Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele
Summary
Das folgende Protokoll stellt Techniken zur Verkapselung Pankreas β-Zellen in Schritt-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele durch Thiol-En-Foto-Klick-Reaktionen gebildet. Dieses Material-Plattform bietet nicht nur eine cytocompatible Mikroumgebung für Zellverkapselung, sondern erlaubt auch benutzergesteuerten rasche Erholung von Zellstrukturen innerhalb der Hydrogele gebildet.
Abstract
Hydrogele sind hydrophile, vernetzte Polymere, die eine dreidimensionale Mikroumgebung mit Gewebe-ähnliche Elastizität und hohe Durchlässigkeit für Kultivieren therapeutisch relevante Zellen oder Gewebe bereitzustellen. Hydrogele aus Poly (Ethylenglykol) (PEG)-Derivate hergestellt werden zunehmend für eine Vielzahl von Gewebe-Engineering-Anwendungen verwendet, zum Teil aufgrund ihrer abstimmbaren und cytocompatible Eigenschaften. Bei diesem Protokoll, verwendeten wir Thiol-En-Schritt-Wachstum Photopolymerisationen bis PEG-Peptid Hydrogele zur Verkapselung pankreatischen MIN6 b-Zellen herzustellen. Die Gele wurden durch 4-Arm PEG-Norbornen (PEG4NB) Makromer und Chymotrypsin-sensitive Peptid Vernetzer (CGGYC) gebildet. Die hydrophilen und nicht-Fouling Art PEG bietet eine cytocompatible Mikroumgebung für das Überleben der Zelle und die Proliferation in 3D, während die Verwendung von Chymotrypsin-sensitive Peptidsequenz (C GGY ↓ C, gibt der Pfeil Enzymspaltstelle, während Endgerät ZysteEine Rückstände wurden Thiol-En-Vernetzung hinzugefügt) ermöglicht die schnelle Wiederherstellung von Zellkonstrukte bilden innerhalb des Hydrogels. Das folgende Protokoll ausarbeitet Techniken für: (1) Verkapselung von MIN6 β-Zellen in Thiol-En-Hydrogele, (2) Qualitative und quantitative Zelllebensfähigkeit Assays zum Zellüberleben und Proliferation zu bestimmen, (3) Wiedergewinnung von Zellen Sphäroide mit Chymotrypsin-vermittelte Gel Erosion; und (4) Strukturelle und funktionelle Analyse der gewonnenen Sphäroide.
Introduction
Hydrogele sind hydrophile vernetzte Polymere mit außergewöhnlichem Potenzial als Gerüstmaterial für die Reparatur und Regeneration von Geweben. 1-3 Der hohe Wassergehalt der Hydrogele ermöglicht eine einfache Diffusion von Sauerstoff und Austausch von Nährstoffen und zellulären Stoffwechsel-Produkte, die alle entscheidend für die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen sind. Zusätzlich Hydrogele ausgezeichnete Träger für die kontrollierte Freisetzung und Zellabgabesystem aufgrund ihrer hohen Abstimmbarkeit sind. 2 Synthetisches Hydrogele, wie sie aus Poly (Ethylenglykol) (PEG) hergestellt werden zunehmend in Tissue Engineering-Anwendungen verwendet, hauptsächlich wegen ihrer cytocompatibility, gewebespezifische Elastizität und hohe Abstimmbarkeit Material-physikalischen und mechanischen Eigenschaften. 4-6
Obwohl eine häufig verwendete Hydrogel Plattform haben Studien gezeigt, dass PEG-diacrylat (PEGDA) Hydrogele durch Ketten-Wachstum gebildet Photopolymerisationen eine Tendenz zu beschädigen eingekapselt Zellen haben During Netzwerk Vernetzung und in situ Zelleinkapselungsvorrichtung. 7 Die Zellschädigung wurde weitgehend Radikalspezies von den Photoinitiator-Moleküle, die durch die Vinylgruppen an PEGDA zu vernetzen Polymerketten in Hydrogele Propagation generiert wird. Leider sind diese Radikalspezies auch verursachen Spannungen und Zellschäden während Zelleinkapselungsvorrichtung, insbesondere für Rest-empfindlichen Zellen wie Pankreas-β-Zellen. 8-10 Um eine höhere Maschengröße für eine bessere Diffusion und Zellüberleben höheren Molekulargewichten erhalten PEGDA werden häufig für Zellverkapselung verwendet. Dies ist jedoch beeinträchtigt Polymerisationskinetik und bewirkt suboptimalen Gel biophysikalischen Eigenschaften. 7,11,12 Zusätzlich zu den oben genannten Nachteilen, ist es sehr schwierig ist, Zellstrukturen von PEGDA Hydrogele erholen aufgrund der Heterogenität und nicht abbaubaren Natur die vernetzten Netzwerken. Während Protease-sensitiven Peptide eingebaut werden könnenin PEG Makromergerüst die ansonsten inert PEGDA Hydrogele empfindlich gegenüber enzymatischer Spaltung zu rendern, die Konjugation verwendet häufig teure Reagenzien und die erhaltenen Netze enthalten noch hohe Heterogenität aufgrund der Art von Kette-Wachstum Polymerisation. 13-15
Kürzlich wurden PEG-Peptid-Hydrogele über Schritt-Wachstum Thiol-En-Photopolymerisation gebildet wurde gezeigt, dass bevorzugte Eigenschaften für Zell-Kapselung über Hydrogele durch Ketten-Wachstum Photopolymerisation gebildet aufweisen. 7 Die Superior Gelierung Kinetik der Thiol-En-Hydrogele zur Klick zurückzuführen "Natur der Reaktion zwischen Thiol-und En-Funktionalitäten. Im Vergleich zu Ketten-Wachstum Polymerisation von PEGDA ist Thiol-En-Reaktion weniger Sauerstoff inhibiert, was zu einer schnelleren Gelierung bewerten. 16,17 Thiol-En-Hydrogele haben auch höhere Polymerisation Effizienz und bessere Gel biophysikalischen Eigenschaften im Vergleich zu Ketten-Wachstum PEGDA Hydrogele, 7 , 18 </ Sup> was ergibt begrenzten Zellschäden durch Radikale während der Photopolymerisation verursacht.
Zuvor Thiol-En-Hydrogele durch 4-Arm-PEG-norbornen (PEG4NB) Makromer und Bis-Cystein enthaltende Peptid Vernetzern wie gebildeten Protease-sensitive Peptide wurden für Zelleinkapselungsvorrichtung verwendet worden. 7,18 Breitband Abstimmbarkeit PEG Hydrogel Netzwerke bietet eine flexible und steuerbare 3D-Mikroumgebung für die Untersuchung Zellüberleben und Aktivität, während die Verwendung von Protease-sensitive Peptidsequenz eine milde Weise zur Rückgewinnung des Zellkonstrukte natürlich innerhalb Hydrogele gebildet. In diesem Protokoll verwenden wir Stufenwachstum photopolymerisierten Thiol-En-Hydrogelen hergestellt unter Verwendung von 4-Arm-PEG-norbornen (PEG4NB) und eine Chymotrypsin-sensitive Peptid Vernetzer (CGGY ↓ C) für die Einkapselung von MIN6 β-Zellen. Dieses Protokoll systematisch erarbeitet Techniken zur Untersuchung das Überleben, die Proliferation und Sphäroidbildung der MIN6β-Zellen in Thiol-En-Hydrogele. Wir bieten weitere Methode zur β-Zell-Sphäroid Erholung und biologische Charakterisierung der gewonnenen Sphäroide.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene Protokoll enthält Angaben auf einfache Verkapselung von Zellen in Thiol-En-Hydrogele durch Schritt-Wachstum Photopolymerisation gebildet. Während ein stöchiometrisches Verhältnis von 1:1 Norbornen zu Thiolfunktionen in diesem Protokoll verwendet wurde, kann das Verhältnis eingestellt in Abhängigkeit von den Experimenten werden. Neben einer korrekten Formulierung, ist es wichtig, um die Homogenität in der Prepolymerlösung aufrechtzuerhalten. Insbesondere verwenden vorsichtiges Pipettieren zu gew?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde durch die NIH (R21EB013717) und IUPUI OVCR (RSFG) finanziert. Der Autor dankt Frau Han Shih für ihre technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5′-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
