Staphylococcus aureus Vekst med humant hemoglobin som en Iron Source

Summary

Her beskriver vi en vekst analysen for

Abstract

S. aureus er en sykdomsfremkallende bakterie som krever jern til å utføre livsviktige metabolske funksjoner og forårsake sykdom. Det mest rikelig reservoar av jern inne i menneskekroppen verten er heme, som er kofaktor av hemoglobin. Å tilegne seg jern fra hemoglobin, S. aureus benytter et omfattende system kjent som jern-regulert overflate determinant (ISD) system ^1. Komponenter i ISD systemet først bind vert hemoglobin, deretter pakke og importere heme, og til slutt frigjøre jernet fra heme i den bakterielle cytoplasma ^2,3. Denne veien er dissekert gjennom mange in vitro studier ^4-9. Videre har bidraget fra den ISD system for smitte gjentatte ganger blitt demonstrert i musemodeller ^8,10-14. Etablering bidraget fra den ISD systemet til hemoglobin-avledet jern oppkjøp og vekst har vist seg å være mer utfordrende. Vekst analyser ved hjelp hemoglobin som eneste jernkilde er komplisert by ustabiliteten av kommersielt tilgjengelig hemoglobin, forurensende fritt jern i vekstmediet, og toksisitet forbundet med jern chelatorer. Her presenterer vi en metode som overvinner disse begrensningene. Høykvalitative hemoglobin fremstilt fra friskt blod og lagres i flytende nitrogen. Renset hemoglobin er supplert til jern-deplete medium etterligne jern-dårlig miljø møtt av patogener inne i virveldyr vert. Ved å sulte S. aureus av fri jern og supplere med en minimal manipulert form av hemoglobin vi indusere vekst på en måte som er helt avhengig av evnen til å binde hemoglobin, trekke heme, passere heme gjennom bakteriecellen konvolutten og degradere heme i cytoplasma. Denne analysen vil være nyttig for forskere som søker å belyse mekanismene for hemoglobin-/heme-derived jern oppkjøp i S. aureus og muligens andre bakterielle patogener.

Protocol

1. Rensing av Hemoglobin fra Fresh Blood

1. Erverve frisk menneskeblod supplert med en antikoagulant. Hold blod på is eller ved 4 ° C i hele rensing.
2. Sentrifuger blod i 20 minutter ved 1500 x g. De røde blodceller (RBC), vil være på bunnen av røret. Nøye Aspirer supernatanten og forsiktig resuspender pelleten i iskald 0,9% (w / v) NaCl-oppløsning. Gjenta sentrifugeringen og vask 3 ganger.
3. Resuspender pelleten i en volum iskald 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Dette vil indusere lysering av RBCs grunnet osmotiske trykket. Legg toluen til ~ 20% endelig volum.
4. Inkuber ved 4 ° C på en rotisserie natten.
5. Sentrifuger lysatet ved 20.000 xg i 1 time. Samle midten hemolysat brøkdel forlater toluen (flytende på toppen) og pellet urørt. Bruk en lang hals pipette for å samle midten fraksjonen.
6. Passere gjennom 0,44 mikrometer sprøyte filter. Hvis oppløsningen inneholder partikkelformigesaken og kan ikke overføres gjennom filteret, gjenta trinn 1.5.
7. Rens hemoglobin (Hb) med en høy-ytelse væskekromatografi (HPLC) anionbytte kolonne (Varian, PL-SAX 1.000 A 8 um, 150 mm x 4,6 mm). Mobil fase A er 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og mobil fase B er 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. A 0% -100% stigning av løsemiddel B er kjørt over 2 min på 2,0 ml / min flow rate. Elueringen overvåkes basert på absorpsjon (λ: 410 nm og 280 nm). Samler bare brøken karakterisert ved en lys rød farge og en fremtredende absorpsjonstopp (Figur 1).
8. Dialyser elueringen mot fosfat-bufret saltvann (PBS) over natten og deretter i noen timer på nytt. Steriliser ved å passere gjennom et 0,22 um sprøytefilter.
9. For å måle konsentrasjonen Hb, forberede standard Hb oppløsninger av kjente konsentrasjoner i PBS. Bestemme konsentrasjonen av Hb i prøven ved å blande standardløsningene (se tabellen med reagenser ossed) eller prøveløsningen med 2x Drabkin reagens (fremstilt fra pulver) i forholdet 1:1. For eksempel, bland 100 ul Hb løsning med 100 ul 2x Drabkin reagens i 96-brønners plater. Inkuber i 15 min og måle absorbans ved 540 nm. Plotte en standardkurve og bestem Hb-konsentrasjon i prøven. Fem til femten mg / ml avlingene er typiske.
10. Kjør 15-20 mikrogram renset hemoglobin på en 15% SDS-PAGE i to eksemplarer. Stain en av gelene, overføre proteiner fra en annen gel på en nitrocellulosemembran og immunoblotanalyse for hemoglobin (figur 2).
11. Fryse og lagre 1 ml alikvoter av hemoglobin i flytende nitrogen.

2. Utarbeidelse av Iron-bryter vekstmedier

1. Forbered Roswell Park Memorial Institute (RPMI) kjøttkraft ved å løse den RPMI pulver i vann, tilsett natriumbikarbonat som anbefalt av produsenten og 1% cassamino syrer (CA) (w / v). Steriliser ved å passere gjennom et 0,2 mikrometer filter og lagre refrigrerte.
2. Forbered metall-fratatte RPMI (NRPMI) ved tilsetning 7% (w / v) Chelex 100 og blande over natten på en røre plate. Fjern Chelex 100 ved å passere gjennom en 0,2 um filter og lagre nedkjølt. Supplere media med essensielle strykefrie metaller: 25 mikrometer ₂ ZnCl, 25 mikrometer ₂ MnCl, 100 mM CaCl ₂ og 1 mm MgCl ₂ forberedt på forhånd som en steril 1,000 x løsning. Bruk engangs plastbeholdere for dette trinnet for å unngå jern forurensning fra gjenbrukbare forsyninger.

3. Staphylococcus aureus Vekst hjelp Hemoglobin som Sole jernkilde

1. Streak S. aureus for isolering på tryptisk soya-agar (TSA) fra en frosset lager. Inkuber ved 37 ° C i 20-24 timer.
2. Gjensuspender etylendiamin-N, N'-bis (2-hydroxyphenylacetic syren) (EDDHA) i vannfri etanol til 100 mM. EDDHA går ikke i oppløsning, men er sterilisert med etanol.
3. Legg EDDHA til RPMI til en sluttkonsentrasjon på 0,5 mM. TillatEDDHA å oppløse minst 30 min før du går videre til neste trinn. Grunnet batch-til-batch variasjon, kan endelig EDDHA konsentrasjonen må senkes til 0,25 mm for å kunne bakterievekst.
4. Vaksinere enkelt kolonier av S. aureus i 5 ml RPMI inneholdende EDDHA i 15 ml skrukork koniske rør. Inkuber ved 37 ° C med risting ved 180 rotasjoner per minutt (opm) i 16 til 20 timer.
5. Sentrifuger overnatter kulturer for 5 min på 7500 xg og resuspender pelleten i NRPMI inneholder 0,5 mM EDDHA. Normalisere OD ₆₀₀ til ~ 3.
6. Forbered NRPMI inneholdende 2,5 mikrogram per ml Hb og 0,1 til 1,0 mM EDDHA. Grunnet variasjon batchene kan EDDHA konsentrasjon som kreves for å chelatere fri jern i NRPMI variere.
7. Subkultur 10 pl bakteriesuspensjon fra trinn 3,5 til 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb i et 15 ml skrue-cap konisk tube.
8. Inkuber kulturer ved 37 ° C i opp til 48 hr med rysting ved 180 rpm, eller på en rullende trommel.
600 avlesninger ved å fjerne 50 pl av kulturen og blande den med 150 ul PBS i 96-brønners plater.

Representative Results

Vi har renset humant hemoglobin fra hemolysat med HPLC (Protokoll trinn 1.7). Figur 1 viser registrert absorbansen eluatet ved 280 og 410 nm bølgelengder. Fraksjon 5 ble oppsamlet og andre fraksjoner ble kassert. Avlingene av 5-15 milligram hemoglobin per milliliter eluat er vanligvis ervervet. Renset hemoglobin ble analysert ved SDS-PAGE i duplikat og gelene ble enten farget for proteiner eller overføres på nitrocellulose og immunoblotted (Protokoll trinn 1,10, figur 2).

Vi har vurdert muligheten av renset humant hemoglobin å støtte veksten av villtype S. aureus og S. aureus som mangler ISDB komponenten av ISD systemet (Δ ISDB). ISDB er hemoglobin reseptor som er nødvendig for hemoglobin-avledet jern oppkjøpet ^12. Villtype og Δ ISDB ble dyrket i jern-utarmet medium supplert med menneskelig hemog lobin (NRPMI + EDDHA + Hb) som beskrevet i pkt. 3 i protokollen. Når dyrket i NRPMI + EDDHA + Hb, villtype men ikke Δ ISDB er i stand til å spre som indikert av en økning i optisk tetthet av kulturer over tid (figur 3A). I kontrast, er evnen til å utnytte supplert gratis jern (+ FeCl ₃₎ identiske i villtype og Δ ISDB (figur 3B). Verken villtype nor Δ ISDB sprer i fravær av en jern-kilde (figur 3B).

Vi har sammenlignet veksten av S. aureus i NRPMI + EDDHA supplert med hemoglobin renset fra friskt blod eller lyofilisert hemoglobin. Figur 4 viser at mens hemoglobin renset fra blodet krever ISDB for vekst, gjør lyofilisert hemoglobin spredning av Δ ISDB.

s/ftp_upload/50072/50072fig1.jpg "/>
Figur 1. Absorpsjon av elueringen fraksjonene under hemoglobin rensning. Absorpsjon ved 410 nm (bestemt til heme-bindende proteiner) og 280 nm (karakteristisk for alle proteiner) ble overvåket hele eluering. Fraksjon nummer fem inneholdt hemoglobin og ble samlet.

Figur 2. Renset humant hemoglobin Tjue mikrogram renset hemoglobin ble separert ved hjelp av denaturerende 15% SDS-PAGE. A. Gel farges for proteiner med Bio-Rad protein-analysen fargestoff reagens. B. nitrocellulosemembran immunoblotted for hemoglobin. Den intense lavere band er en hemoglobin monomer, mens de mer svak øvre band er hemoglobin dimer og tertramers, som ikke får helt denaturert.

/ Ftp_upload/50072/50072fig3.jpg "/>
Figur 3. Bruk av humant hemoglobin som jernkilde av S. aureus A. Vekst av vill type (wt) eller Isogene hemoglobin reseptor ISDB mutant (Δ ISDB) i NRPMI supplert med jern chelator EDDHA og menneskelig hemoglobin er statistisk forskjellig som bestemmes av Student tosidige t test, p <0,05. B. Vekst i NRPMI supplert med 10 uM jernklorid (+ FeCl ₃₎ eller EDDHA (-FeCl ₃₎ ikke er forskjellig mellom WT og Δ ISDB. Grafer skildre data fra et representativt eksperiment, som omfattet tre biologiske replikater. Feilfelt betegne standardavviket optisk tetthet målinger på angitte tidspunkter mellom replikater.

Figur 4. Vekst av villtype (wt) eller Isogene hemoglobin reseptor mutant (Δ ISDB) i media supplert med hemoglobin renset fra friskt blod eller lyofilisert hemoglobin. Grafen viser data fra et representativt eksperiment, som omfattet tre biologiske replikater. Feilfeltene representerer standardavviket optisk tetthet målinger på angitte tidspunkter mellom replikater. Asterisker betegne verdier som er statistisk forskjellig som bestemmes av Student tosidige t test, p <0,05.

Discussion

Jern er et essensielt næringsstoff som kreves av organismer fra alle riker livet ^15. I virveldyr, blir jern sequestered å unngå toksisitet forårsaket av dette elementet. Denne deponering skjuler også jern fra invaderende mikrober i en prosess som kalles ernæringsmessig immunitet ^16. Som svar har patogener utviklet strategier som omgår ernæringsmessige immunitet. En slik mekanisme er avhengig hemoglobin, som er den mest rikelig kilde til jern i verten ^17. Hemoglobin er inneholdt i røde blodlegemer. Hemoglobin frigitt fra skadede røde blodceller er bundet av vert haptoglobin, som signaliserer rask fjerning av haptoglobin-hemoglobin komplekser av makrofager ^18. For å få tilgang til hemoglobin, S. aureus uttrykker hemolysins at Lyse røde blodceller ^19. Haptoglobin-indusert hemoglobin fjerning motsvares av høy affinitet binding av hemoglobin ved celleoverflatereseptorer uttrykt av 20.

Tallrike studier har vist at bidraget fra ISD-systemet for smitte ^8,10-14. Videre har biokjemiske studier tilordnet funksjonene til dets enkelte komponenter i hemoglobin-avledet jern oppkjøpet ^4-9. Her beskriver vi en assay som overvåker veksten av S. aureus med hemoglobin som eneste kilde til tilgjengelige jern. I denne forbindelse må vi påpeke enkelte forhold som er avgjørende for å lykkes med forsøket.

Kvalitet og type av reagenser som benyttes i hemoglobin-avledet jern vekst gjennom oppkjøp analyser kan dramatisk påvirke resultatene obtained i disse analysene. I motsetning til hemoglobin innhentet fra friskt blod, hemoglobin som er lagret i lyofilisert form tillater bakteriell vekst uavhengig av komponentene ISD systemet (figur 4) ^21. Dette er sannsynligvis på grunn av endringer i strukturen av hemoglobin som er forårsaket av lyophylization. Spesifikt inneholder lyofilisert hemoglobin tetramerer, dimer, og monomerer av hemoglobin samt heme i sin fri form ^22. Rensing av hemoglobin fra friskt blod og dens bevaring i flytende nitrogen sikre integritet av proteinet ^22. Omfattende forskning på hemoglobin har muliggjort utvikling av protokoller for rensing av høy kvalitet hemoglobin fra friskt blod eller i rekombinant form, som kan bli brukt i vår analyse ^23-25.

Valget av jern chelator kan påvirke veksten analysen. For eksempel er 2,2-dipyridyl, som ofte brukes som en jern chelator, toksisktil bakterieceller ^26. Disse to effektene gjør det vanskelig å skjelne om inhibering av bakterievekst ved 2,2-dipyridyl skyldes jern chelatering eller toksisitet. I tillegg, er 2,2-dipyridyl sannsynligvis membran gjennomtrengelig, og dermed penetrerer bakteriecellen og chelater jern intracellulært ^27. Vi har funnet at vekst-hemming EDDHA reverseres av tilskudd av en jernkilde, gjør EDDHA en mer passende jern chelator for bakterievekst analyser. Imidlertid kan konsentrasjonen av EDDHA som må legges til vekstmediet variere. Dette skyldes variasjon av både EDDHA styrke og vekst medium jerninnhold fra parti til parti. Jernet chelaterende aktivitet kan normaliseres mellom grupper av EDDHA ved kjemisk fjerne rester jern ^28. Imidlertid, på grunn av variasjon mellom grupper av RPMI, har vi funnet at den endelige EDDHA konsentrasjonen fremdeles må justeres for å tillate vekst i nærvær av en jern-kilde. Vi fant thved den høyeste konsentrasjonen av EDDHA som er ettergivende for vekst av villtype S. aureus i nærvær av hemoglobin er optimal for dette eksperimentet.

Modifikasjoner kan gjøres til den gjeldende protokollen til mer likne miljøet oppdages av bakterier under infeksjonen. For eksempel, i verten, blir heme som frigjøres fra hemoglobin raskt bundet av hemopexin. Hemopexin kan ikke brukes som en jernkilde av S. aureus, derfor sin tillegg ville hindre oppkjøp av heme løslatt fra hemoglobin under inkubasjon med S. aureus ^12.

Vi føler at denne analysen kan brukes til forskning på metall oppkjøp av en rekke bakterier. Videre kan denne metode benyttes til å måle jern anskaffelse fra ikke-hemoglobin kilder til jern som er tilstede i verten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC anion exchange column	Varian	PL1551-3802
Drabkin's reagent	Sigma	D5941-6VL
Hemoglobin standard	Pointe Scientific	H7506-STD
RPMI	HyClone	SH30011.02
Chelex 100 sodium form	Sigma	C7901
EDDHA	LGC Standards GmbH	ANC 001
Hemoglobin a antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc	SC-21005
Tryptic soy agar	BD	236920