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Bioengineering

Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele

doi: 10.3791/50081 Published: December 6, 2012

Summary

Das folgende Protokoll stellt Techniken zur Verkapselung Pankreas β-Zellen in Schritt-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele durch Thiol-En-Foto-Klick-Reaktionen gebildet. Dieses Material-Plattform bietet nicht nur eine cytocompatible Mikroumgebung für Zellverkapselung, sondern erlaubt auch benutzergesteuerten rasche Erholung von Zellstrukturen innerhalb der Hydrogele gebildet.

Abstract

Hydrogele sind hydrophile, vernetzte Polymere, die eine dreidimensionale Mikroumgebung mit Gewebe-ähnliche Elastizität und hohe Durchlässigkeit für Kultivieren therapeutisch relevante Zellen oder Gewebe bereitzustellen. Hydrogele aus Poly (Ethylenglykol) (PEG)-Derivate hergestellt werden zunehmend für eine Vielzahl von Gewebe-Engineering-Anwendungen verwendet, zum Teil aufgrund ihrer abstimmbaren und cytocompatible Eigenschaften. Bei diesem Protokoll, verwendeten wir Thiol-En-Schritt-Wachstum Photopolymerisationen bis PEG-Peptid Hydrogele zur Verkapselung pankreatischen MIN6 b-Zellen herzustellen. Die Gele wurden durch 4-Arm PEG-Norbornen (PEG4NB) Makromer und Chymotrypsin-sensitive Peptid Vernetzer (CGGYC) gebildet. Die hydrophilen und nicht-Fouling Art PEG bietet eine cytocompatible Mikroumgebung für das Überleben der Zelle und die Proliferation in 3D, während die Verwendung von Chymotrypsin-sensitive Peptidsequenz (C GGY ↓ C, gibt der Pfeil Enzymspaltstelle, während Endgerät ZysteEine Rückstände wurden Thiol-En-Vernetzung hinzugefügt) ermöglicht die schnelle Wiederherstellung von Zellkonstrukte bilden innerhalb des Hydrogels. Das folgende Protokoll ausarbeitet Techniken für: (1) Verkapselung von MIN6 β-Zellen in Thiol-En-Hydrogele, (2) Qualitative und quantitative Zelllebensfähigkeit Assays zum Zellüberleben und Proliferation zu bestimmen, (3) Wiedergewinnung von Zellen Sphäroide mit Chymotrypsin-vermittelte Gel Erosion; und (4) Strukturelle und funktionelle Analyse der gewonnenen Sphäroide.

Introduction

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Hydrogele sind hydrophile vernetzte Polymere mit außergewöhnlichem Potenzial als Gerüstmaterial für die Reparatur und Regeneration von Geweben. 1-3 Der hohe Wassergehalt der Hydrogele ermöglicht eine einfache Diffusion von Sauerstoff und Austausch von Nährstoffen und zellulären Stoffwechsel-Produkte, die alle entscheidend für die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen sind. Zusätzlich Hydrogele ausgezeichnete Träger für die kontrollierte Freisetzung und Zellabgabesystem aufgrund ihrer hohen Abstimmbarkeit sind. 2 Synthetisches Hydrogele, wie sie aus Poly (Ethylenglykol) (PEG) hergestellt werden zunehmend in Tissue Engineering-Anwendungen verwendet, hauptsächlich wegen ihrer cytocompatibility, gewebespezifische Elastizität und hohe Abstimmbarkeit Material-physikalischen und mechanischen Eigenschaften. 4-6

Obwohl eine häufig verwendete Hydrogel Plattform haben Studien gezeigt, dass PEG-diacrylat (PEGDA) Hydrogele durch Ketten-Wachstum gebildet Photopolymerisationen eine Tendenz zu beschädigen eingekapselt Zellen haben During Netzwerk Vernetzung und in situ Zelleinkapselungsvorrichtung. 7 Die Zellschädigung wurde weitgehend Radikalspezies von den Photoinitiator-Moleküle, die durch die Vinylgruppen an PEGDA zu vernetzen Polymerketten in Hydrogele Propagation generiert wird. Leider sind diese Radikalspezies auch verursachen Spannungen und Zellschäden während Zelleinkapselungsvorrichtung, insbesondere für Rest-empfindlichen Zellen wie Pankreas-β-Zellen. 8-10 Um eine höhere Maschengröße für eine bessere Diffusion und Zellüberleben höheren Molekulargewichten erhalten PEGDA werden häufig für Zellverkapselung verwendet. Dies ist jedoch beeinträchtigt Polymerisationskinetik und bewirkt suboptimalen Gel biophysikalischen Eigenschaften. 7,11,12 Zusätzlich zu den oben genannten Nachteilen, ist es sehr schwierig ist, Zellstrukturen von PEGDA Hydrogele erholen aufgrund der Heterogenität und nicht abbaubaren Natur die vernetzten Netzwerken. Während Protease-sensitiven Peptide eingebaut werden könnenin PEG Makromergerüst die ansonsten inert PEGDA Hydrogele empfindlich gegenüber enzymatischer Spaltung zu rendern, die Konjugation verwendet häufig teure Reagenzien und die erhaltenen Netze enthalten noch hohe Heterogenität aufgrund der Art von Kette-Wachstum Polymerisation. 13-15

Kürzlich wurden PEG-Peptid-Hydrogele über Schritt-Wachstum Thiol-En-Photopolymerisation gebildet wurde gezeigt, dass bevorzugte Eigenschaften für Zell-Kapselung über Hydrogele durch Ketten-Wachstum Photopolymerisation gebildet aufweisen. 7 Die Superior Gelierung Kinetik der Thiol-En-Hydrogele zur Klick zurückzuführen "Natur der Reaktion zwischen Thiol-und En-Funktionalitäten. Im Vergleich zu Ketten-Wachstum Polymerisation von PEGDA ist Thiol-En-Reaktion weniger Sauerstoff inhibiert, was zu einer schnelleren Gelierung bewerten. 16,17 Thiol-En-Hydrogele haben auch höhere Polymerisation Effizienz und bessere Gel biophysikalischen Eigenschaften im Vergleich zu Ketten-Wachstum PEGDA Hydrogele, 7 , 18 </ Sup> was ergibt begrenzten Zellschäden durch Radikale während der Photopolymerisation verursacht.

Zuvor Thiol-En-Hydrogele durch 4-Arm-PEG-norbornen (PEG4NB) Makromer und Bis-Cystein enthaltende Peptid Vernetzern wie gebildeten Protease-sensitive Peptide wurden für Zelleinkapselungsvorrichtung verwendet worden. 7,18 Breitband Abstimmbarkeit PEG Hydrogel Netzwerke bietet eine flexible und steuerbare 3D-Mikroumgebung für die Untersuchung Zellüberleben und Aktivität, während die Verwendung von Protease-sensitive Peptidsequenz eine milde Weise zur Rückgewinnung des Zellkonstrukte natürlich innerhalb Hydrogele gebildet. In diesem Protokoll verwenden wir Stufenwachstum photopolymerisierten Thiol-En-Hydrogelen hergestellt unter Verwendung von 4-Arm-PEG-norbornen (PEG4NB) und eine Chymotrypsin-sensitive Peptid Vernetzer (CGGY ↓ C) für die Einkapselung von MIN6 β-Zellen. Dieses Protokoll systematisch erarbeitet Techniken zur Untersuchung das Überleben, die Proliferation und Sphäroidbildung der MIN6β-Zellen in Thiol-En-Hydrogele. Wir bieten weitere Methode zur β-Zell-Sphäroid Erholung und biologische Charakterisierung der gewonnenen Sphäroide.

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Protocol

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A. Makromer und Peptidsynthese

  1. Synthetisieren 4-Arm PEG-Norbornen (PEG4NB) und Photoinitiator Lithium arylphosphanate (LAP) mit etablierten Protokollen. 18,19
  2. Synthetisieren Bis-cysteinhaltigen Chymotrypsin-sensitive Peptid CGGY ↓ C (Pfeil zeigt Chymotrypsin-Spaltstelle) unter Verwendung von Standard Festphasenpeptidsynthese in einer Mikrowelle Peptidsynthesizer (CEM Discover SPS).
    1. Den Gehalt an Harz (Rink-Amid-MBHA-Harz) notwendig nach Substitutionsmuster Verhältnis des Harzes und der Synthese-Skala. Aufquellen des Harzes in Dimethylformamid (DMF) in einem Reaktionsgefäß (RV) für 15 min.
    2. Entfernen Fmoc-Schutzgruppe von dem Harz unter Verwendung einer Entschützung Lösung mit 20% Piperidin und 0,1 M HOBt in DMF. Verwenden Sie die Parameter in der nachstehenden Tabelle für die Mikrowellen-unterstützte Fmoc-Entschützung (für alle Fmoc-Aminosäuren) aufgeführt:
      Synthesemaßstab 0,1 mmol 0,2 mmol
      Power 20 W 50 W
      Temperatur 75 ° C 75 ° C
      Zeit 3 min 3 min
    3. Nach Entschützung, spült das Harz mit DMF und führen Ninhydrin-Test, um das Entfernen von Fmoc (Belichtung von N-terminalen Amin) bestätigen. Resin sollte sich nach 2 min blau bei 95 ° C.
    4. Nach erfolgreicher Entschützung, Koppeln des ersten Fmoc-Aminosäure an den C-Terminus (Synthese läuft vom C-zum N-Terminus) in einem Aktivator Basenlösung (0,28 M Diisopropylethylamin (DIEA) in DMF) mit den Parametern in der nachfolgenden Tabelle aufgelistet .
      Synthesemaßstab 0,1 mmol 0,2 mmol
      Power 20 W 50 W
      Temperatur * 75 ° C 75 ° C
      Time * 5 min 5 min

      * Für Zyste und Sein, verwenden 50 ° C und 10 min zur Racemisierung zu reduzieren.
    5. Anschließend wird das Harz und führen Ninhydrin zum qualitativen Bestätigung der Vollendung der Kupplung (Verschwinden der N-terminalen Amin). Resin sollte nach 5 min klar bei 95 ° C. Wiederholen Kupplungsschritt (A.2.d), wenn Ninhydrin-Test liefert positives Ergebnis (Farbe blau).
    6. Wiederholen Schutzgruppenabspaltung (Schritt A.2.b) und Kupplung (Schritt A.2.d) für zusätzliche Aminosäuren in der Sequenz endet mit einem letzten Entschützungsschritt.
    7. Lassen Sie das RV gründlich Harz mit 25 ml Dichlormethan (DCM). Dieser Schritt ist abzuspülen DMF, der eine Basis ist und Peptidspaltung behindern.
    8. Bereiten Spaltungscocktail durch Mischen 250 mg Phenol in 4,75 ml Trifluoressigsäure (TFA), 0,125 ml Triisopropylsilan (TIS) und 0,125 ml ddH 2 O.
    9. Hinzufügen Spaltlösung in die RV und spalten für 30 min in der Mikrowelle Peptidsynthesizer (Leistung = 20 W, Temperatur = 38 ° C).
    10. Sammeln die Peptidlösung in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen unter Verwendung Vakuumkammer.
    11. Niederschlag gespaltene Peptid in 40 ml Ether, das Röhrchen vortexen und zentrifugieren bei 3.000 rpm für 5 min zu sammeln, die das Peptid.
    12. Lassen Sie den Überstand und wiederholen Sie Schritt A.2.k zweimal.
    13. Sammeln und trocknen Peptid im Vakuum.
    14. Reinige das Peptid mittels HPLC und Charakterisierung mit Massenspektrometrie.

B. Material Vorbereitung und Sterilisation

  1. Bereiten 20 Gew.% PEG4NB Lösung in PBS, Wirbel die Mischung, bis das Makromer vollständig auflöst und sterilisieren das Makromer-Lösung mit einer Spritze Filter. Bewahren Sie den sterilisierten Lösung bei -20 ° C (Aliquotsfür Langzeitlagerung).
  2. Vorzubereiten und zu sterilisieren 2 Gew.% Photoinitiator (LAP)-Lösung in PBS. Bewahren Sie den sterilisierten Lösung bei Raumtemperatur vor Licht geschützt.
  3. Man löst das Peptid (CGGYC) in PBS, das Gemisch Wirbel und Spritze filtrieren zur Sterilisation. Aliquot der Peptid-Lösung und bei -20 ° C bis zur Verwendung (zu verhindern Frost-Tau-Zyklen).
  4. Bestimmen Thiol (-SH)-Konzentration in der vorbereiteten Peptid-Lösung mit Ellman-Reagenz (folgen Sie dem Protokoll des Herstellers). Dieser Schritt gibt genaue Peptidkonzentration (dh [SH] / 2), die zum Berechnen der Menge an Peptid Thiol-En-Foto-Klick Reaktionen verwendet werden benötigt.
  5. Bereiten Gelierformen, indem Sie den oberen Teil weg von sterilen 1 ml Einwegspritzen mit einer Rasierklinge (offene Spitze für Gel-Entfernung). Sterilisieren Sie die Spritze Formen durch Autoklaven.
  6. Basierend auf der gewünschten Gel-Formulierung (Thiol En-Verhältnis = 1) und die Konzentrationen der Lager MateMaterialien, berechnen die erforderliche Menge Polymer, Peptid Vernetzer, Photoinitiator und Pufferlösungen erforderlich.

C. Cell Preparation

  1. Äquilibrieren Zellkulturmedium (high Glucose DMEM, das 10% fötales Rinderserum; Antibiotika-Antimykotisches mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 250 ng / ml Fungizon und 50 pM β-Mercaptoethanol), ausgeglichene Hank-Salzlösung ( HBSS, Ca 2 +, Mg 2 + frei) und Trypsin-EDTA auf 37 ° C.
  2. Entfernen Kolben mit MIN6 β-Zellen aus CO 2-Inkubator und die Kolben in der Laminarströmungshaube.
  3. Absaugen Zellkulturmedien aus den Flaschen und spülen Sie die Zelle mit HBSS.
  4. Trypsinieren die Zellen mit 3 ml von 2X (0,1%) Trypsin-EDTA und Inkubation der Flaschen für 4 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
    • Hinweis: Verwenden Sie 2X Trypsin-Lösung ermöglicht vollständige Dissoziation MIN6 β-Zellen in einzelne Zellen in Suspension.
    </ Li>
  5. Nach der Inkubation, tippen Sie die Flaschen auf der Oberfläche der Haube vorsichtig vollständig lösen die Zellen. Bestätigen Sie die Ablösung und Dissoziation der Zellen unter dem Mikroskop.
  6. Hinzufügen gleichen Volumen Zellkulturmedium, um das Trypsin zu neutralisieren. Mischen Sie die Lösung auch durch vorsichtiges Pipettieren, dann die Masse in eine kanonische Rohr und Zentrifuge für 5 min bei 1.000 Umdrehungen pro Minute.
  7. Überstand und sanft wieder die Zellen in 4 - 5 ml von Kulturmedien.
  8. Bestimmen Zelldichte mit 50% Trypanblau Puffer in einer Zählkammer.

D. Hydrogel Fabrication and Cell Encapsulation

  1. Sobald die Zellen bereit, Mischung (bezogen auf 1:1-ene Thiol-Verhältnis) die erforderlichen Volumina der PEG4NB, CGGYC, LAP, Zelllösung, und HBSS in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Mische die Lösung vorsichtig mit einer Pipette, um eine homogene Mischung zu erhalten und werden 25 ul der resultierenden Lösung mit einer Spritze Form. Setzen der Spritze mit UV-Licht (365nm, 5 mW / cm 2) während 2 min.
  3. Nach Photopolymerisation, Tauchbecken Gele in einer sterilen 24-Well-Platte mit Zellkulturmedium und bebrüten die Hydrogele in 37 ° C und 5% CO 2.
  4. Waschen Sie die Zellen beladenen Hydrogele in Zellkulturmedium für 30 min zu spülen locker anhaftenden Zellen und unvernetzten Makromere. Übertragen Sie die Gele in frisches Medium.
  5. Aktualisieren Zellkulturmedien alle 2 bis 3 Tage.

E. Zelllebensfähigkeit Assay

Encapsulated Zellmorphologie beobachtet mit Lichtmikroskop (da die synthetisierten Hydrogele transparent sind). Die Lebensfähigkeit der Zellen können visualisiert werden und qualitativ mit Live / Dead-Färbung und quantitativ mit AlamarBlue Reagenz gemessen.

E.1. Live / Dead-Färbung

  1. Auftauen Live / Dead Färbereagenzien bei Raumtemperatur.
  2. In kanonischer Rohrs hinzuzufügen PBS gemäß der Anzahl von Abtastungen (n) zu färbenden:
    Gesamtvolumen der PBS = n × 500 ul
  3. Pipette 0,25 ul Calcein AM und 2 ul EthD-1 pro 1 ml PBS auf die kanonische Röhrchen mit PBS. Vortex die Lösung, um die Komponenten zu mischen.
  4. Inkubieren Zell-beladenen Hydrogele in Live / Dead Färbelösung (0,5 ml / Probe) für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.
  5. Mit einer Pasteurpipette, entfernen Sie die Farbstofflösung und spülen die Probe zweimal mit PBS.
  6. Zeigen Probe auf einem Deckglas oder Objektträger aus Glas. Beobachten und Bildzellen mit einem konfokalen Mikroskop.

E.2. AlamarBlue Assay

  1. Planen 10 v / v% AlamarBlue Lösung in Zellkulturmedium.
  2. Entfernen Hydrogele aus Inkubator und saugen die Medien aus jeder Vertiefung, ohne jeden Kontakt mit dem Hydrogel.
  3. Inkubieren Zell-beladenen Hydrogele und einen leeren Brunnen (negative Kontrolle) in 500 ul 10% AlamarBlue Lösung für 16 Stunden.
  4. Nach der Inkubation, Pipette 200 ulder AlamarBlue Lösung in einer 96-Well-Platte und messen Fluoreszenz unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader (Anregung: 560 nm, Emission: 590 nm).
    • Höhere zelluläre Stoffwechselaktivität reduziert den Farbstoff höhere Fluoreszenz-Anzeige zu erhalten.
    • Achten Sie darauf, mindestens zwei Vertiefungen von 10% AlamarBlue Lösung als Rohlinge enthalten. Bei der Analyse der Daten, subtrahieren Sie den gemittelten leere Fluoreszenz-Wert aus dem Fluoreszenz-Lesung der Proben.

F. Chymotrypsin vermittelten Gel Erosion und Spheroid Wiederherstellung

  1. Bereiten Sie 1 mg / ml Trypsin-freien α-Chymotrypsin-Lösung in HBBS und Sterilfilter der Lösung.
  2. Inkubieren Hydrogele in Chymotrypsin-Lösung (500 ul für jedes Gel) bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln bis zur vollständigen Erosion Gel erreicht wird.
    • Für einen 25 ul Gel, ist die Zeit bis zur vollständigen Erosion etwa 5 min.
  3. Legen Sie die Platte auf Eis für ein paar Minuten, um die Aktivität zu reduzierenChymotrypsin.
  4. Übertragen der Zelle Lösung in 1 ml-Tube und Zentrifuge bei 300 rpm, 4 ° C für 2 min.
  5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette Weide und sanft resuspendieren Sphäroide in HBSS.
  6. Übertragen der wiederhergestellten Sphäroid-Lösung zu einem 24-Well-Platte und legen Sie die Platte auf Eis, damit die Kügelchen zu beruhigen.
  7. Für Partikelgrößenanalyse erwerben Phase kontrastreiche Bilder der abgesetzten Sphäroide mit einem Lichtmikroskop. Measure erholt Sphäroid Durchmessern Verwendung von Software wie Nikon Element Software oder ImageJ.

G. Functional Test der Geheilte Spheroids

G.1. Glucose stimulierte Insulinsekretion aus den gewonnenen Zellen Sphäroide

  1. In einer 24-Well-Platte, Inkubation der Gele in 500 ul 2 mM niedrige Glukose Kerbs-Ringer-Puffer (KRB) für 1 Stunde.
  2. Erode das Gel und erholen Zelle Sphäroide mit Schritte F.1 bis F.6.
  3. Überstand vorsichtig, ohne irgendwelcheKontakt mit der Zelle Sphäroiden und resuspendieren Sphäroide in 500 ul 2 mM niedrige Glukose KRB.
  4. Übertragen Sie 100 ul der Zelle Sphäroide Lösung für ein 0,6-ml-Tube und legen Sie sie auf Eis für die intrazelluläre ATP Quantifizierung.
  5. Teilen Sie die verbleibenden Zell-Sphäroid-Lösung in der Mitte (in zwei Mikrozentrifugenröhrchen) und zentrifugiert 2 min bei 300 rpm und 4 ° C.
  6. Überstand entfernen (fast bis zum Boden) und resuspendieren in der ersten Hälfte der Zelle Sphäroide in 1 ml 25 mM hohe Glukose KRB und die zweite Hälfte in 1 ml 2 mM niedrige Glukose KRB.
  7. Gently pipettieren und die Lösung enthält erholt Zelle Sphäroide zu einem 24-Well-Platte. Inkubieren der Platte für 1 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
  8. Nach der Inkubation wird die Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 2 min bei 1000 rpm und 4 ° C.
  9. Übertragen 500 ul des Überstandes aus dem zentrifugierten Röhrchen zu einem anderen Mikrozentrifugenröhrchen und bei 4 ° C für InsulinELISA.
  10. Führen Insulin ELISA folgende Protokoll des Herstellers.

G.2. CellTiter Glo Assay

  1. ATP-Standards: Bereiten Sie eine 10 uM ATP-Lösung und führen serielle Verdünnungen auf eine Reihe von 8 Standard-Lösungen zu erhalten.
  2. Um einem weißen 96-Well-Platte, fügen Sie 50 ul Zell-Sphäroid-Lösung (aus Schritt G.1.6) und Standards.
  3. In jede Vertiefung enthaltende Proben und Standards, fügen Sie 50 ul CellTiter Glo Reagenz und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.
  4. Nach der Inkubation Maßnahme Lumineszenz Anzahl der Proben und Standards unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader und kalibrieren Probe ATP-Konzentrationen unter Verwendung einer linearen Regressionskurve durch die ATP-Standards erzeugt.
  5. Bestimmen Sie den gesamten ATP-Konzentration in der Probe und vermehren sich durch die Probe Verdünnungsfaktor, um die intrazelluläre ATP-Konzentration in einer Zelle beladenen Hydrogel erhalten.

G.3. Bestimmen Insulinsekretion

  1. Berechnen Sie die amount von Insulin aus den wiedergewonnenen Sphäroide, indem das Verhältnis der Menge an Insulin in hoher Glucosemedium zur Menge an Insulin in niedrigen Glucose sezerniert sekretiert.
  2. Normalisieren der quantifizierten Insulin-Gehalt der Zelle Sphäroide mit entsprechenden Menge an intrazellulärem ATP der gewonnenen Zellen Sphäroide.

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Representative Results

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Die Abbildungen 1-4 zeigen repräsentative Ergebnisse für die Verkapselung, Überleben, Proliferation, Sphäroidbildung und Sphäroid Erholung in Thiol-En-Hydrogele. Abbildung 1 zeigt die Reaktion Schema (1) Schritt-Wachstum Thiol-En-Photopolymerisation mit PEG4NB und CGGYC, und ( 2) Chymotrypsin vermittelten Gel Erosion, die eine Oberflächenerosion Mechanismus folgt. Abbildungen 2 und 3 zeigen die Lebensfähigkeit erzielten Ergebnisse mit Live / Dead-Färbung und AlamarBlue Assay. Wir beobachten, dass Zellen in PEG4NB-CGGYC Hydrogele auch bei niedrigen Zelle Packungsdichte proliferierten Angabe der cytocompatibilty der Thiol-En-Hydrogel-System. 4 zeigt Bilder der Phasenkontrast eingekapselt und zurückgewonnen β-Zell-Sphäroiden, sowie die Größenverteilung der erholt β-Zellen Sphäroide.

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Abbildung 1. Schematische Darstellung der Schritt-Wachstum Thiol-En-Foto-Klick-Reaktion mit PEG4NB und CGGYC PEG-Peptid-Konjugat zu bilden. Hydrogele können schnell durch Chymotrypsin Behandlung ausgehöhlt werden.

Abbildung 2
Abbildung 2. Initial Lebensfähigkeit und Zell-Sphäroid in PEG4NB/CGGYC Hydrogele gebildet. (A) Live / Dead-Färbung wurde sofort folgende Foto-Verkapselung durchgeführt. (B) Live / Dead-Färbung nach 10 Tagen in vitro Kultur durchgeführt. Vertreter konfokalen z-Stapel Bilder MIN6 β-Zellen in 4 Gew.% PEG4NB/CGGYC Hydrogele (2 × 10 6 Zellen / ml, scale = 100 um) gekapselt. Zelllebensfähigkeit wurde als Prozentsatz von lebenden (grün) über Zellen Gesamtzellzahl (grün und rot) Zählung definiert. (2 × 10 6 Zellen / ml, N = 4, Mittelwert ± Standardabweichung).

Abbildung 3
Abbildung 3. Stoffwechselaktivität MIN6 β-Zellen als eine Funktion der Zeit durch AlamarBlue Reagenz (N = 3, x ± s) gemessen. MIN6 β-Zellen in 3 Gew.% eingekapselt, 4 Gew.% und 5 Gew.% PEG4NB/CGGYC Hydrogele bei 2 × 10 6 Zellen / ml.

Abbildung 4
Abbildung 4. Charakterisierung der gewonnenen MIN6 β-Zellen Sphäroide. Zelle Sphäroide wurden aus PEG4NB/CGGYC unter Verwendung von 40 pM Chymotrypsin nach 10 Tagen in vitro Kultur gewonnen wird. (A) Repräsentative Phasenkontrastbild von eingekapselten β-Zell-Sphäroiden. (B) Repräsentative Phasenkontrastbild wiedergewonnener β-Zell-Sphäroiden. (C) Verteilung of Sphäroid Durchmesser (Cell Dichte = 1 × 10 7 Zellen / ml).

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Discussion

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Das beschriebene Protokoll enthält Angaben auf einfache Verkapselung von Zellen in Thiol-En-Hydrogele durch Schritt-Wachstum Photopolymerisation gebildet. Während ein stöchiometrisches Verhältnis von 1:1 Norbornen zu Thiolfunktionen in diesem Protokoll verwendet wurde, kann das Verhältnis eingestellt in Abhängigkeit von den Experimenten werden. Neben einer korrekten Formulierung, ist es wichtig, um die Homogenität in der Prepolymerlösung aufrechtzuerhalten. Insbesondere verwenden vorsichtiges Pipettieren zu gewährleisten, dass Zellen sind im Stand der Prepolymerlösung verteilt, um Verklumpen zu vermeiden Zelle und Variation in Geleigenschaften. Obwohl eine Polymerisationszeit von 2 min für Gelvernetzung verwendet wurde, der Gelpunkt für Thiol-En-Hydrogele weniger als 10 Sekunden wird in den meisten relevanten Zelleinkapselungsvorrichtung-Formulierungen (zB ist Gelpunkt für 4 Gew.% PEG4NB/CGGYC Hydrogel 7 ± 2 sec und 5 Gew.% beträgt 6 ± 1 sec). Die schnelle Gelierung dieses Hydrogel-System zügig sperrt die Zellen statt, was zu einer besseren cell Verteilung in 3D zu anderen Photopolymerisation Schemata, Minuten oder sogar Stunden dauern, bis Gelpunkt erreicht verglichen. 7,20

Darüber hinaus wurden β-Zellen Sphäroide natürlich in Thiol-En-Hydrogele gebildet durch Chymotrypsin-vermittelte Gel Erosion erholt. Chymotrypsin, jedoch ist ein Enzym Trypsin in der Familie und hohe Konzentration und lange Inkubationszeit von diesem Enzym kann sich negativ auf die Zell-Zell-Wechselwirkungen stören oder sogar das Sphäroid Architektur während der Wiederherstellung. Um dieses potentielle Beschränkung zu vermeiden, kann durch andere Hydrogele thiolierten Substrate vernetzt werden und Gel Erosion können weiterhin durch geeignete Enzyme, die nicht zu nachteiligen Zell-Zell-Wechselwirkung erreicht werden.

Insgesamt bieten Thiol-En-Hydrogele ein cytocompatible Umfeld zur Förderung der Proliferation von β-Zellen in 3D. Dieses System kann verwendet werden zur Kultur und Untersuchung der physiologischen Verhalten der verschiedenen Zelltypen in 3D. FernerDieses System erlaubt die einfache Gewinnung von Zellkonstrukte innerhalb der Hydrogel-Matrix fuer weitere funktionelle und biologische Charakterisierungen gebildet. Diese vielfältigen und cytocompatible Hydrogel-System bietet Gel-Plattform für die Entwicklung komplexer 3D-Gewebe für die regenerative Medizin Anwendung.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Dieses Projekt wurde durch die NIH (R21EB013717) und IUPUI OVCR (RSFG) finanziert. Der Autor dankt Frau Han Shih für ihre technische Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-arm PEG (20kDa) Jenkem Technology USA 4ARM-PEG-20K
Fmoc-amino acids Anaspec
Live/Dead cell viability kit Invitrogen L3224 Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1
AlamarBlue reagent AbD Serotec BUF012
CellTiter Glo reagent Promega G7570
DPBS Lonza 17-512F Without Ca+2 and Mg+2
HBSS Lonza 10547F Without Ca+2 and Mg+2
High Glucose DMEM Hyclone SH30243.01
FBS Gibco 16000-044
Antibiotic-Antimycotic Invitrogen 15240-062
β-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522-100ML
Trypsin-EDTA Invitrogen 15400-054
Trypsin-free α-chymotrypsin Worthington Biochemical Corp LS001432
Mouse Inusin ELISA kit Mercodia 10-1247-01
1 ml disposable syringe BD biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele
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Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).More

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).

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