Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Создание и восстановление β-клетки сфероидов Из Шаг рост PEG-пептида Гидрогели

doi: 10.3791/50081 Published: December 6, 2012

Summary

Протокол предусматривает следующие методы инкапсуляции панкреатических β-клеток на стадии роста PEG-пептида гидрогелей образована тиоловых-ен фото кнопкой мыши реакций. Этот материал платформа предлагает не только cytocompatible микроокружение для сотовых инкапсуляции, а также позволяет пользователю контролируемого быстрого восстановления клеточных структур, образующихся в гидрогелей.

Abstract

Гидрогели являются гидрофильными сшитые полимеры, которые обеспечивают трехмерное микроокружение с тканью, как эластичность и высокую проницаемость для культивирования терапевтически соответствующие клетки или ткани. Гидрогели получают из поли (этиленгликоль) (ПЭГ) производным все чаще используются для различных областей применения тканевой инженерии, в частности, в связи с их перестраиваемых и cytocompatible свойства. В этом протоколе, мы использовали тиоловых-ен шаг роста photopolymerizations для изготовления PEG-пептида гидрогелей для инкапсуляции панкреатических MIN6 В-клеток. Гели были сформированы 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) макромера и химотрипсин-чувствительных пептида сшивающего агента (CGGYC). Гидрофильные и не загрязнение природы PEG предлагает cytocompatible микроокружения за выживание и пролиферацию клеток в 3D, в то время как использование химотрипсин-чувствительных пептидной последовательности (C GGY ↓ C, стрелка указывает сайт расщепления ферментов, в то время как терминал кистаEine остатки были добавлены для тиоловых-ен сшивание) позволяет быстрое восстановление клеточных конструкций формирования в гидрогель. Следующий протокол разрабатывает методы: (1) Инкапсуляция MIN6 β-клеток в тиоловых-ен гидрогелей; (2) Качественный и количественный анализы жизнеспособность клеток, чтобы определить выживание и пролиферацию клеток; (3) восстановление клеточных сфероидов использовании химотрипсина-опосредованной гель эрозии, и (4) Структурно-функциональный анализ восстановленных сфероидов.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Гидрогели являются гидрофильными сшитые полимеры с исключительным потенциалом леса материалы для ремонта и регенерации тканей. 1-3 высоким содержанием воды гидрогелей позволяет легко диффузии кислорода и обмен питательных веществ и клеточных продуктов метаболизма, которые имеют решающее значение для поддержания жизнеспособности клеток. Кроме того, гидрогели являются отличными носителями для контролируемого высвобождения и клеточной доставки из-за их высокой управляемость. 2 Синтетическая гидрогели, такие как изготовленные из поли (этиленгликоль) (ПЭГ) все чаще используются в приложениях тканевой инженерии, в основном из-за их cytocompatibility, ткани как эластичность и высокая управляемость в материалах физические и механические свойства. 4-6

Хотя обычно используется гидрогель платформы, исследования показали, что ПЭГ диакрилат (PEGDA) гидрогели образована цепочка роста photopolymerizations имеют тенденцию к повреждению инкапсулированные клетки Дуринг сшивания сети и на местах инкапсуляции клеток. 7 повреждение клеток была в значительной степени отнести к радикальным видов порожденных фотоинициатора молекул, которые распространяются через виниловых групп на PEGDA для сшивания полимерных цепей в гидрогелей. К сожалению, эти радикалы также вызывают стрессы и повреждение клеток в процессе клеточного инкапсуляции, особенно для радикально-чувствительные клетки поджелудочной железы, таких как β-клеток. 8-10 Для того, чтобы получить более высокий размер ячейки для лучшего распространения и выживания клеток, более высоким молекулярным весом PEGDA часто используется для сотового инкапсуляции. Это, однако, ставит под угрозу кинетики полимеризации и приводит к неоптимальным гель биофизических свойств. 7,11,12 В дополнение к выше недостатки, это очень трудно восстановить клеточные структуры от гидрогелей PEGDA в связи с неоднородностью и неразлагаемых природы сшитый сетей. В то время как протеазы, чувствительных к пептиды могут быть включеныв PEG макромера основой для визуализации в противном случае инертных PEGDA гидрогелей чувствительны к ферментативного расщепления, сопряжение часто использует дорогостоящих реагентов и в результате сетях по-прежнему содержат высокую степень неоднородности в связи с характером цепной полимеризацией. 13-15

Недавно PEG-пептида гидрогели образуются с помощью шаг за ростом тиоловых-ен фотополимеризации было показано, обладают свойствами льготных для сотовых инкапсуляция через гидрогелей образована цепочка роста фотополимеризации. 7 превосходную кинетику гелеобразования тиоловых-ен гидрогелей объясняется "нажмите "характер реакции между тиоловых и ен функций. По сравнению с цепным ростом полимеризации PEGDA, тиоловых-ен реакции меньше кислорода тормозится, что приводит к более быстрой скорости гелеобразования. 16,17 Thiol-ен гидрогели также имеют более высокую эффективность полимеризации и лучше гель биофизические свойства по сравнению с цепным ростом PEGDA гидрогелей, 7 , 18 </ SUP>, что приводит к ограниченной сотовой ущерб, причиненный радикалов во время фотополимеризации.

Ранее тиоловых-ен гидрогелей образована 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) макромера и бис-цистеин содержащих пептидов сшивающие агенты, такие как протеазы, чувствительных к пептиды были использованы для клеточной инкапсуляции. 7,18 Высокая управляемость сетей PEG гидрогель предлагает гибкой и управляемой 3D микросреду для исследования выживаемости клеток и активность, в то время как использование протеаз чувствительных к пептидной последовательности обеспечивает легкий путь для восстановления клеточных конструкций формируется, конечно, в гидрогелей. В этом протоколе мы используем шаг роста фотополимеризованных тиоловых-ен гидрогелей изготовлены с использованием 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) и химотрипсин-чувствительных пептида сшивающего агента (CGGY ↓ C) для инкапсуляции MIN6 β-клеток. Этот протокол систематически разрабатывает методы для изучения выживаемости, пролиферации и сфероида формирования MIN6β-клеток в тиоловых-ен гидрогелей. Мы также обеспечить метод для β-клетку сфероида восстановления и биологических характеристик восстановленных сфероидов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

А. Макромер и Синтез пептидов

  1. Обобщение 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) и фотоинициатора литий arylphosphanate (LAP), используя установленные протоколы. 18,19
  2. Обобщить бис-цистеин содержащих химотрипсин-чувствительных пептида CGGY ↓ C (стрелка указывает химотрипсин сайт расщепления) с использованием стандартных твердофазного пептидного синтеза в микроволновом синтезаторе пептидов (CEM Discover SPS).
    1. Рассчитайте количество смолы (Ринк-амид MBHA смолы), необходимых на основе замещения соотношение смолы и синтез масштабе. Swell смолы в диметилформамиде (DMF) в реакционном сосуде (RV) в течение 15 мин.
    2. Удалить Fmoc-защитной группы из смолу с помощью снятия защиты раствор, содержащий 20% пиперидина и 0,1 М HOBt в ДМФ. Используйте параметры, перечисленные в таблице ниже для микроволновой помощью Fmoc-разблокировки (для всех Fmoc-аминокислот):
      Синтез масштабе 0,1 ммоль 0,2 ммоль
      Власть 20 Вт 50 Вт
      Температура 75 ° C 75 ° C
      Время 3 мин 3 мин
    3. После снятия защиты, промыть смолы с DMF и выполнять Ninhydrin тест, чтобы подтвердить удаление Fmoc (воздействие N-концевого амина). Смола должна синей после 2 мин при 95 ° C.
    4. После успешного снятия защиты, пару первых Fmoc-аминокислот на С-конце (синтез идет от C к N-конец) в решении базы активатор (0,28 M диизопропилэтиламин (DIEA) в ДМФА) с параметрами, перечисленными в таблице ниже .
      Синтез масштабе 0,1 ммоль 0,2 ммоль
      Власть 20 Вт 50 Вт
      Температура * 75 ° C 75 ° C
      Время * 5 мин 5 мин

      * Для кисты и его, используйте 50 ° C и 10 мин для уменьшения рацемизации.
    5. Промыть смолу и выполняют Ninhydrin тест, чтобы качественно подтверждают завершение связи (исчезновении N-концевого амина). Смола должна быть ясной после 5 мин при 95 ° C. Повторите шаг связи (A.2.d), если Ninhydrin тест возвращает положительный результат (синего цвета).
    6. Повторите снятие защиты (шаг A.2.b) и связи (шаг A.2.d) для дополнительных аминокислот в последовательности заканчивая последним шагом снятия защиты.
    7. Слейте RV, промыть смолы с 25 мл дихлорметана (DCM). Этот шаг, чтобы смыть DMF, который является базовым и будет препятствовать пептида декольте.
    8. Подготовка расщепления коктейль путем смешивания 250 мг фенола в 4,75 мл трифторуксусной кислоты (ТФК), 0,125 мл триизопропилсилан (TIS) и 0,125 мл DDH 2 O.
    9. Добавить расщепления решение в RV и прилепится в течение 30 мин в синтезаторе пептидов микроволновой печи (мощность = 20 Вт; температура = 38 ° C).
    10. Сбор пептидный раствор в 50 мл центрифужные пробирки помощью вакуумного коллектора.
    11. Осадок дрова пептида в 40 мл эфира, вихревая трубка и центрифуге при 3000 оборотов в минуту в течение 5 минут, чтобы собрать пептида.
    12. Слейте супернатант и повторите шаг A.2.k в два раза.
    13. Собирать и сушить пептида в вакууме.
    14. Очищают пептида с помощью ВЭЖХ и характеризуют его с масс-спектрометрии.

B. Подготовка материала и стерилизации

  1. Подготовьте 20 мас решение PEG4NB% в PBS, вихрь смесь, пока макромера полностью растворяется, и стерилизовать макромера решение с помощью шприца фильтр. Храните стерилизованные решение при -20 ° C (подготовка аликвотыдля длительного хранения).
  2. Подготовка и стерилизовать 2 мас фотоинициатора% (LAP) решение в PBS. Храните стерилизованные раствор при комнатной температуре в защищенном от света.
  3. Растворите пептид (CGGYC) в PBS, вихрем смеси и шприц фильтрации раствора для стерилизации. Аликвотировать пептидный раствор и хранят при температуре -20 ° С до использования (предотвращения циклов замораживания-оттаивания).
  4. Определить тиоловых (-SH) концентрация в приготовленный раствор пептида использованием реагента Эллман (следуйте протоколу производителя). Этот шаг даст точную концентрацию пептида (например, [SH] / 2), который требуется для расчета количества пептидов, которые будут использоваться в тиоловых-ен фото кнопкой мыши реакций.
  5. Подготовка гелеобразования формы путем разрезания верхней части офф 1 мл стерильного одноразового шприца помощью лезвия бритвы (открытый наконечник для удаления геля). Стерилизовать шприц форм в автоклаве.
  6. На основании желаемого геля (тиоловых в соотношении ен = 1) и концентрации на складе партнерариалов, рассчитать необходимый объем полимера, сшивателя пептид, фотоинициатора и буферных растворов необходимо.

C. клеточный препарат

  1. Уравновесьте культуре клеток среды (высокий уровень глюкозы в DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки; антибиотикам противогрибковым с 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 250 нг / мл Fungizone и 50 мкМ β-меркаптоэтанол), сбалансированный солевой Хэнка решение ( HBSS, Ca 2 +, Mg 2 + бесплатно), и трипсина-EDTA до 37 ° C.
  2. Удалить колбы, содержащие MIN6 β-клеток из CO 2 инкубаторе и поместить колбы в ламинарном боксе.
  3. Аспирируйте СМИ культуре клеток из колб и промыть клетки с HBSS.
  4. Trypsinize клеток с использованием 3 мл 2X (0,1%) трипсина-EDTA и инкубировать в колбах в течение 4 мин при 37 ° C и 5% CO 2.
    • Примечание: Используйте 2X раствор трипсина позволяет полной диссоциации MIN6 β-клеток в суспензии отдельных клеток.
    </ Li>
  5. После инкубации, нажмите колбы на поверхности капота осторожно, чтобы полностью отделить клетки. Подтвердите отряда и диссоциации клеток с помощью микроскопа.
  6. Добавить равный объем клеточной культуральной среде для нейтрализации трипсина. Смешайте раствор хорошо осторожным пипетированием, а затем передать эту смесь к каноническому трубку и центрифуги в течение 5 мин при 1000 оборотах в минуту.
  7. Аспирируйте супернатант и осторожно повторно приостановить клеток в 4 - 5 мл культуральной среды.
  8. Определить плотность клеток, используя 50% трипанового синего буфера в гемоцитометре.

D. изготовления гидрогеля и клеточной инкапсуляции

  1. Как только клетки готовы, смешайте (на основе пропорции 1:1 тиоловых в соотношении ен) требуются объемы PEG4NB, CGGYC, LAP, сотовые решение, и HBSS в микроцентрифуге трубку.
  2. Смешайте раствор осторожно с помощью пипетки до получения однородной смеси и добавить 25 мкл полученного раствора в шприце формы. Expose шприц к ультрафиолетовому излучению (365нм, 5 мВт / см 2) в течение 2 мин.
  3. После фотополимеризации, окунуться гелей в стерильный 24-луночный планшет среде, содержащей культуру клеток и инкубировать гидрогелей в 37 ° C и 5% CO 2.
  4. Вымойте клетки-Ладена гидрогелей в клеточной среде культуры в течение 30 мин, чтобы смыть слабо прикрепленные клетки и снимите сшитый макромеры. Передача гелей в свежей среде.
  5. Обновить СМИ культуре клеток каждые 2 до 3 дней.

Е. жизнеспособность клеток анализа

Encapsulated морфологии клеток можно наблюдать с помощью светового микроскопа (с синтезированной гидрогели являются прозрачными). Жизнеспособность клеток могут быть визуализированы и качественно измерять с помощью Live / Dead окрашивания и количественной AlamarBlue использованием реагента.

E.1. Онлайн / Dead окрашивания

  1. Оттепель Онлайн / Dead реагентов окрашивания при комнатной температуре.
  2. В каноническом трубки добавить PBS в зависимости от количества образцов (N), чтобы быть окрашенные:
    Общий объем PBS = N × 500 мкл
  3. Внесите 0,25 мкл Calcein AM и 2 мкл EthD-1 в 1 мл PBS к каноническому пробирку, содержащую PBS. Vortex решение для смешивания компонентов.
  4. Инкубируйте клетки-Ладена гидрогелей в Live / Мертвые красящим раствором (0,5 мл / образец) в течение 1 часа при комнатной температуре на орбитальном шейкере.
  5. С помощью пипетки Пастера, удалить раствор красителя и промывки образца в два раза с PBS.
  6. Поместите образец на листке обложке или стекло. Наблюдайте и изображений клеток с помощью конфокальной микроскопии.

E.2. Анализ AlamarBlue

  1. Подготовьте 10 В / V% AlamarBlue решение в клеточной среде культуры.
  2. Удалить гидрогелей из инкубатора и аспирации средств массовой информации из каждой лунки без каких-либо контактов с гидрогеля.
  3. Инкубируйте клетки-Ладена гидрогелей и пустые хорошо (отрицательный контроль) в 500 мкл 10% AlamarBlue решение в течение 16 часов.
  4. После инкубации, пипетки 200 мклрешения AlamarBlue в 96 ячейках и меры флуоресценции с помощью микропланшет-ридера (возбуждения: 560 нм, эмиссия: 590 нм).
    • Высшее сотовой метаболическую активность снижает краситель, чтобы дать высшее флуоресценции чтении.
    • Не забудьте включить по крайней мере, две скважины на 10% Alamarblue решение, как пробелы. При анализе данных, вычесть усредненный пустой флуоресценции значение флуоресценции чтение образцов.

F. Химотрипсин опосредованное Эрозия гель и сфероид восстановления

  1. Подготовить 1 мг / мл трипсина-бесплатная α-химотрипсина решение в HBBS и стерильных фильтров решение.
  2. Инкубируйте гидрогелей в растворах химотрипсин (500 мкл для каждого геля) при комнатной температуре при осторожном встряхивании до полного эрозии геля достигается.
    • Для 25 мкл геля, время для полной эрозии составляет около 5 мин.
  3. Поместите пластину на льду в течение нескольких минут, чтобы снизить активностьхимотрипсина.
  4. Передача ячейки раствор в 1 мл и трубки центрифуги при 300 оборотах в минуту, 4 ° C в течение 2 мин.
  5. Осторожно удалите супернатант использования пастбищ пипетки и осторожно ресуспендируют сфероидов в HBSS.
  6. Передача восстановленных сфероида решение 24-луночный планшет и поместите пластину на льду, чтобы сфероиды, чтобы успокоиться.
  7. Для анализа размера, приобретают фазовый контраст изображения поселился сфероиды с помощью светового микроскопа. Измерение восстановился сфероид диаметром с использованием программного обеспечения, таких как Nikon элемент программного обеспечения или ImageJ.

Г. функциональный анализ из регенерированного сфероидов

G.1. Глюкоза стимулировать секрецию инсулина, восстановленные из сфероидов клетки

  1. В 24-луночный планшет, инкубировать гелей в 500 мкл 2 мМ низкий уровень глюкозы в Бордюры-Ringer буфера (КРФ) в течение 1 часа.
  2. Erode геля и восстановить клетки сфероиды, используя шаги, чтобы F.1 F.6.
  3. Аспирируйте супернатант осторожно, не делая никакихсвязаться с клеткой сфероидов и ресуспендируют сфероидов в 500 мкл 2 мМ низкой KRB глюкозы.
  4. Передача 100 мкл раствора ячейки сфероидов в 0,6 мл трубки и поместить его на льду в течение внутриклеточных количественного СПС.
  5. Разделить оставшиеся клетки сфероида решение в два раза (на две трубки микроцентрифужных) и центрифугируют в течение 2 мин при 300 оборотах в минуту и ​​4 ° C.
  6. Супернатант (почти до дна) и ресуспендируют первой половине ячейки сфероидов в 1 мл 25 мм KRB глюкозы и вторую половину в 1 мл 2 мМ низкой KRB глюкозы.
  7. Аккуратно пипетки и передать раствор, содержащий восстановился сфероидов ячейки в 24-луночный планшет. Инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° C и 5% CO 2.
  8. После инкубации, передавать решение микроцентрифужную пробирку и центрифугируют в течение 2 мин при 1000 оборотах в минуту и ​​4 ° C.
  9. Передача 500 мкл супернатанта из центрифугированных трубку в другую пробирку микроцентрифужных и хранить при температуре 4 ° С для инсулинаELISA.
  10. Выполнить протокол инсулин ELISA следующих производителей.

G.2. CellTiter Glo анализа

  1. ATP стандарты: Подготовка 10 мкМ АТФ решения и выполнять серийные разведения для получения серии из 8 стандартных решений.
  2. Для белых 96-луночный планшет, добавить 50 мкл клеточной решение сфероида (с шагом G.1.6) и стандартов.
  3. В каждую лунку содержащего образцы и стандарты, добавить 50 мкл реагента CellTiter Glo и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
  4. После инкубации мера люминесценции количество образцов и стандартов при помощи планшетного и калибровки образца ATP концентрации с использованием линейной кривой регрессии порожденное стандартов СПС.
  5. Определение общей концентрации АТФ в образце и умножить на коэффициент разбавления образца, чтобы получить внутриклеточные концентрации АТФ в одной ячейке нагруженные гидрогеля.

G.3. Определить секреции инсулина

  1. Рассчитать AmouNT инсулин выделяется из восстановленных сфероидов как отношение количества инсулина выделяется в высокой средней глюкозы в количестве инсулин выделяется в низкий средний глюкозы.
  2. Нормализация количественно содержание инсулина в клетке сфероиды с соответствующим количеством внутриклеточной АТФ восстановленных сфероидов клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Цифры 1-4 показывают репрезентативные результаты для инкапсуляции, выживание, пролиферацию, сфероид образование, и сфероид восстановления тиоловых-ен гидрогелей. Рисунке 1 показана схема реакции (1) этап роста тиоловых-ен фотополимеризации использованием PEG4NB и CGGYC, и ( 2) химотрипсин опосредованное эрозии геля, который следует механизма эрозии поверхности. рисунках 2 и 3 представлены результаты, полученные с использованием жизнеспособность Онлайн / Dead окрашивания и AlamarBlue анализа. Заметим, что клетки распространились в PEG4NB-CGGYC гидрогелей даже при низкой плотностью упаковки клетки, с указанием cytocompatibilty тиоловых-ен гидрогель системы. Рисунок 4 показывает, фазовый контраст изображения инкапсулируются и восстановления β-клетки сфероиды, а также распределение по размерам восстановить β-клетки сфероидов.

_upload/50081/50081fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50081/50081fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Схема ступенчатой ​​тиоловых-ен фото щелкните реакции с использованием PEG4NB и CGGYC сформировать PEG-пептида сопряжены. Гидрогели могут быть подорваны быстро обработкой химотрипсином.

Рисунок 2
Рисунок 2. Начальный жизнеспособность и клетки образуются в сфероид PEG4NB/CGGYC гидрогелей. () Live / Dead окрашивание выполняется сразу же после фото-инкапсуляции. (Б) Live / Dead окрашивание производится в течение 10 дней в пробирке культуру. Представитель конфокальной Z-Stack изображений MIN6 β-клеток, инкапсулированные в 4wt% гидрогелей PEG4NB/CGGYC (2 × 10 6 клеток / мл, шкала = 100 мкм). Жизнеспособность клеток определяется как процент живых (зеленый) клетки более общей клетке (зеленый + красный) кол. (2 × 10 6 клеток / мл, N = 4, в среднем ± SD).

Рисунок 3
Рисунок 3. Метаболическая активность MIN6 β-клеток измеряли как функцию времени, AlamarBlue реагента (N = 3, в среднем ± SD). MIN6 β-клеток, инкапсулированные в 3WT%, 4wt% и ​​5 мас гидрогелей PEG4NB/CGGYC% при 2 × 10 6 клеток / мл.

Рисунок 4
Рисунок 4. Характеристика восстановился MIN6 β-клетки сфероидов. Сотовые сфероидов были извлечены из PEG4NB/CGGYC с использованием 40 мкМ химотрипсин после 10 дней в культуре пробирке. (А) представитель фазового контраста изображения инкапсулированных β-клетки сфероидов. (Б) представитель фазового контраста изображения восстановленного β-клетки сфероидов. (С) Распространение ое сфероид диаметром (Cell плотность = 1 × 10 7 клеток / мл).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Описанный протокол представляет подробную информацию о легкой инкапсуляции клеток в тиоловых-ен гидрогелей формируется за шагом роста фотополимеризации. В то время как стехиометрических соотношении 1:1 норборнена в тиоловые функциональные группы была использована в данном протоколе, соотношение может быть скорректирована в зависимости от эксперимента. В дополнение к правильной постановке, это важно для поддержания однородности в пре-полимерный раствор. В частности, используйте нежный пипеткой, чтобы клетки хорошо распределяется в заранее раствор полимера во избежание слипания клеток и изменения в геле свойства. Хотя время полимеризации 2 мин была использована для сшивания геля, гель точкой для тиоловых-ен гидрогелей составляет менее 10 секунд в большинстве клетки-инкапсуляции соответствующие формулировки (например, гель точкой для 4 мас гидрогель PEG4NB/CGGYC% составляет 7 ± 2 сек и 5% по весу составляет 6 ± 1 сек). Быстрое застывание этого гидрогеля система быстро блокирует клетки в месте, в результате чего лучше челл распределение в 3D по сравнению с другими схемами фотополимеризации, что занять несколько минут или даже часов, чтобы добраться гель-точки. 7,20

Кроме того, β-клетки сфероидов естественно формируется в тиоловых-ен гидрогели были восстановлены химотрипсин-опосредованной гель эрозии. Химотрипсин, однако, является ферментом, в семье трипсина и высокой концентрации или длительное время инкубации этого фермента может негативно сказаться межклеточных взаимодействий или даже нарушить сфероида архитектуры во время восстановления. Для того чтобы избежать этого потенциального ограничения, гидрогели могут быть сшиты других тиолированного субстратов и гель эрозии могут быть достигнуты с помощью соответствующих ферментов, которые не вызывают неблагоприятных межклеточные взаимодействия.

В целом, тиоловых-ен гидрогелей обеспечить cytocompatible условий, способствующих распространению β-клетки в 3D. Эта система может быть использована для культуры и изучения физиологических поведения различных типов клеток в 3D. Кроме того,Эта система позволяет поверхностное восстановление клеточных конструкций формируется в матрице гидрогеля для дальнейшего функциональных и биологических характеристик. Эта разнообразная и cytocompatible гидрогель система обеспечивает платформу для геля машиностроительного комплекса 3D тканей для регенеративной медицины приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Этот проект был профинансирован NIH (R21EB013717) и IUPUI OVCR (RSFG). Автор благодарит г-жа Хан Ши-ей технической помощи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-arm PEG (20kDa) Jenkem Technology USA 4ARM-PEG-20K
Fmoc-amino acids Anaspec
Live/Dead cell viability kit Invitrogen L3224 Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1
AlamarBlue reagent AbD Serotec BUF012
CellTiter Glo reagent Promega G7570
DPBS Lonza 17-512F Without Ca+2 and Mg+2
HBSS Lonza 10547F Without Ca+2 and Mg+2
High Glucose DMEM Hyclone SH30243.01
FBS Gibco 16000-044
Antibiotic-Antimycotic Invitrogen 15240-062
β-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522-100ML
Trypsin-EDTA Invitrogen 15400-054
Trypsin-free α-chymotrypsin Worthington Biochemical Corp LS001432
Mouse Inusin ELISA kit Mercodia 10-1247-01
1 ml disposable syringe BD biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
  2. Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
  3. Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
  4. Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
  5. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
  6. Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
  7. Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
  8. Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
  9. Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
  10. Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
  11. Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
  12. Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
  13. Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
  14. Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
  15. Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
  16. Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
  17. Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
  18. Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
  19. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
  20. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
Создание и восстановление β-клетки сфероидов Из Шаг рост PEG-пептида Гидрогели
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).More

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter