T-celler som uttrycker en CD19-specifik chimär antigenreceptor (CAR) är infunderas som undersökning behandling av B-cells maligniteter i vår första-i-humana genterapiförsök. Vi beskriver genetisk modifiering av T-celler med användning av<em> Törnrosa</em> (SB) för att införa CD19-specifik CAR och selektiv förökning på designern CD19 + artificiella antigenpresenterande celler.
Potensen av kliniska-grade T-celler kan förbättras genom att kombinera genterapi med immunterapi att konstruera en biologisk produkt med potential för överlägsen (i) erkännande av tumörassocierade antigener (TAA), (ii) beständighet efter infusion, (iii) potential för migrering till tumörställen, och (iv) förmåga att återvinna effektorfunktioner i tumören mikromiljön. De flesta metoder för genetisk manipulation av T-celler konstruerade för tillämpning på människor har använt retrovirus och lentivirus för stabilt uttryck av CAR 1-3. Detta tillvägagångssätt, men följer gällande god tillverkningssed (GMP), kan bli dyrt eftersom det bygger på tillverkning och utsläpp av klinisk kvalitet rekombinant virus från ett begränsat antal produktionsanläggningar. Den elektro-överföring av icke-virala plasmider är en tilltalande alternativ till transduktion eftersom DNA arter kan produceras till klinisk kvalitet vid ca 1/10: e kostnaden för recombinant GMP-kvalitet viruset. För att effektivisera integrationen vi anpassade för användning på människa 4-8 Törnrosa (SB) transposon och transposas. Vårt SB systemet använder två DNA-plasmider som består av en transposon som kodar för en gen av intresse (t.ex. 2: a generationens CD19-specifik CAR transgen betecknad CD19RCD28) och ett transposas (t.ex. SB11) som infogar transgenen till TA dinukleotid upprepar 9-11 . För att generera kliniskt tillräckligt antal genetiskt modifierade T-celler som vi använder K562-härledda artificiella antigenpresenterande celler (AAPC) (klon # 4) modifierade för att uttrycka en TAA (t.ex. CD19) samt T-cell molekylerna samstimulerande CD86, CD137L, en membranbundna versionen av interleukin (IL) -15 (peptid fuserad till modifierade lgG4 Fc-region) och CD64 (Fc-γ-receptor 1) för lastning av monoklonala antikroppar (mAb) 12. I denna rapport visar vi de förfaranden som kan utföras i compliance med cGMP att generera CD19-specifik CAR + T-celler som är lämpliga för användning på människa. Detta uppnåddes genom den synkrona elektro-överföring av två DNA-plasmider, en SB transposon (CD19RCD28) och en SB transposas (SB11) följt av återvinning av stabila integranter genom varje-7-dagars tillsatser (stimulering cykel) av γ-bestrålade AAPC (klon # 4) i närvaro av löslig rekombinant humant IL-2 och IL-21 13. Typiskt 4 cykler (28 dagars kontinuerlig odling) genomförs för att generera kliniskt tilltalande antal T-celler som stabilt uttrycker CAR. Denna metod för tillverkning klinisk-grade CD19-specifika T-celler kan användas för T-celler härledda från perifert blod (PB) eller navelsträngsblod (UCB). Dessutom kan denna metod utnyttjas för att generera T-celler till olika tumörtyper genom att para ihop den särskilda karaktären hos den införda bilen med uttryck av TAA, erkänd av bilen, på AAPC.
Transposon och transposas system, såsom från piggyBac 12,19 och SB 18,20-22, är icke-virala metoder för genterapi som är ett alternativ till viralt medierad transduktion av klinisk kvalitet CAR + T-celler. SB valdes som genöverföring baserat på dess potential för human genterapi 1,6,23. Vi utvecklade de dubbla teknologier SB införlivande (att införa en bil) och rekursiv tillsättning av γ-bestrålade AAPC (att hämta genetiskt modifierade T-celler som stabilt uttrycker en bil) för att tjäna som plattform teknik i tillverkningen av TAA-specifika T-celler i enlighet med cGMP för fas I / II-studier (Figur 4). Efter 28 dagar (fyra 7-dagars stimulering cykler) av samodling på γ-bestrålade AAPC är vi vanligtvis kan generera minst ~ 10 10 genetiskt modifierade T-celler som lämpar sig för användning på människor. Vid behov kan ytterligare stimulans cykler genomföras to skapa större antal genetiskt modifierade T-celler. Dessutom, om mindre CAR + T-celler behövs, kan inställning till elektroporering och förökning skalas tillbaka anställa färre kyvetter och överföring bara en delmängd av de numeriskt expanderade T-celler för efterföljande omgångar av proliferation på AAPC i början av varje Stimulering cykel. Majoriteten av elektroporerades och fortplantas T-celler som skördats för infusion stabilt uttrycka CAR. Den utväxt av CD4 + och CD8 + T-celler som uttrycker våra 2 CAR andra generationens inkluderar celler med ett minne / naiv fenotyp och uppvisar tre kännetecken omdirigeras specificitet. För det första genetiskt modifierade T-cellerna lyserar specifikt CD19 + mål, dels producera IFN-γ som svar på CD19 + stimulatorceller och tredje proliferera som svar på CD19 + matarceller, allt i en CAR-beroende sätt 13,18. Vårt förhållningssätt till integråt en CAR transgen genom elektro-överföring av icke-virala DNA plasmider från SB-systemet kan ske i vilande primära T-celler som härrör från PB och UCB. Vi och andra har modifierats genetiskt K562 celler att fungera som AAPC att effektivt sprida kliniskt tillräckligt antal T-celler för infusion 24,25. Den AAPC och vävnadsodling miljö (t.ex. tillägg av IL-21) har har modifierats för att generera patient-och donor-härledda CD19-specifika T-celler för infusion efter hematopoetisk stamcellstransplantation (tabell 1) 13,18. Vi kan producera CAR + T-celler från PB enkelt erhålles genom venpunktion som undviker kostnaden, obehag och besvär att få MNC från PB genom aferes. Förmågan att härleda ett stort antal CAR + T-celler från ett litet antal MNC är särskilt tilltalande för infusion T-celler efter allogen UCB transplantation. Den lilla storleken och anonymitet den neonatala givaren utesluter re-Åtkomst denna person vid ett senare tidpunkt och endast ett begränsat antal skördade MNC finns som utgångsmaterial för T-cell tillverkning för att undvika att störa blodbildningen. Ytterligare förskott till tillverkningsprocessen pågår för närvarande för att inkludera en hög enhet genomströmning elektroporation kombination med en helt stängd WAVE bioreaktor för att minimera hanteringen. Sammanlagt är SB och AAPC tilltalande plattformar för att skapa CD19-specifik CAR + T-celler som kan anpassas för att skapa stora mängder genetiskt modifierade T-celler som kan känna igen alternativa cellytan TAA i enlighet med cGMP.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Carl juni (University of Pennsylvania) för att få hjälp att generera och ge AAPC klon # 4 och Dr Perry Hackett (University of Minnesota) för att få hjälp med SB-systemet.
Bidragsstöd: Cancer Center Kärna Grant (CA16672), RO1 (CA124782, CA120956, CA141303), R33 (CA116127), P01 (CA148600), SPORE (CA136411), Albert J Ward Foundation, Burroughs Wellcome Fund, Gillson Longenbaugh Foundation, Cancer Prevention och Forskningsinstitut Texas, CLL Global Research Foundation, försvarsdepartementet, dödsbo Noelan L. Bibler, Harry T. Mangurian, Jr, fonden för leukemi immunterapi, Institutet för Personlig Cancer Therapy, leukemi och lymfom Society, Lymfom Research Foundation; MDACC Syster Institution Network fonden, Miller Foundation, Mr Herb Simons, Mr och Mrs Joe H. Vågar, Thomas Scott, Nationella stiftelsen för cancerforskning, barncancer Research Foundation, Produktion assistance för cellulära terapier (Pact), William Lawrence och Blanche Hughes Barnens Foundation.
Reagents | Vendor | Catalogue number | |||||||||||||
Reagents | |||||||||||||||
DNA plasmid expressing GFP (pmaxGFP) | Lonza | VPA-1002 (kit) | |||||||||||||
PBS | Sigma | D8537 | |||||||||||||
CliniMACS PBS-EDTA | Miltenyi Biotec | 70026 | |||||||||||||
HyQ RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30096.01 | |||||||||||||
Phenol Free RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30605.01 | |||||||||||||
Hyclone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007003HI | |||||||||||||
GlutaMAX (100x) | Gibco | 3505-061 | |||||||||||||
Ficoll-Paque | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-02 | |||||||||||||
Recombinant human IL-21 | PeproTech | AF-200-21 | |||||||||||||
Recombinant human IL-2 (Proleukin) | Novartis | NDC 65483-116-07 | |||||||||||||
Human T cell Kit (Nucleofector Solution) | Lonza | VPA-1002 | |||||||||||||
CliniMACS CD56 Reagent | Miltenyi | 70206 | |||||||||||||
FITC-conjugated to mouse mAb specific for human CD3 | BD Biosciences | 349201 | |||||||||||||
APC-conjugated to mouse mAb specific for human CD4 | BD Biosciences | 340443 | |||||||||||||
PerCPCy5.5-conjugated to mouse mAb specific for human CD8 | BD Biosciences | 341051 | |||||||||||||
PE-conjugated to F(ab’)2 fragment of goat antibody specific for human Fcγ | Invitrogen | H10104 | |||||||||||||
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |||||||||||||
Disposables | |||||||||||||||
12-well plate | Corning | 3513 | |||||||||||||
T-75 cm2 flask | Corning | 430641 | |||||||||||||
Culture bags | Vue Life | 290C; 750C | |||||||||||||
50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||
Amaxa Nuceleofector II | Lonza | AAB-1001 | |||||||||||||
Cellometer | Nexcelom Bioscience | Cellometer Vision | |||||||||||||
Sorvall Legend RT Centrifuge | Sorvall | 75004377 | |||||||||||||
BD FACS Calibur | BD Biosciences | 342975 | |||||||||||||
Controlled rate freezer | Planer | Kryo 750 | |||||||||||||
Irradiator | CIS bio International | IBL-437 C#09433 | |||||||||||||
Complete Culture Media (CCM) (stored at 4 °C for up to 30 days) Flow Cytometry Buffer (stored at 4 °C for up to 30 days) |