और स्टेप - विकास खूंटी पेप्टाइड Hydrogels से β सेल spheroids का सृजन वसूली
Summary
निम्न प्रोटोकॉल कदम विकास खूंटी पेप्टाइड thiol ene फोटो क्लिक प्रतिक्रियाओं द्वारा गठित hydrogels में अग्नाशय β-कोशिकाओं encapsulating के लिए तकनीक प्रदान करता है. इस सामग्री को मंच न केवल सेल encapsulation के लिए एक cytocompatible microenvironment प्रदान करता है, लेकिन यह भी उपयोगकर्ता नियंत्रित सेल संरचनाओं के तेजी से वसूली hydrogels भीतर गठित परमिट.
Abstract
Hydrogels हाइड्रोफिलिक Crosslinked पॉलिमर कि लोच और संवर्धन therapeutically प्रासंगिक कोशिकाओं या ऊतकों के लिए उच्च पारगम्यता ऊतक की तरह साथ एक microenvironment तीन आयामी प्रदान कर रहे हैं. पाली (ethylene glycol) (खूंटी) डेरिवेटिव से तैयार Hydrogels तेजी से ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए उपयोग किया जाता है, उनके tunable और cytocompatible गुणों की वजह से भाग में. इस प्रोटोकॉल में, हम thiol – ene कदम विकास photopolymerizations का उपयोग अग्नाशय MIN6 ख कोशिकाओं encapsulating के लिए खूंटी पेप्टाइड hydrogels बनाना. जैल 4 हाथ खूंटी norbornene (PEG4NB) macromer और एक पेप्टाइड काइमोट्रिप्सिन संवेदनशील crosslinker (CGGYC) द्वारा गठित किया गया. खूंटी की हाइड्रोफिलिक और गैर – दूषण प्रकृति सेल अस्तित्व और 3 डी में प्रसार के लिए एक cytocompatible microenvironment प्रदान करता है, जबकि काइमोट्रिप्सिन के प्रति संवेदनशील पेप्टाइड (अनुक्रम का उपयोग सी GGY ↓ सी, तीर एंजाइम दरार साइट को इंगित करता है, जबकि टर्मिनल पुटीEine अवशेषों thiol ene crosslinking के लिए जोड़ा गया था) सेल hydrogel भीतर बनाने constructs की तेजी से वसूली की अनुमति देता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए तकनीक बताते हैं: (1) thiol ene hydrogels में MIN6 β कोशिकाओं के इनकैप्सुलेशन, (2) गुणात्मक और मात्रात्मक सेल व्यवहार्यता assays सेल अस्तित्व और प्रसार का निर्धारण करने के लिए, (3) सेल spheroids की वसूली काइमोट्रिप्सिन की मध्यस्थता जेल का प्रयोग कटाव, और (4) बरामद spheroids की संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण.
Introduction
Hydrogels मरम्मत और regenerating ऊतकों के लिए मचान सामग्री के रूप में असाधारण क्षमता के साथ हाइड्रोफिलिक Crosslinked पॉलिमर hydrogels के 1-3 उच्च पानी सामग्री ऑक्सीजन और पोषक तत्वों और सेलुलर चयापचय उत्पादों, जो सभी के सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं के आदान – प्रदान के लिए आसान प्रसार परमिट. इसके अलावा, hydrogels नियंत्रित रिहाई और उनके उच्च tunability कारण सेल डिलीवरी के लिए उत्कृष्ट वाहक हैं पाली (ethylene glycol) (खूंटी) से तैयार उन लोगों के रूप में 2 सिंथेटिक hydrogels तेजी से ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में प्रयोग किया जाता है, बड़े पैमाने पर की वजह से उनके cytocompatibility, ऊतक तरह लोच, और शारीरिक और यांत्रिक गुणों की सामग्री में उच्च tunability 4-6.
आमतौर पर इस्तेमाल किया hydrogel मंच हालांकि, अध्ययन से पता चला है कि खूंटी (PEGDA) diacrylate hydrogels चेन विकास photopolymerizations द्वारा का गठन एक प्रवृत्ति को समझाया कोशिकाओं duri नुकसान पहुंचा हैएनजी नेटवर्क और स्वस्थानी सेल encapsulation में crosslinking 7 सेलुलर क्षति बड़े पैमाने जो PEGDA पर vinyl समूहों के माध्यम से crosslink hydrogels में बहुलक श्रृंखला के लिए प्रचार photoinitiator अणु, कट्टरपंथी उत्पन्न प्रजातियों के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था. दुर्भाग्य से, इन कट्टरपंथी प्रजातियों को भी सेल encapsulation के दौरान तनाव और सेलुलर क्षति के कारण, 8-10 β कोशिकाओं अग्नाशय के रूप में कट्टरपंथी के प्रति संवेदनशील कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से आदेश में बेहतर प्रसार और सेल अस्तित्व, उच्च आणविक भार PEGDA के लिए एक उच्च जाल आकार प्राप्त अक्सर सेल encapsulation के लिए इस्तेमाल किया जाता है. यह, हालांकि, polymerization कैनेटीक्स समझौता है और उप इष्टतम जेल biophysical गुण का कारण बनता है 7,11,12 ऊपर उल्लेख किया है नुकसान के अलावा, यह बहुत मुश्किल है PEGDA hydrogels से सेल संरचनाओं विविधता और गैर degradable की प्रकृति की वजह से ठीक करने के लिए. Crosslinked नेटवर्क. जबकि protease-संवेदनशील पेप्टाइड्स शामिल किया जा सकता हैखूंटी macromer अन्यथा निष्क्रिय PEGDA enzymatic दरार के प्रति संवेदनशील hydrogels रेंडर रीढ़ की हड्डी में विकार अक्सर महंगी अभिकर्मकों का उपयोग करता है और परिणामस्वरूप नेटवर्क अभी भी चेन विकास polymerization की प्रकृति के कारण विविधता के उच्च स्तर होते हैं 13-15.
हाल ही में, खूंटी पेप्टाइड कदम विकास photopolymerization thiol ene के माध्यम से गठित hydrogels hydrogels चेन विकास photopolymerization द्वारा का गठन से अधिक सेल encapsulation के लिए तरजीही गुण एक्ज़िबिट दिखाया गया है 7 thiol – ene hydrogels के बेहतर जमाना कैनेटीक्स 'पर क्लिक करने के लिए जिम्मेदार ठहराया है. 'thiol और ene functionalities के बीच प्रतिक्रिया की प्रकृति. चेन PEGDA polymerization के विकास की तुलना में, thiol ene प्रतिक्रिया कम ऑक्सीजन तेज जमाना दर में जो परिणाम है. हिचकते 16,17 thiol ene hydrogels भी उच्च polymerization दक्षता और बेहतर जेल श्रृंखला विकास PEGDA hydrogels, 7 की तुलना biophysical गुण है 18, </> समर्थन सीमित सेलुलर photopolymerization दौरान कट्टरपंथी प्रजातियों की वजह से नुकसान में जो परिणाम है.
इससे पहले, 4 हाथ खूंटी norbornene (PEG4NB के) macromer और बीआईएस सिस्टीन युक्त इस तरह के रूप में पेप्टाइड crosslinkers, thiol ene hydrogels द्वारा गठित protease-संवेदनशील पेप्टाइड्स सेल encapsulation के लिए उपयोग किया गया है. 7,18 खूंटी hydrogel नेटवर्क के उच्च tunability एक प्रदान करता है सेल अस्तित्व और गतिविधि की जांच करने के लिए लचीला और नियंत्रणीय 3D microenvironment, जबकि protease-संवेदनशील पेप्टाइड अनुक्रम का उपयोग सेल hydrogels के भीतर स्वाभाविक रूप से गठित constructs की वसूली के लिए एक हल्के तरीका प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल में हम कदम विकास photopolymerized hydrogels thiol ene 4 हाथ (PEG4NB) खूंटी norbornene और काइमोट्रिप्सिन β MIN6 – कोशिकाओं के encapsulation के लिए संवेदनशील पेप्टाइड crosslinker (CGGY ↓ सी) गढ़े का उपयोग का उपयोग. इस प्रोटोकॉल व्यवस्थित MIN6 के अस्तित्व के प्रसार, और उपगोल गठन का अध्ययन करने के लिए तकनीक बतातेthiol – ene hydrogels में β कोशिकाओं. हम आगे β सेल उपगोल वसूली और बरामद spheroids के जैविक लक्षण वर्णन के लिए विधि प्रदान करते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल thiol ene कदम विकास photopolymerization द्वारा गठित hydrogels में कोशिकाओं की आसान encapsulation पर विवरण प्रस्तुत करता है. जबकि norbornene के 1:1 के एक stoichiometric thiol कार्य समूहों अनुपात इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था, अनुपा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना (R21EB013717) NIH और IUPUI OVCR (RSFG) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. लेखक उसे तकनीकी सहायता के लिए सुश्री हान Shih धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
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