Summary
在这里，我们描述一个生长实验
Abstract
金黄色葡萄球菌是一种致病细菌，需要铁来进行重要的代谢功能，导致疾病的。储层人类宿主内的铁是最丰富的血红素，这是血红蛋白的辅因子。为了获得铁血红蛋白，S.金黄色葡萄球菌利用一个复杂的系统，被称为铁规管表面的行列式（ISD）系统1。 ISD系统首次绑定主机血红蛋白的组成部分，然后提取并导入血红素，和，终于解放血红素铁在细菌胞浆2,3。通过这条途径已解剖众多的体外研究4-9。此外，ISD系统感染的贡献已被反复证明在小鼠模型中8,10-14。建立血红蛋白衍生的铁收购和增长的贡献ISD系统已被证明是更具挑战性的。生长测定血红蛋白作为唯一的铁源是复杂的by是不稳定市售血红蛋白，在生长培养基中的游离铁污染，并与铁螯合剂毒性。在这里，我们提出了一种方法，该方法克服了这些限制。从新鲜血液中制备高品质的血红蛋白，并储存于液氮中。纯化血红蛋白补充铁消耗介质模仿铁所遇到的脊椎动物宿主病原体内的恶劣环境。饥饿S.黄色葡萄球菌的最小操纵形式的血红蛋白诱导生长的方式，结合血红蛋白，提取血红素，通过血红素通过细菌的细胞壁，并降低在细胞质中的血红素的能力完全依赖于铁和补充。此法将有助于研究人员寻找阐明机制的hemoglobin-/heme-derived铁收购S.金黄色葡萄球菌和其他可能的细菌病原体。
Protocol
1。从新鲜血液中的血红蛋白纯化
- 收购辅以抗凝剂的人新鲜血液。血液在冰上或4℃下保持整个纯化过程。
- 20分钟，于1500×g离心血液。的红血细胞（红细胞）将在试管底部。小心地吸出上清液，并轻轻将沉淀重悬于冰冷的0.9％（重量/体积）NaCl溶液。重复离心和洗涤3次。
- 在1倍体积的冰冷却的10mM Tris-HCl（pH值8.0）中重悬沉淀。这将诱导的红细胞由于渗透压的裂解。添加甲苯〜20％的最终体积。
- 在烤肉在4°C孵育过夜。
- 离心裂解液以20,000 xg离心1小时。收集的中间溶血离开甲苯（浮在上面）和颗粒不变的部分。用长脖子吸管收集中间馏分。
- 通过0.44微米针头式过滤器。如果溶液含有颗粒物质和不能可以通过过滤器，重复步骤1.5。
- 纯化血红蛋白（Hb）与一个高性能的液相色谱法（HPLC）的阴离子交换柱（Varian，PL-SAX 1,000埃8μm的，150毫米×4.6毫米）。流动相A为10 mM Tris-盐酸（pH8.0）和流动相B是10 mM Tris-盐酸（pH值8.0）+ 0.5 M氯化钠。 A 0％-100％的溶剂B的梯度运行在2.0毫升/分钟的流量超过2分钟。监测洗脱基于吸收（λ：410 nm和280 nm）。仅收集部分，特点是明亮的红色和显着的吸收峰（ 图1）。
- 透析洗脱对磷酸盐缓冲盐水（PBS）过夜，然后再次在几个小时。通过0.22μm的注射器过滤器灭菌。
- 为了测量血红蛋白浓度，准备的标准血红蛋白解决方案的已知浓度的PBS。确定样品中的血红蛋白浓度的混合标准溶液（请参阅下表我们与试剂编辑）或的样品溶液与2倍德拉布坎的试剂（从粉末制备）按1:1的比例。例如，与100μl的2×德拉布坎的试剂在96孔板中混合100μl的血红蛋白溶液。孵育15分钟，并测量在540nm处的吸光度。绘制标准曲线，确定试样中的Hb浓度。五至15毫克/毫升的产量是典型的。
- 运行15〜20μg纯化血红蛋白在15％SDS-PAGE，一式两份。染色凝胶之一;从另一个凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜和免疫印迹血红蛋白（ 图2）。
- 冻结和储存在液氮中的血红蛋白的1ml等分。
2。铁消耗培养基
- 准备罗斯威尔公园Memorial研究所（RPMI）肉汤通过溶解的RPMI粉末在水中，由生产商和1％cassamino酸（CA）（重量/体积）的建议，添加碳酸氢钠。通过0.2μm的过滤器和存储冷柜灭菌纳入样本内。
- 准备金属贫的RPMI（NRPMI）的通过添加7％（w / v的）Chelex 100上的搅拌板和混合过夜。通过0.2μm的过滤器和存储冷藏删除Chelex 100。与基本的非铁金属：25μM的ZnCl 2，25μM的MnCl 2，100mM的CaCl 2和1mM MgCl 2预先准备的作为无菌1,000×溶液补编媒体。使用一次性的塑料容器中，此步骤可重复使用的用品，以避免铁污染。
3， 金黄色葡萄球菌生长血红蛋白作为唯一的铁源
- 数S.金黄色葡萄球菌隔离胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）从冻结的股票。在37°C培养20〜24小时。
- 重悬的乙二胺-N，N'-双（2 - 羟基苯基乙酸）（EDDHA）在无水乙醇至100mM。 EDDHA不进入的解决方案，但乙醇灭菌。
- 加入EDDHA的RPMI至终浓度为0.5mM。让EDDHA溶解至少30分钟，然后再进行下一个步骤。由于批与批之间的变化，最终的EDDHA浓度可能需要降低至0.25 mM的允许细菌生长。
- ，接种单菌落S.分为5毫升的RPMI含有EDDHA带螺旋帽的在15毫升锥形管中的金黄色葡萄球菌 。在37℃下孵育16-20小时，在180转每分钟（rpm）振荡。
- 7500 XG 5分钟离心过夜培养和悬浮颗粒在NRPMI含有0.5mM EDDHA。规格化OD 600〜3。
- 准备NRPMI含2.5微克每毫升HB和0.1-1.0毫米EDDHA。由于各批次之间的变化，的EDDHA浓度螯合铁在NRPMI的可能会有所不同。
- 继代培养10微升的步骤3.51毫升NRPMI + EDDHA + Hb在15毫升螺旋盖的锥形管的菌悬液。
- 孵育在37℃下培养至48小时，在180 rpm或轧制鼓上摇动。
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Representative Results
我们人体血红蛋白溶血纯化与HPLC（协议1.7步）。 图1显示了记录洗脱液在280和410 nm波长的吸光度。收集的级分5，以及其它馏分被丢弃。五到十五毫克每毫升洗脱液血红蛋白，产量的影响通常是获得。纯化血红蛋白，一式两份，并通过SDS-PAGE分析，凝胶或蛋白质的染色，或转移到硝酸纤维素和免疫印迹（议定书步骤1.10， 图2）。
我们已评估纯化的人血红蛋白的能力，以支持经济增长的野生型S.金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌 ，缺乏的的ISD系统（ΔISDB）伊斯兰开发银行组成部分。伊斯兰开发银行是血红蛋白受体所需要的派生铁血红蛋白收购12。野生型和ΔISDB与人类hemog在贫铁培养基中生长 lobin“（NRPMI + EDDHA + Hb）的协议第3条。当生长在NRPMI + EDDHA +血红蛋白（Hb），野生型，但不ΔISDB是能够增殖表示随着时间的推移（ 图3A）由培养物的光密度的增加。与此相反，利用补充游离铁（FeCl 3的 ）的能力是相同的，在野生型和ΔISDB（ 图3B）。对于野生型，也不ΔISDB增殖中的铁源的情况下（ 图3B）。
我们比较了生长的影响黄色葡萄球菌在NRPMI + EDDHA补充与血红蛋白的新鲜血液或冻干血红蛋白的纯化。 图4示出，而从血液中的血红蛋白的纯化需要的增长，冻干血红蛋白ISDB使ΔISDB扩散。
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图1。吸收的血红蛋白纯化的洗脱组分在吸收波长为410 nm（具体血红素结合蛋白）和280 nm（所有蛋白质的特征）进行了监测，在整个洗脱。小数五所含的血红蛋白和收集。
图2。使用变性15％的SDS-PAGE分离纯化的人血红蛋白的 20微克纯化的血红蛋白。 A.凝胶染色的蛋白质用Bio-Rad蛋白质测定染料试剂。 B.硝酸纤维素膜免疫印迹血红蛋白。激烈的较低频段是血红蛋白单体，同时更微弱的上带是血红蛋白的二聚体和tertramers，并没有得到完全变性。
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图3。作为铁源使用人体血红蛋白由S.金黄色葡萄球菌 A。野生型（wt）或同源血红蛋白受体的ISDB突变体（ΔISDB）NRPMI的补充铁螯合剂EDDHA和人体血红蛋白的增长是显着差异，确定学生的双尾t检验，P <0.05。 B.生长在NRPMI补充有10μM的氯化铁（FeCl 3的 ）或EDDHA（-FeCl 3的 ）是不是不同重量和ΔISDB之间。图的描绘的数据从一个代表性的实验，其中包括三个生物学重复。误差棒表示标准偏差的光密度读数，在指定的时间点之间的复制。
图4。增长的野生型（WT）或同源血红蛋白受体米utant（ΔISDB）从新鲜血液或冻干血红蛋白的纯化血红蛋白的培养基。该图描绘了从一个代表性的实验，其中包括3个生物学重复的数据。误差棒表示标准偏差的光密度读数在指定的时间点之间的复制。星号表示，统计不同的值所确定的学生的双尾t检验，P <0.05。
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Discussion
铁是人体必需的营养物质，生物王国的寿命15。在脊椎动物中，铁被隔离，以避免造成此元素的毒性。封存也掩盖铁入侵的微生物的过程被称为营养免疫16。对此，病原体已经发展策略，规避营养的免疫力。一种这样的机制依赖于血红蛋白，这是最丰富的铁源内的主机17。血红蛋白被包含在红血细胞。血红蛋白受损的红血细胞释放的约束的主机结合珠蛋白，这标志着快速去除巨噬细胞结合珠蛋白-血红蛋白复合物18。为了获得血红蛋白，S. ：黄色葡萄球菌表示溶血，红细胞溶解19。结合珠蛋白诱导血红蛋白去除血红蛋白高亲和力的细胞表面受体表达的反驳
大量的研究已经证明了的ISD系统感染8,10-14。此外，生化研究已分配的功能，其各个组成部分的血红蛋白铁收购而得4-9。在这里，我们描述了一个监控生长的影响的检测金黄色葡萄球菌的唯一来源，可用铁血红蛋白。在这方面，我们需要指出的是一定条件下，实验成功的关键。
铁血红蛋白衍生采集生长实验中使用的试剂的质量和类型可以显着影响的结果obtaiNED在这些实验。相反血红蛋白从新鲜血液中，血红蛋白是存储在允许细菌生长Isd的系统（ 图4）21 的独立的部件的冻干形式得到。这可能是由于血红蛋白的结构中的变化是由lyophylization诱导。具体而言，冻干血红蛋白包含四聚体，二聚物，和血红蛋白的单体，以及在其游离形式22血红素。纯化血红蛋白新鲜的血液和血液保存在液氮中确保完整的蛋白质22。血红蛋白广泛的研究提供了便利从新鲜血液中的高品质的血红蛋白的纯化或重组形式，它可以用在我们的试验23-25 的协议的发展。
铁螯合剂的选择可能会影响生长测定。例如，2,2 - 联吡啶基，这是经常使用的，将作为铁螯合剂，是有毒的细菌细胞26。这两种效应使得它很难辨别，如果是由于抑制细菌生长的2,2 - 联吡啶铁螯合作用或毒性。此外，2,2 -联吡啶基很可能是膜渗透，从而贯通细菌细胞和螯合物铁细胞内27。我们已经发现，由EDDHA生长抑制逆转补充铁源，使EDDHA一个更合适的铁螯合剂为细菌的生长实验。然而，需要被加入到生长培养基中的浓度EDDHA可能会有所不同。这是由于两个EDDHA的效力和生长培养基中的铁含量的不同批次的变化。通过化学方法去除残留铁28批次之间的EDDHA铁螯合作用可以被归。然而，由于批次之间的变化的RPMI中，我们发现，最终EDDHA浓度可能仍然需要进行调整，以允许在铁源的存在下生长。我们发现日在野生型的增长是宽容的浓度最高的EDDHA S.在血红蛋白的存在下的金黄色葡萄球菌是最适用于本实验。
修改可以作出当前协议，使其更接近由细菌感染过程中所遇到的环境。例如，在主机内，血红素是从血红蛋白释放正在迅速约束血红素。血红素不能用于将作为铁源的S.金黄色葡萄球菌 ，因此它除了防止收购血红素释放血红蛋白孵化过程中与S.金黄色葡萄球菌 12。
我们认为，此法可用于研究金属收购的各种细菌病原体。此外，这种方法可以用于测量铁收购从非血红素铁的来源本主机内。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项研究是由美国公共卫生服务补助AI69233和AI073843从国家过敏和传染病研究所的支持。 EPS是一个巴勒斯惠康研究员，传染病的发病机制。 KPH是由细胞与分子微生物学培训补助计划5 T32 A107611-10。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC anion exchange column | Varian | PL1551-3802 | |
| Drabkin's reagent | Sigma | D5941-6VL | |
| Hemoglobin standard | Pointe Scientific | H7506-STD | |
| RPMI | HyClone | SH30011.02 | |
| Chelex 100 sodium form | Sigma | C7901 | |
| EDDHA | LGC Standards GmbH | ANC 001 | |
| Hemoglobin a antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc | SC-21005 | |
| Tryptic soy agar | BD | 236920 |
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