Summary
Aquí se describe un ensayo de crecimiento para
Abstract
S. aureus es una bacteria patógena que requiere de hierro para llevar a cabo las funciones metabólicas vitales y causan enfermedades. El depósito más abundante de hierro en el interior del huésped humano es heme, que es el cofactor de la hemoglobina. Para adquirir el hierro de la hemoglobina, S. aureus utiliza un complejo sistema conocido como el determinante superficie regulada por hierro (Isd) del sistema 1. Los componentes del sistema Isd primero hemoglobina anfitrión bind, a continuación, extraer e importar hemo, y, finalmente, liberar el hierro del grupo hemo en el citoplasma bacteriano 2,3. Esta vía ha sido diseccionado a través de numerosos estudios in vitro 4-9. Además, la contribución del sistema de Isd a la infección se ha demostrado repetidamente en modelos de ratón 8,10-14. El establecimiento de la contribución del sistema de Isd a la hemoglobina derivada de la adquisición de hierro y crecimiento ha demostrado ser más difícil. Ensayos de crecimiento usando hemoglobina como única fuente de hierro son complicadas by la inestabilidad de la hemoglobina disponible comercialmente, contaminando hierro libre en el medio de crecimiento, y la toxicidad asociada con quelantes de hierro. Aquí presentamos un método que supera estas limitaciones. Hemoglobina de alta calidad se preparó a partir de sangre fresca y se almacena en nitrógeno líquido. Hemoglobina purificada se completa en hierro-agotan medio que imitan el entorno pobre en hierro encontrada por patógenos dentro del huésped vertebrado. Al privar S. aureus de hierro libre y se completa con una forma mínimamente manipulados de hemoglobina que inducir el crecimiento de una manera que es totalmente dependiente de la capacidad de unirse a la hemoglobina, extraer hemo, heme pasar a través de la envoltura celular bacteriana y degradar hemo en el citoplasma. Este ensayo será útil para los investigadores que buscan para dilucidar los mecanismos de adquisición de hierro hemoglobin-/heme-derived en S. aureus y posiblemente otros patógenos bacterianos.
Protocol
1. La purificación de la hemoglobina de la sangre fresca
- Adquirir sangre humana fresca suplementada con un anticoagulante. Mantener la sangre en hielo oa 4 ° C durante toda la purificación.
- Centrifugar la sangre durante 20 min a 1.500 x g. Los glóbulos rojos (GR) será en la parte inferior del tubo. Aspirar con cuidado el sobrenadante y resuspender el sedimento suavemente en helado 0,9% (w / v) de solución de NaCl. Repetir la centrifugación y lavar 3 veces.
- Resuspender el precipitado en 1 volumen de helado de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Esto induce la lisis de los glóbulos rojos debido a la presión osmótica. Añadir tolueno a ~ 20% del volumen final.
- Incubar a 4 ° C durante la noche en un asador.
- Se centrifuga el lisado a 20.000 xg durante 1 hr. Recoger la fracción hemolizado medio dejando intacto el tolueno (flotante en la parte superior) y pellet. Utilizar una pipeta de cuello largo para recoger la fracción intermedia.
- Pasar a través de filtro de jeringa de 0,44 m. Si la solución contiene partículasla materia y no se puede pasar a través del filtro, repita el paso 1,5.
- Purificar la hemoglobina (Hb) con una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en columna de intercambio aniónico (Varian, PL-SAX 1.000 Å 8 micras, 150 mm x 4,6 mm). La fase móvil A es 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) y la fase móvil B es 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. Un 0% -100% de gradiente de disolvente B se ejecuta más de 2 min a una velocidad de flujo de 2,0 ml / min. La elución se controla sobre la base de la absorción (λ: 410 nm y 280). Recoger sólo la fracción caracteriza por un color rojo brillante y un pico de absorción prominente (Figura 1).
- Dializar la elución contra salina tamponada con fosfato (PBS) durante la noche y luego durante unas pocas horas más. Esterilizar mediante el paso a través de un filtro de 0,22 micras jeringa.
- Para medir la concentración de Hb, preparar las soluciones estándar de concentraciones conocidas de Hb en PBS. Determinar la concentración de Hb en la muestra mediante la mezcla de las soluciones patrón (véase la tabla con reactivos nosotrosed) o la solución de la muestra con el reactivo de Drabkin 2x (preparado a partir de polvo) en una relación 1:1. Por ejemplo, mezclar 100 l solución de Hb con 100 l de reactivo de Drabkin 2x en placas de 96 pocillos. Incubar durante 15 min y la absorbancia medida a 540 nm. Trazar una curva estándar y determinar la concentración de Hb en la muestra. Cinco a quince mg / ml rendimientos son típicos.
- Ejecutar 15-20 g hemoglobina purificada en un 15% SDS-PAGE por duplicado. Mancha de uno de los geles; transferir las proteínas a partir de otro gel a una membrana de nitrocelulosa y de inmunotransferencia para la hemoglobina (Figura 2).
- Congelar y almacenar alícuotas de 1 ml de hemoglobina en nitrógeno líquido.
2. Preparación de hierro agotan Medios de Crecimiento
- Preparar Roswell Park Memorial Institute (RPMI) caldo disolviendo el polvo RPMI en agua, añadir bicarbonato de sodio según lo recomendado por el fabricante y el 1% de ácidos cassamino (CA) (w / v). Esterilizar mediante el paso a través de un filtro de 0,2 micras y refrigerador tiendaerated.
- Preparar metálica empobrecida en RPMI (NRPMI) mediante la adición de 7% (w / v) Chelex 100 y mezcla durante la noche en una placa de agitación. Eliminar Chelex 100 pasando a través de un filtro de 0,2 micras y almacén refrigerado. Suplemento medios imprescindibles de metales no ferrosos: 25 mM ZnCl 2, 25 mM MnCl 2, 100 mM CaCl 2 y 1 mM MgCl 2, preparado de antemano como una solución estéril x 1.000. Use recipientes desechables de plástico para este paso para evitar la contaminación de hierro de re-utilizables suministros.
3. Staphylococcus aureus Crecimiento utilizando hemoglobina como una única fuente de hierro
- Streak S. para el aislamiento de S. aureus en agar tripticasa soja (TSA) de un stock congelado. Incubar a 37 ° C durante 20-24 h.
- Resuspender etilendiamina-N, N'-bis (2-hidroxifenilacético) (EDDHA) en etanol anhidro a 100 mM. EDDHA no entra en solución, pero se esteriliza por etanol.
- Añadir EDDHA de RPMI a una concentración final de 0,5 mM. PermitirEDDHA para disolver durante al menos 30 min antes de proceder al siguiente paso. Debido a la variación de lote a lote, la concentración final EDDHA puede ser necesario disminuir a 0,25 mm para permitir el crecimiento bacteriano.
- Inocular colonias individuales de S. aureus en 5 ml de RPMI que contiene EDDHA en 15 ml con tapón de rosca tubos cónicos. Incubar a 37 ° C con agitación a 180 revoluciones por minuto (rpm) durante 16-20 h.
- Centrifugar los cultivos de una noche durante 5 min a 7.500 xg y resuspender el precipitado en NRPMI que contiene 0,5 mM EDDHA. Normalizar OD 600 a ~ 3.
- Preparar NRPMI que contiene 2,5 g por ml Hb y EDDHA 0.1-1.0 mM. Debido a la variación entre los lotes, la concentración de EDDHA requerido para quelar el hierro libre en NRPMI puede variar.
- Subculture 10 l de suspensión bacteriana de la etapa 1 en 3,5 ml NRPMI + EDDHA + Hb en un 15 ml con tapón de rosca tubo cónico.
- Incubar los cultivos a 37 ° C durante un máximo de 48 horas con agitación a 180 rpm o en un tambor de enrollamiento.
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Representative Results
Hemos purificado hemoglobina humana de hemolizado con HPLC (Protocolo de paso 1,7). Figura 1 muestra registró la absorbancia del eluato a 280 y 410 nm longitud de onda. La fracción 5 se recogió y otras fracciones fueron descartados. Los rendimientos de cinco a quince miligramos de hemoglobina por mililitro de eluato se adquieren. Hemoglobina purificada se analizó por SDS-PAGE por duplicado y los geles se tiñeron para las proteínas o se trasladaron a nitrocelulosa y se inmunotransfirieron (Protocolo de paso 1,10, Figura 2).
Hemos evaluado la capacidad de la hemoglobina humana purificada para apoyar el crecimiento de tipo salvaje S. aureus y S. aureus que carece de la componente del sistema ISDB Isd (Δ ISDB). ISDB es un receptor de hemoglobina que se requiere para la hemoglobina derivada de la adquisición de hierro 12. Tipo salvaje y Δ ISDB fueron cultivadas en hierro agotado el medio suplementado con hemog humano Lobin (NRPMI + + EDDHA Hb) como se describe en la sección 3 del protocolo. Cuando se cultiva en NRPMI + EDDHA + Hb, pero no de tipo salvaje Δ ISDB es capaz de proliferar como se indica por un aumento en la densidad óptica de los cultivos con el tiempo (Figura 3A). En contraste, la capacidad de utilizar complementado libre de hierro (+ FeCl 3) es idéntico en el tipo salvaje y Δ ISDB (Figura 3B). Ni el tipo salvaje ni ISDB Δ proliferan en ausencia de una fuente de hierro (Figura 3B).
Hemos comparado el crecimiento de S. aureus en NRPMI + EDDHA suplementado con hemoglobina purificada a partir de la sangre fresca o liofilizada hemoglobina. Figura 4 ilustra que mientras que la hemoglobina purificada a partir de la sangre requiere ISDB para el crecimiento, la hemoglobina liofilizado permite la proliferación de Δ ISDB.
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Figura 1. La absorción de las fracciones de elución durante la purificación de la hemoglobina. Absorción a 410 nm (específico para hemo-proteínas de unión) y 280 nm (característica para todas las proteínas) se controló a lo largo de la elución. Número de fracción contenía cinco hemoglobina y se recogió.
Figura 2. Hemoglobina humana purificada Veinte microgramos de hemoglobina purificada se separó usando desnaturalizante 15% SDS-PAGE. A. Gel teñido para las proteínas con Bio-Rad proteína colorante reactivo de ensayo. B. membrana de nitrocelulosa a inmunotransferencia para la hemoglobina. La intensa banda inferior es un monómero de hemoglobina, mientras que las bandas superiores más débiles son dímeros de hemoglobina y tertramers, que no recibieron completamente desnaturalizado.
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Figura 3. El uso de la hemoglobina humana como una fuente de hierro por S. aureus A. Crecimiento de tipo salvaje (wt) o isogénica hemoglobina receptor ISDB mutante (Δ ISDB) en NRPMI suplementado con quelante de hierro EDDHA y hemoglobina humana es estadísticamente diferente según se determina por dos colas prueba t de Student, p <0,05. B. Crecimiento en NRPMI suplementado con 10 mM de cloruro de hierro (+ FeCl 3) o EDDHA (-FeCl 3) no es diferente entre peso y ISDB Δ. Los gráficos representan los datos de un experimento representativo, que comprendía tres repeticiones biológica. Las barras de error indican la desviación estándar de las lecturas de densidad óptica en los puntos de tiempo indicados entre las repeticiones.
Figura 4. Crecimiento de tipo salvaje (wt) o m isogénica hemoglobina receptorutant (Δ ISDB) en medios suplementados con hemoglobina purificada a partir de sangre fresca o liofilizada hemoglobina. El gráfico muestra los datos de un experimento representativo, que incluía tres repeticiones biológica. Las barras de error representan la desviación estándar de las lecturas de densidad óptica en los puntos de tiempo indicados entre las repeticiones. Los asteriscos indican los valores que son estadísticamente diferentes como se determina por dos colas prueba t de Student, p <0,05.
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Discussion
El hierro es un nutriente esencial requerido por los organismos de todos los reinos de la vida 15. En los vertebrados, el hierro es retenido para evitar la toxicidad causada por este elemento. Este secuestro también oculta de hierro de los microbios invasores en un proceso conocido como inmunidad nutricional 16. En respuesta, los patógenos han desarrollado estrategias que evitan la inmunidad nutricional. Uno de estos mecanismos depende de la hemoglobina, que es la fuente más abundante de hierro dentro del huésped 17. La hemoglobina está contenida dentro de las células rojas de la sangre. La hemoglobina liberada de los glóbulos rojos dañados está obligado por haptoglobina anfitrión, lo que indica una rápida eliminación de los complejos hemoglobina-haptoglobina por los macrófagos 18. Con el fin de obtener acceso a la hemoglobina, S. aureus expresa hemolisinas que lisan los glóbulos rojos 19. Haptoglobina-hemoglobina inducida eliminación es contrarrestada por la unión de alta afinidad de la hemoglobina por los receptores de superficie celular expresadas por
Numerosos estudios han demostrado la contribución del sistema a la infección Isd 8,10-14. Además, los estudios bioquímicos han asignado las funciones de sus componentes individuales en la hemoglobina derivada de la adquisición de hierro 4-9. Aquí se describe un ensayo que monitorea el crecimiento de S. aureus con la hemoglobina como la única fuente de hierro disponible. A este respecto, hay que señalar ciertas condiciones que son fundamentales para el éxito del experimento.
La calidad y el tipo de reactivos utilizados en derivados de hemoglobina ensayos de crecimiento de adquisición de hierro pueden influir drásticamente en el obte resultadosNED en estos ensayos. En contraste con la hemoglobina a partir de sangre fresca de hemoglobina, que se almacena en forma liofilizada permite el crecimiento bacteriano independiente de los componentes del sistema de Isd (Figura 4) 21. Esto es probablemente debido a los cambios en la estructura de la hemoglobina que son inducidos por liofilización. Específicamente, la hemoglobina liofilizado contiene tetrámeros, dímeros y monómeros de hemoglobina, así como hemo en su forma libre 22. La purificación de la hemoglobina de la sangre fresca y su conservación en nitrógeno líquido asegurar la integridad de la proteína de 22. La investigación extensa sobre la hemoglobina ha facilitado el desarrollo de protocolos para la purificación de la hemoglobina de alta calidad a partir de sangre fresca o en forma recombinante, que puede ser utilizado en nuestro ensayo de 23-25.
La elección del agente quelante del hierro puede afectar el ensayo de crecimiento. Por ejemplo, 2,2-dipiridilo, que se utiliza con frecuencia como un agente quelante del hierro, es tóxicopara las células bacterianas 26. Estos dos efectos hacen que sea difícil discernir si la inhibición del crecimiento bacteriano por 2,2-dipiridilo es debido a la quelación de hierro o toxicidad. Además, 2,2-dipiridilo es probable que sea membrana permeable, y por lo tanto penetra en la célula bacteriana y quelatos de hierro intracelular 27. Se ha encontrado que la inhibición del crecimiento por EDDHA se invierte por la suplementación de una fuente de hierro, lo que hace EDDHA un agente quelante del hierro más adecuado para ensayos de crecimiento bacteriano. Sin embargo, la concentración de EDDHA que necesita ser añadido al medio de crecimiento puede variar. Esto es debido a la variación de la potencia tanto EDDHA y medio de crecimiento contenido en hierro de lote a lote. La actividad quelante de hierro puede ser normalizado entre lotes de EDDHA químicamente por la eliminación de hierro residual 28. Sin embargo, debido a la variación entre lotes de RPMI, se encontró que la concentración final de EDDHA todavía puede necesitar ser ajustado para permitir el crecimiento en presencia de una fuente de hierro. Encontramos ªa la mayor concentración de EDDHA que es permisiva para el crecimiento de tipo salvaje S. aureus en presencia de la hemoglobina es óptimo para este experimento.
Se pueden hacer modificaciones al protocolo actual para parecerse más a la ambiente encontrado por las bacterias durante la infección. Por ejemplo, dentro del huésped, que se libera del hemo de la hemoglobina se une rápidamente por hemopexina. Hemopexina no puede ser utilizado como una fuente de hierro por S. aureus, por lo tanto, su adición sería prevenir la adquisición de hemo de la hemoglobina liberada durante la incubación con S. aureus 12.
Creemos que este ensayo se puede utilizar para la investigación de adquisición de metal por una variedad de patógenos bacterianos. Además, este método puede ser usado para medir la adquisición de hierro procedente de fuentes no de hemoglobina de hierro que están presentes en el huésped.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por los EE.UU. Servicio de Salud Pública de subvenciones AI69233 y AI073843 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. EPS es un compañero Burroughs Wellcome en la patogénesis de las enfermedades infecciosas. KPH fue financiado por el Celular y Molecular Microbiología Programa de Entrenamiento de subvención T32 5 A107611-10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC anion exchange column | Varian | PL1551-3802 | |
| Drabkin's reagent | Sigma | D5941-6VL | |
| Hemoglobin standard | Pointe Scientific | H7506-STD | |
| RPMI | HyClone | SH30011.02 | |
| Chelex 100 sodium form | Sigma | C7901 | |
| EDDHA | LGC Standards GmbH | ANC 001 | |
| Hemoglobin a antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc | SC-21005 | |
| Tryptic soy agar | BD | 236920 |
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