适于以产生大量的转基因的T细胞可识别细胞表面的替代TAAS符合cGMP。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢卡尔博士6月(宾夕法尼亚大学),帮助和提供帮助的SB系统的人工APC的克隆#4和Perry博士哈克特(明尼苏达大学)。
格兰特支持:癌症中心的核心格兰特(CA16672); RO1(CA124782,CA120956,CA141303),R33(CA116127),P01(CA148600); SPORE(CA136411);Ĵ区伟业基金,宝来惠康基金;吉尔森Longenbaugh基金;癌症预防研究所得克萨斯州CLL全球研究基金会,国防部的Noelan L. Bibler房地产哈里T Mangurian,小,基金白血病免疫治疗研究所的个性化癌症治疗白血病和淋巴瘤协会淋巴瘤研究基金会; MDACC的姊妹机构网络基金,米勒基金会;先生香草西门子;先生和夫人乔H.秤;托马斯·斯科特先生,美国国家癌症研究基金会;儿科癌症研究基金会;生产AssistancE细胞疗法(PACT),威廉·劳伦斯和布兰奇·休斯儿童的基金会。
Reagents | Vendor | Catalogue number | |||||||||||||
Reagents | |||||||||||||||
DNA plasmid expressing GFP (pmaxGFP) | Lonza | VPA-1002 (kit) | |||||||||||||
PBS | Sigma | D8537 | |||||||||||||
CliniMACS PBS-EDTA | Miltenyi Biotec | 70026 | |||||||||||||
HyQ RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30096.01 | |||||||||||||
Phenol Free RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30605.01 | |||||||||||||
Hyclone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007003HI | |||||||||||||
GlutaMAX (100x) | Gibco | 3505-061 | |||||||||||||
Ficoll-Paque | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-02 | |||||||||||||
Recombinant human IL-21 | PeproTech | AF-200-21 | |||||||||||||
Recombinant human IL-2 (Proleukin) | Novartis | NDC 65483-116-07 | |||||||||||||
Human T cell Kit (Nucleofector Solution) | Lonza | VPA-1002 | |||||||||||||
CliniMACS CD56 Reagent | Miltenyi | 70206 | |||||||||||||
FITC-conjugated to mouse mAb specific for human CD3 | BD Biosciences | 349201 | |||||||||||||
APC-conjugated to mouse mAb specific for human CD4 | BD Biosciences | 340443 | |||||||||||||
PerCPCy5.5-conjugated to mouse mAb specific for human CD8 | BD Biosciences | 341051 | |||||||||||||
PE-conjugated to F(ab’)2 fragment of goat antibody specific for human Fcγ | Invitrogen | H10104 | |||||||||||||
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |||||||||||||
Disposables | |||||||||||||||
12-well plate | Corning | 3513 | |||||||||||||
T-75 cm2 flask | Corning | 430641 | |||||||||||||
Culture bags | Vue Life | 290C; 750C | |||||||||||||
50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||
Amaxa Nuceleofector II | Lonza | AAB-1001 | |||||||||||||
Cellometer | Nexcelom Bioscience | Cellometer Vision | |||||||||||||
Sorvall Legend RT Centrifuge | Sorvall | 75004377 | |||||||||||||
BD FACS Calibur | BD Biosciences | 342975 | |||||||||||||
Controlled rate freezer | Planer | Kryo 750 | |||||||||||||
Irradiator | CIS bio International | IBL-437 C#09433 | |||||||||||||
Complete Culture Media (CCM) (stored at 4 °C for up to 30 days) Flow Cytometry Buffer (stored at 4 °C for up to 30 days) |