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Immunology and Infection

Croissance Staphylococcus aureus en utilisant l'hémoglobine humaine comme source de fer

Published: February 7, 2013 doi: 10.3791/50072
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University Medical School

Summary

Nous décrivons ici un test de croissance pour

Abstract

S. aureus est une bactérie pathogène qui nécessite de fer pour mener à bien les fonctions vitales du métabolisme et causer des maladies. Le réservoir le plus abondant de fer à l'intérieur de l'hôte humain est l'hème, qui est le cofacteur de l'hémoglobine. Pour acquérir le fer de l'hémoglobine, S. aureus utilise un système complexe connu sous le déterminant de surface régulée par le fer (Isd) système 1. Composants du premier système d'hémoglobine Isd hôte bind, puis extraire et importer l'hème, et enfin libérer de fer de l'hème dans le cytoplasme bactérien 2,3. Cette voie a été disséqué par de nombreuses études in vitro 4-9. En outre, la contribution du système Isd à l'infection a été maintes fois démontrée dans des modèles de souris 8,10-14. Instituant la contribution du système Isd à l'hémoglobine dérivée de l'acquisition du fer et de la croissance s'est avérée plus difficile. Essais de croissance en utilisant l'hémoglobine en tant que source de fer unique sont compliquées by l'instabilité de l'hémoglobine disponible dans le commerce, contaminant fer libre dans le milieu de croissance, et la toxicité associée à des chélateurs du fer. Nous présentons ici une méthode qui permet de surmonter ces limitations. D'hémoglobine de qualité est préparé à partir du sang frais et conservés dans l'azote liquide. L'hémoglobine purifiée est complétée en fer épuiser milieu simulant le milieu pauvre en fer rencontrées par les agents pathogènes à l'intérieur de l'hôte vertébré. En affamant S. aureus de fer libre et en complétant un formulaire de manipulation minimale de l'hémoglobine nous induire la croissance d'une manière qui dépend entièrement de la capacité de lier l'hémoglobine, d'extraire l'hème, l'hème passer à travers l'enveloppe cellulaire bactérienne et de dégrader l'hème dans le cytoplasme. Ce test sera utile pour les chercheurs qui cherchent à élucider les mécanismes de l'acquisition du fer hemoglobin-/heme-derived dans S. aureus et éventuellement d'autres agents pathogènes bactériens.

Protocol

1. Purification de l'hémoglobine à partir de sang frais

  1. Acquérir le sang frais humain additionné d'un anticoagulant. Gardez le sang sur la glace ou à 4 ° C tout au long de la purification.
  2. Centrifuger le sang pendant 20 min à 1500 x g. Les globules rouges (GR) est au fond du tube. Soigneusement aspirer le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans une solution glacée de NaCl 0,9% (p / v). Répétez la centrifugation et laver 3 fois.
  3. Remettre en suspension le culot dans 1 volume de glace-froid 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0). Cela induire la lyse des globules rouges en raison de la pression osmotique. Ajouter le toluène à ~ volume final de 20%.
  4. Incuber à 4 ° C pendant la nuit sur une rôtissoire.
  5. Centrifuger le lysat à 20.000 xg pendant 1 heure. Recueillir la fraction hémolysat milieu en laissant intacte l'toluène (flottant au-dessus) et le culot. Utiliser une pipette long cou pour recueillir la fraction intermédiaire.
  6. Traverser 0,44 um filtre seringue. Si la solution contient des particulesla matière et ne peut pas être passé à travers le filtre, répéter l'étape 1,5.
  7. Purifier l'hémoglobine (Hb) par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) colonne échangeuse d'anions (Varian, PL-SAX 1000 A 8 um, 150 mm x 4,6 mm). A la phase mobile est de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) et la phase mobile B est 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. Un gradient de 0% -100% de solvant B est géré de plus de 2 minutes avec une fréquence du débit de 2,0 ml / min. L'élution est suivie basé sur l'absorption (λ: 410 nm et 280 nm). Recueillir la fraction seulement caractérisée par une couleur rouge vif et un pic d'absorption importante (figure 1).
  8. Dialyser contre l'élution du tampon phosphate salin (PBS) pendant une nuit, puis pendant quelques heures encore. Stériliser par passage à travers un filtre de 0,22 um seringue.
  9. Pour mesurer la concentration d'hémoglobine, de préparer des solutions étalons de concentrations connues d'hémoglobine dans du PBS. Déterminer la concentration de l'hémoglobine dans l'échantillon en mélangeant les solutions standard (voir la table avec des réactifs noused) ou la solution d'échantillon avec le réactif de Drabkin 2x (préparé à partir de poudre) dans un rapport 1:1. Par exemple, mélanger 100 ul de solution de réactif Hb 100 pi 2x Drabkin dans des plaques 96 puits. Incuber pendant 15 min et mesurer l'absorbance à 540 nm. Tracer une courbe d'étalonnage et déterminer la concentration d'hémoglobine dans l'échantillon. Cinq à quinze mg / ml rendements sont typiques.
  10. Exécuter mg 15-20 hémoglobine purifiée sur un 15% SDS-PAGE en double exemplaire. Tacher une des gels; transférer les protéines d'une autre gel sur une membrane de nitrocellulose et immunoblot de l'hémoglobine (Figure 2).
  11. Congeler et stocker des aliquotes de 1 ml d'hémoglobine dans l'azote liquide.

2. Médias de croissance Préparation de fer appauvrissent

  1. Préparer Roswell Park Memorial Institute (RPMI) de bouillon en dissolvant la poudre dans de l'eau RPMI, ajouter du bicarbonate de sodium tel que recommandé par le fabricant et 1% d'acides cassamino (CA) (w / v). Stériliser par passage à travers un filtre de 0,2 um et stocker frigoaccélérées.
  2. Préparer appauvri en métal RPMI (NRPMI) en ajoutant 7% (p / v) Chelex 100 et le mélange pendant une nuit sur une plaque d'agitation. Retirer Chelex 100 en passant à travers un filtre 0,2 um et stocker au réfrigérateur. Supplément médias essentiels métaux non ferreux: 25 uM 2 ZnCl, 25 pM MnCl 2, 100 mM de CaCl 2 et MgCl 2 1 mM préparé à l'avance comme un stérile 1000 x solution. Utilisez des contenants en plastique jetables pour cette étape pour éviter la contamination de fer de fournitures réutilisables.

3. Croissance Staphylococcus aureus en utilisant l'hémoglobine comme source de fer Sole

  1. Série S. aureus pour l'isolement sur ​​gélose TSA (TSA) à partir d'un stock congelé. Incuber à 37 ° C pendant 20-24 heures.
  2. Remettre en suspension l'acide éthylènediamine-N, N'-bis (2-hydroxyphénylacétique) (EDDHA) dans de l'éthanol anhydre à 100 mM. EDDHA ne pas en solution, mais est stérilisé par l'éthanol.
  3. Ajouter EDDHA de RPMI à une concentration finale de 0,5 mM. PermettreEDDHA pour dissoudre au moins 30 min avant de procéder à l'étape suivante. En raison de lot à lot variation, concentration finale EDDHA peut-être besoin d'être abaissé à 0,25 mM pour permettre la croissance bactérienne.
  4. Inoculer des colonies isolées de S. aureus dans 5 ml de RPMI contenant EDDHA dans 15 ml à bouchon à vis des tubes coniques. Incuber à 37 ° C sous agitation à 180 tours par minute (tpm) pendant 16-20 h.
  5. Centrifuger les cultures d'une nuit pendant 5 min à 7500 xg et remettre en suspension le culot dans NRPMI contenant 0,5 mM EDDHA. Normaliser OD 600 à ~ 3.
  6. Préparer NRPMI contenant 2,5 ug par ml Hb et 0,1-1,0 mM EDDHA. Due à la variation entre les lots, la concentration EDDHA nécessaire pour chélater le fer libre dans NRPMI peuvent varier.
  7. Subculture 10 ul de suspension bactérienne à partir de l'étape 3.5 dans 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb dans un 15 ml à bouchon à vis tube conique.
  8. Incuber les cultures à 37 ° C pendant 48 h pour en agitant à 180 tours par minute ou sur un tambour de roulage.
    9. 600 lectures en éliminant 50 pi de la culture et de la mélanger avec 150 pi de PBS dans des plaques 96 puits.

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Representative Results

Nous avons purifié l'hémoglobine humaine à partir hémolysat par HPLC (étape Protocole de 1,7). Figure 1 montre enregistrées absorbance de l'éluat à 280 nm et 410 longueurs d'onde. Fraction 5 a été recueilli et autres fractions ont été rejetées. Les rendements de cinq à quinze milligrammes d'hémoglobine par millilitre d'éluat sont généralement acquises. D'hémoglobine purifiée a été analysée par SDS-PAGE en double et les gels ont été soit colorés pour des protéines ou transférées sur nitrocellulose et immunoblottées (étape protocole 1.10, Figure 2).

Nous avons évalué la capacité de l'hémoglobine humaine purifiée pour soutenir la croissance de type sauvage S. aureus et S. aureus qui n'a pas la composante du système ISDB Isd (Δ ISDB). Est un récepteur ISDB hémoglobine qui est nécessaire pour l'hémoglobine dérivée fer acquisition 12. Type sauvage et Δ ISDB ont été cultivées en fer appauvri en milieu supplémenté avec hemog humaine Lobin (NRPMI + EDDHA + Hb) comme décrit dans l'article 3 du protocole. Lorsqu'il est cultivé dans NRPMI + EDDHA + Hb, de type sauvage mais pas Δ ISDB est capable de proliférer comme indiqué par une augmentation de la densité optique des cultures au fil du temps (figure 3A). En revanche, la possibilité d'utiliser gratuitement complété de fer (+ FeCl 3) est identique au type sauvage et ISDB Δ (figure 3B). Ni de type sauvage ni Δ ISDB proliférer en l'absence d'une source de fer (figure 3B).

Nous avons comparé la croissance de S. aureus dans NRPMI + EDDHA complété avec de l'hémoglobine purifiée à partir du sang frais ou lyophilisé hémoglobine. Figure 4 montre que, si l'hémoglobine purifiée à partir de sang nécessite ISDB pour la croissance, l'hémoglobine lyophilisée permet la prolifération de Δ ISDB.

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Figure 1. Absorption des fractions d'élution durant la purification d'hémoglobine. Absorption à 410 nm (spécifique à l'hème-protéines de liaison) et 280 nm (caractéristique de toutes les protéines) a été suivie tout au long de l'élution. Numéro cinq fraction contenait hémoglobine et ont été recueillis.

Figure 2
Figure 2. Hémoglobine purifiée humaine Vingt microgrammes d'hémoglobine purifiée a été séparée à l'aide dénaturant 15% SDS-PAGE. A. Gel coloré pour des protéines Bio-Rad Protein Assay réactif colorant. Membrane de nitrocellulose B. immunoblot pour l'hémoglobine. La bande intense inférieure est un monomère hémoglobine, tandis que les groupes les plus faibles sont supérieures dimères d'hémoglobine et tertramers, qui ne reçoivent pas complètement dénaturé.

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Figure 3. L'utilisation de l'hémoglobine humaine comme source de fer par S. A. aureus Croissance de type sauvage (wt) ou isogénique hémoglobine récepteur ISDB mutant (Δ ISDB) dans NRPMI complétée par chélateurs du fer EDDHA et l'hémoglobine humaine est statistiquement différent tel que déterminé par l'élève test bilatéral t, p <0,05. B. Croissance en NRPMI supplémenté avec 10 uM de chlorure de fer (+ FeCl 3) ou EDDHA (-FeCl 3) n'est pas différente entre poids et Δ ISDB. Graphiques illustrent les données d'une expérience représentative, qui comprenait trois biologique répétitions. Les barres d'erreur indiquent l'écart type des lectures de densité optique à des points de temps indiqués entre les répétitions.

Figure 4
Figure 4. Croissance de type sauvage (wt) ou isogénique m récepteur hémoglobineutant (Δ ISDB) dans des milieux supplémentés avec l'hémoglobine purifiée à partir de sang frais ou lyophilisé hémoglobine. Ce graphique représente les données d'une expérience représentative, qui comprenait trois réplicats biologiques. Les barres d'erreur représentent l'écart type des lectures de densité optique à des points de temps indiqués entre les répétitions. Les astérisques indiquent les valeurs qui sont statistiquement différentes tel que déterminé par l'élève test bilatéral t, p <0,05.

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Discussion

Le fer est un nutriment essentiel requis par les organismes de tous les royaumes de la vie 15. Chez les vertébrés, le fer est séquestré à éviter la toxicité provoquée par cet élément. Cette séquestration dissimule aussi le fer de microbes envahisseurs dans un processus connu sous le nom immunité nutritionnel 16. En réponse, les agents pathogènes ont développé des stratégies permettant de contourner l'immunité nutritionnel. Un tel mécanisme repose sur l'hémoglobine, qui est la source la plus abondante de fer dans l'hôte 17. D'hémoglobine est contenu à l'intérieur des globules rouges. D'hémoglobine libéré des lésions des cellules rouges du sang est lié par l'haptoglobine hôte, ce qui signale l'enlèvement rapide de l'haptoglobine-hémoglobine par les macrophages des complexes 18. Pour accéder à l'hémoglobine, S. aureus exprime hémolysines que lyser les globules rouges 19. L'haptoglobine-hémoglobine induite par le retrait est contré par une liaison de haute affinité de l'hémoglobine par les récepteurs de surface cellulaire exprimés par 20.

De nombreuses études ont démontré la contribution du système Isd à l'infection 8,10-14. En outre, des études biochimiques ont attribué les fonctions de ses composants individuels de l'hémoglobine dérivée de l'acquisition du fer 4-9. Nous décrivons ici une analyse qui surveille la croissance de S. aureus avec l'hémoglobine comme la seule source de fer disponible. À cet égard, il faut souligner certaines conditions qui sont essentielles pour la réussite de l'expérience.

La qualité et le type de réactifs utilisés dans les essais de fer de l'hémoglobine dérivés de croissance acquisition peut considérablement influencer le résultat obtenies dans ces essais. Contrairement à l'hémoglobine obtenu à partir du sang, l'hémoglobine fraîche qui est stocké sous forme lyophilisée permet la croissance des bactéries indépendante des composants du système Isd (figure 4) 21. Cela est probablement dû aux changements dans la structure de l'hémoglobine qui sont induites par lyophilisation. Plus précisément, l'hémoglobine lyophilisée contient des tétramères, des dimères et monomères, de l'hémoglobine, ainsi que l'hème dans sa forme libre 22. Purification de l'hémoglobine de sang frais et sa conservation dans l'azote liquide assurer l'intégrité de la protéine 22. Des recherches approfondies sur l'hémoglobine a facilité l'élaboration de protocoles pour la purification de haute qualité à partir de l'hémoglobine du sang frais ou sous forme recombinante, qui peut être utilisé dans notre test 23-25.

Le choix de chélateur du fer peut affecter le test de croissance. Par exemple, le 2,2-dipyridyle, qui est fréquemment utilisé comme chélateur du fer, est toxiqueà 26 cellules bactériennes. Ces deux effets font qu'il est difficile de discerner si l'inhibition de la croissance bactérienne par 2,2-dipyridyle est due à la chélation du fer ou de toxicité. De plus, le 2,2-dipyridyle est susceptible d'être perméable, et pénètre ainsi la cellule bactérienne et les chélates de fer intracellulaire 27. Nous avons trouvé que l'inhibition de la croissance par EDDHA est inversé par la supplémentation d'une source de fer, ce qui EDDHA un chélateur du fer plus approprié pour les essais de croissance bactérienne. Toutefois, la concentration de EDDHA qui doit être ajouté au milieu de croissance varie. Cela est dû à la variation de la puissance à la fois EDDHA et teneur en fer de croissance à moyen d'un lot à. L'activité de chélation du fer peut être normalisée entre les lots de EDDHA par enlever chimiquement fer résiduel 28. Toutefois, en raison de la variation entre les lots de RPMI, nous avons constaté que la concentration finale EDDHA peut encore être ajusté pour permettre la croissance en présence d'une source de fer. Nous avons trouvé eà la plus forte concentration de EDDHA qui est permissive pour la croissance de type sauvage S. aureus en présence d'hémoglobine est optimale pour cette expérience.

Des modifications peuvent être apportées au protocole actuel pour ressembler davantage à l'environnement rencontré par les bactéries lors de l'infection. Par exemple, au sein de l'hôte, l'hème qui est libéré de l'hémoglobine est rapidement lié par hémopexine. Hémopexine ne peut pas être utilisé comme source de fer par S. aureus, par conséquent, son plus empêcherait l'acquisition de l'hème de l'hémoglobine libérée pendant l'incubation avec S. aureus 12.

Nous pensons que ce test peut être utilisé pour la recherche sur l'acquisition de métal par une variété de bactéries pathogènes. En outre, cette méthode peut être utilisée pour mesurer l'acquisition du fer de l'hémoglobine non-sources de fer qui sont présents dans l'hôte.

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Disclosures

Nous n'avons rien à déclarer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par des subventions publiques aux États-Unis des services de santé et AI073843 AI69233 de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses. EPS est un Fellow Burroughs Wellcome dans la pathogenèse des maladies infectieuses. KPH a été financé par le cellulaire et moléculaire Microbiologie Subvention de formation Programme 5 T32 A107611-10.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin's reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

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References

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