Summary
ここでは、のための増殖アッセイを記述
Abstract
黄色ブドウ球菌は、鉄が重要な代謝機能と原因疾患を遂行する必要があり、病原性細菌である。人間のホスト内の鉄の最も豊富な貯水池はヘモグロビンのヘム補因子である。ヘモグロビンから鉄を獲得するには、S.黄色ブドウ球菌は、鉄調節表面決定因子（ISD）システム1として知られている精巧なシステムを採用しています。 ISDシステム最初のバインド、ホスト·ヘモグロビンの構成要素は、次に抽出し、ヘムをインポートして、最終的に細菌の細胞質2,3にヘムから鉄を遊離する。この経路は、in vitro試験4-9 の数多く通って解剖されています。さらに、感染症へのISDシステムの寄与を繰り返しマウスモデル8,10-14で実証されている。ヘモグロビン由来の鉄獲得にISDシステムの寄与を確立し、成長がより困難であることが証明された。唯一の鉄源としてヘモグロビンを用いた増殖アッセイは、b複雑なものyの市販のヘモグロビンの不安定、フリー増殖培地中の鉄、鉄キレート剤に関連する毒性を汚染。ここでは、これらの制限を克服する方法を提案する。高品質のヘモグロビンは、新鮮な血液から調製されており、液体窒素中で保存されています。精製されたヘモグロビンは脊椎動物宿主病原体内部で発生した鉄 - 劣悪な環境を模倣した鉄枯渇培地に補充される。 Sを飢えによって遊離鉄の黄色ブドウ球菌 、我々は、ヘモグロビンを結合するヘムを抽出し、細菌の細胞エンベロープを通ってヘムを通過して細胞質内でヘムを分解する能力に完全に依存した方法で成長を誘発するヘモグロビンの低侵襲操作形で補う。このアッセイは、Sのhemoglobin-/heme-derived鉄獲得のメカニズムを解明しようとしている研究者にとって有用であろうブドウ球菌およびおそらく他の細菌性病原体。
Protocol
1。新鮮な血液からヘモグロビンの精製
- 抗凝固剤を補充した新鮮なヒト血液を取得します。浄化を通して氷上もしくは4℃で血液℃で保管してください。
- 1500×gで20分間血液を遠心分離します。赤血球は（赤血球）チューブの底になります。注意深く上清を吸引し、ゆっくりと氷冷0.9％（w / v）のNaCl溶液中でペレットを再懸濁します。遠心分離を繰り返し、3回洗浄します。
- 氷冷10mMトリス-HCl（pH8.0）の1ボリュームにペレットを再懸濁します。これは浸透圧に起因する赤血球の溶解を誘導します。 〜20％の最終容量にトルエンを追加します。
- 一晩ロティサリーで4℃でインキュベートする。
- 1時間20,000 xgでライセートを遠心分離します。手つかずのトルエン（上フローティング）とペレットを残して真ん中溶血画分を集める。中間留分を収集するために、長い首のピペットを使用しています。
- 0.44μmのシリンジフィルターを通過します。解決策は、微粒子が含まれている場合物質とは、ステップ1.5を繰り返して、フィルタを通過することはできません。
- 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、陰イオン交換カラム（Varian、PL-SAX千オングストロームは8μm、150ミリメートル×4.6ミリメートル）とヘモグロビン（Hb）を浄化する。移動相Bは、10mMトリス-HCl（pH8.0）+0.5 M NaClで10mMのトリス-HCl（pH8.0）および移動相である。溶媒Bの0％-100％の勾配は2.0ミリリットル/分の流量で2分間にわたって実行されます。 （：410 nmと280 nmλ）の溶出が吸収に基づいて監視されています。鮮やかな赤い色と著名な吸収ピーク（ 図1）によって特徴付け一部のみを収集します。
- に対する溶出を透析するリン酸緩衝再び生理食塩水（PBS）で一晩してから数時間。 0.22μmのシリンジフィルターを通過することにより滅菌する。
- Hb濃度を測定するために、PBS中の既知濃度の標準ヘモグロビン溶液を調製する。標準溶液を混合することにより、試料中のヘモグロビンの濃度を測定（試薬達とテーブルを参照してください。ed）または1:1の比率で2倍Drabkin試薬（粉末から調製）と試料溶液。例えば、96ウェルプレートに100μlの2倍Drabkinの試薬を用いて、100μlのHb溶液を混ぜる。 540nmで15分間測定吸光度インキュベートする。標準曲線をプロットし、試料中のヘモグロビン濃度を測定します。 5〜15 mg / mlの収率は典型的なものである。
- 重複の15％SDS-PAGE上で15から20μgの精製ヘモグロビンを実行します。ゲルの1を汚し、ヘモグロビンのニトロセルロース膜とイムノブロット（ 図2）の上に別のゲルからタンパク質を転送します。
- 凍結し、液体窒素中でヘモグロビンの1mlのアリコートを格納します。
2。鉄枯渇増殖培地の調製
- メーカーと1％cassamino酸（CA）（w / v）のが推奨するように重炭酸ナトリウムを加える、水にRPMI粉末を溶解することによりロズウェルパーク記念研究所（RPMI）ブロスを準備します。 0.2μmフィルターや店舗冷媒を通過させることにより殺菌erated。
- Chelex 100 7％（w / v）を追加し、撹拌プレート上で一晩混合することにより、金属が枯渇RPMI（NRPMI）を準備します。 0.2μmフィルターや店舗冷蔵を通過することによりChelex 100を削除します。 、25μMZnCl 2を 、無菌の1,000×溶液として予め用意し、25μMのMnCl 2、100 mM CaCl 2および1mMのMgCl 2：本質的な非鉄金属とメディアを補足するものです。再利用可能な電源からの鉄汚染を避けるために、このステップのための使い捨てのプラスチック容器を使用しています。
ソレ鉄源としてヘモグロビンを用いた3。 黄色ブドウ球菌の成長
- ストリークS.凍結ストックからトリプシン大豆寒天（TSA）は上の分離のための黄色ブドウ球菌 。 20〜24時間37℃でインキュベートする。
- 100mmに無水エタノールに再懸濁し、エチレンジアミン-N、N'-ビス（2 - ヒドロキシフェニル酢酸）（EDDHA）。 EDDHAは解決策にはなりませんが、エタノールで滅菌される。
- 最終濃度0.5mMにRPMIにEDDHAを追加します。許すEDDHAは、次のステップに進む前に、少なくとも30分間溶解する。バッチ間のばらつきにより、最終EDDHA濃度は、細菌の増殖を可能にする0.25 mMまで低下させることが必要になることがあります。
- Sの単一コロニーを植菌15ミリリットルのスクリューキャップコニカルチューブでRPMI含むEDDHAの5ミリリットルに黄色ブドウ球菌 。 37℃で16から20時間、毎分180回転（rpm）で振盪しながらCを。
- 7500×gで5分間、一晩培養を遠心NRPMIが0.5mMのEDDHAを含有するペレットを再懸濁します。 〜3のOD 600を正規化します 。
- NRPMIはミリリットルHbおよび0.1から1.0 mMのEDDHAあたり2.5μgを含む準備します。バッチ間のばらつきによる、NRPMI内遊離鉄をキレートするために必要なEDDHA濃度は変わる場合があります。
- 15ミリリットルのスクリューキャップコニカルチューブに1ミリリットルNRPMI EDDHA + + HBにステップ3.5からの細菌懸濁液10μlをサブカルチャー。
- 180rpmでまたはローリングドラムに振とうしながら、最大48時間まで37℃で培養する。
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Representative Results
我々は、HPLC（プロトコルステップ1.7）で溶血からヒトヘモグロビンを精製した。 図1は、280および410 nmの波長での溶出液の吸光度を記録した。フラクション5を回収し、他の画分を廃棄した。溶出液のミリリットル当たりのヘモグロビンの五から十五ミリグラムの収量は、一般的に取得される。精製されたヘモグロビンは、重複でSDS-PAGEで分析したところ、ゲルをどちらかのタンパク質を染色またはニトロセルロースおよびイムノブロット（プロトコールステップ1.10、 図2）に転写した。
我々は、野生型の成長をサポートするためにヒトヘモグロビンの精製能力を評価したS. aureusおよびS. ISDシステム（ΔISDB）のISDBコンポーネントを欠いているブドウ球菌 。 ISDBは、ヘモグロビン由来の鉄獲得12に必要とされるヘモグロビン受容体である。野生型およびΔISDBは人間hemogを補充鉄欠乏培地中で増殖させた lobin（NRPMI EDDHA + + Hb）は、プロトコルのセクション3で説明。 NRPMIで栽培場合+ EDDHA + HB、野生型ではなく、ΔISDBは 、時間の経過と共に培養物の光学密度（ 図3A）の増加によって示さ増殖することができます。これとは対照的に、補足し遊離鉄（+ FeCl 3を ）利用する能力は、野生型とΔISDB（ 図3B）と同じです。野生型でもΔISDBどちらも鉄源（ 図3B）の非存在下で増殖する。
私たちは、Sの成長を比較したNRPMIにおけるブドウ球菌 +鮮血または凍結乾燥ヘモグロビンから精製されたヘモグロビンを補充EDDHA 図4は、血液から精製されたヘモグロビンは成長のためのISDB必要とする一方、凍結乾燥したヘモグロビンがΔISDBの増殖を可能にすることを示しています。
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図1。ヘモグロビンの精製中に溶出画分の吸収。は410nm（ヘム結合タンパク質に特異的な）と280 nm（全タンパク質の特性）での吸収が溶出を通して監視した。フラクションナンバー5は、ヘモグロビンが含まれており、収集した。
図2。ヒトヘモグロビンを精製ヘモグロビンの20マイクログラムを精製し 、SDS-PAGEで15％変性用いて分離した。 A.ゲルはBio-Radタンパク質アッセイ色素試薬とタンパク質を染色した。 Bのニトロセルロース膜は、ヘモグロビンのため免疫ブロット。もっとかすかなアッパーバンドが完全に変性取得できませんでしたヘモグロビン量体とtertramers、いる間に強烈な低いバンドは、ヘモグロビンモノマーである。
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図3。 S.の鉄源としてのヒトヘモグロビンの使用球菌 A.鉄キレート剤EDDHAとヒトヘモグロビンを補充した野生型（wt）またはNRPMIにおける同質ヘモグロビン変異型受容体ISDB（ΔISDB）の成長は、スチューデントの両側 t 検定、p <0.05によって決定されるように統計的に異なっている。 NRPMIでB.成長は、10μM塩化鉄（+のFeCl 3）またはEDDHAを補った（-FeCl 3の ）重量とΔISDB間に違いはありません。グラフは、3つの生物が複製が含まれていた代表的な実験からのデータを示している。エラーバーは、レプリケートの間に表示されている時点で光学密度測定値の標準偏差を表す。
図4。野生型（wt）または同質ヘモグロビン受容体mの成長新鮮な血液または凍結乾燥ヘモグロビンから精製ヘモグロビンを補充した培地でutant（ΔISDB）は 、グラフは、3つの生物学的レプリケートが含まれていた代表的な実験からのデータを示しています。エラーバーは、レプリケートの間に表示されている時点での光学密度測定値の標準偏差を表す。アスタリスクは、スチューデントの両側 t 検定、p <0.05によって決定されるように統計的に異なる値を示す。
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Discussion
鉄は人生15のすべての国からの生物が必要とする必須栄養素である。脊椎動物では、鉄は、この要素によって引き起こされる毒性を避けるために隔離されている。この隔離はまた、栄養免疫16として知られている過程で微生物が侵入してくるから鉄を隠蔽する。応答では、病原体が栄養免疫を回避する戦略を進化させてきた。そのようなメカニズムの1つは、ホスト17内の鉄の最も豊富な源であるヘモグロビンに依存しています。ヘモグロビンは赤血球の中に含まれている。損傷した赤血球から放出されたヘモグロビンはマクロファージ18によりハプトグロビン-ヘモグロビン複合体の迅速な除去を通知ホストハプトグロビン、バインドされています。ヘモグロビンへのアクセスを得るために、S.ブドウ球菌は 19赤血球を溶解ヘモリジンを表現しています。ハプトグロビン誘起ヘモグロビン除去することによって発現される細胞表面受容体によってヘモグロビンの高親和性結合によって対抗さ
多くの研究は、感染8,10-14にISDシステムの寄与を明らかにした。さらに、生化学的研究は、ヘモグロビン由来の鉄獲得4-9の個々のコンポーネントの機能を割り当てています。ここでは、Sの成長を監視するアッセイを記述利用可能な鉄の唯一の供給源としてヘモグロビンを持つ黄色ブドウ球菌 。この点で、我々は実験の成功のために極めて重要である一定の条件を指摘する必要があります。
ヘモグロビン由来の鉄獲得増殖アッセイで使用する試薬の品質と種類は劇的に結果obtaiに影響を与えることができるこれらのアッセイにおいてNED。新鮮な血液から得られたヘモグロビンとは対照的に、凍結乾燥された形式で格納されヘモグロビンがISDシステム（ 図4）21の構成要素の細菌増殖が独立できます。これはおそらく、凍結乾燥することにより誘導されるヘモグロビンの構造の変化によるものである。具体的には、凍結乾燥したヘモグロビンが四量体、二量体、およびヘモグロビンのモノマーだけでなく、そのフリーフォーム22のヘムを含んでいます。液体窒素中で新鮮な血液とその保全からヘモグロビンの精製は、タンパク質22の整合性を確保します。ヘモグロビンに関する広範な研究では、新鮮な血液から、あるいは我々のアッセイ23から25に使用できる組換え形態で、高品質のヘモグロビンを精製するためのプロトコルの開発を促進してきた。
鉄キレート剤の選択は、増殖アッセイに影響を及ぼす可能性があります。たとえば、頻繁に鉄キレート剤として使用されている2,2 - ジピリジルは、毒性があるに細菌細胞26。これらの2つの効果は、2,2 - ジピリジルによる細菌増殖の阻害が鉄キレートまたは毒性によるものか見分けるのが難しいのです。また、2,2 -ジピリジルは膜透過性である可能性が高い、従って、細菌の細胞に浸透し、細胞内に27鉄をキレートする。我々はEDDHAによる増殖阻害がEDDHA細菌増殖アッセイのためのより適切な鉄キレート剤作り、鉄源の補給によって逆転されることを見出した。しかし、成長培地に添加する必要があるEDDHAの濃度は変わる場合があります。これはEDDHAの効力及びバッチ毎に成長培地の鉄含有量の両方の変動によるものである。鉄キレート活性を化学的残留鉄28を除去することによってEDDHAのバッチ間で正規化することができます。しかし、RPMIのバッチ間のばらつきに起因して、我々は最終的なEDDHA濃度は依然として鉄源の存在下での成長が可能になるように調整する必要があるかもしれないことがわかった。我々は、番目の発見野生型の成長のために寛大ですEDDHAの最高濃度でS.ヘモグロビンの存在下で黄色ブドウ球菌は、この実験のために最適です。
修正は、より密接に感染中の細菌によって発生し環境に似せて、現在のプロトコルにすることができる。例えば、ホスト内で、ヘモグロビンから放出されるヘムは迅速ヘモペキシンによってバインドされます。ヘモペキシンはSで鉄源として使用することはできません黄色ブドウ球菌は 、したがって、そのほかは、S.とのインキュベーション中にヘモグロビンから放出ヘムの買収を妨げるブドウ球菌 12。
我々は、このアッセイは、病原性細菌の様々な金属の獲得の研究のために使用することができると感じています。さらに、この方法は、ホスト内に存在する鉄の非ヘモグロビン源から鉄の取り込みを測定するために用いることができる。
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Disclosures
我々は、開示することは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立アレルギー感染症研究所から米国公衆衛生局助成金AI69233およびAI073843によってサポートされていました。 EPSは、感染症の発症機序におけるバローズウェルカム·フェローでもある。 KPHは5 T32 A107611-10細胞·分子微生物学研修助成プログラムによって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC anion exchange column | Varian | PL1551-3802 | |
| Drabkin's reagent | Sigma | D5941-6VL | |
| Hemoglobin standard | Pointe Scientific | H7506-STD | |
| RPMI | HyClone | SH30011.02 | |
| Chelex 100 sodium form | Sigma | C7901 | |
| EDDHA | LGC Standards GmbH | ANC 001 | |
| Hemoglobin a antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc | SC-21005 | |
| Tryptic soy agar | BD | 236920 |
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