Протокол предусматривает следующие методы инкапсуляции панкреатических β-клеток на стадии роста PEG-пептида гидрогелей образована тиоловых-ен фото кнопкой мыши реакций. Этот материал платформа предлагает не только cytocompatible микроокружение для сотовых инкапсуляции, а также позволяет пользователю контролируемого быстрого восстановления клеточных структур, образующихся в гидрогелей.
Гидрогели являются гидрофильными сшитые полимеры, которые обеспечивают трехмерное микроокружение с тканью, как эластичность и высокую проницаемость для культивирования терапевтически соответствующие клетки или ткани. Гидрогели получают из поли (этиленгликоль) (ПЭГ) производным все чаще используются для различных областей применения тканевой инженерии, в частности, в связи с их перестраиваемых и cytocompatible свойства. В этом протоколе, мы использовали тиоловых-ен шаг роста photopolymerizations для изготовления PEG-пептида гидрогелей для инкапсуляции панкреатических MIN6 В-клеток. Гели были сформированы 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) макромера и химотрипсин-чувствительных пептида сшивающего агента (CGGYC). Гидрофильные и не загрязнение природы PEG предлагает cytocompatible микроокружения за выживание и пролиферацию клеток в 3D, в то время как использование химотрипсин-чувствительных пептидной последовательности (C GGY ↓ C, стрелка указывает сайт расщепления ферментов, в то время как терминал кистаEine остатки были добавлены для тиоловых-ен сшивание) позволяет быстрое восстановление клеточных конструкций формирования в гидрогель. Следующий протокол разрабатывает методы: (1) Инкапсуляция MIN6 β-клеток в тиоловых-ен гидрогелей; (2) Качественный и количественный анализы жизнеспособность клеток, чтобы определить выживание и пролиферацию клеток; (3) восстановление клеточных сфероидов использовании химотрипсина-опосредованной гель эрозии, и (4) Структурно-функциональный анализ восстановленных сфероидов.
Гидрогели являются гидрофильными сшитые полимеры с исключительным потенциалом леса материалы для ремонта и регенерации тканей. 1-3 высоким содержанием воды гидрогелей позволяет легко диффузии кислорода и обмен питательных веществ и клеточных продуктов метаболизма, которые имеют решающее значение для поддержания жизнеспособности клеток. Кроме того, гидрогели являются отличными носителями для контролируемого высвобождения и клеточной доставки из-за их высокой управляемость. 2 Синтетическая гидрогели, такие как изготовленные из поли (этиленгликоль) (ПЭГ) все чаще используются в приложениях тканевой инженерии, в основном из-за их cytocompatibility, ткани как эластичность и высокая управляемость в материалах физические и механические свойства. 4-6
Хотя обычно используется гидрогель платформы, исследования показали, что ПЭГ диакрилат (PEGDA) гидрогели образована цепочка роста photopolymerizations имеют тенденцию к повреждению инкапсулированные клетки Дуринг сшивания сети и на местах инкапсуляции клеток. 7 повреждение клеток была в значительной степени отнести к радикальным видов порожденных фотоинициатора молекул, которые распространяются через виниловых групп на PEGDA для сшивания полимерных цепей в гидрогелей. К сожалению, эти радикалы также вызывают стрессы и повреждение клеток в процессе клеточного инкапсуляции, особенно для радикально-чувствительные клетки поджелудочной железы, таких как β-клеток. 8-10 Для того, чтобы получить более высокий размер ячейки для лучшего распространения и выживания клеток, более высоким молекулярным весом PEGDA часто используется для сотового инкапсуляции. Это, однако, ставит под угрозу кинетики полимеризации и приводит к неоптимальным гель биофизических свойств. 7,11,12 В дополнение к выше недостатки, это очень трудно восстановить клеточные структуры от гидрогелей PEGDA в связи с неоднородностью и неразлагаемых природы сшитый сетей. В то время как протеазы, чувствительных к пептиды могут быть включеныв PEG макромера основой для визуализации в противном случае инертных PEGDA гидрогелей чувствительны к ферментативного расщепления, сопряжение часто использует дорогостоящих реагентов и в результате сетях по-прежнему содержат высокую степень неоднородности в связи с характером цепной полимеризацией. 13-15
Недавно PEG-пептида гидрогели образуются с помощью шаг за ростом тиоловых-ен фотополимеризации было показано, обладают свойствами льготных для сотовых инкапсуляция через гидрогелей образована цепочка роста фотополимеризации. 7 превосходную кинетику гелеобразования тиоловых-ен гидрогелей объясняется "нажмите "характер реакции между тиоловых и ен функций. По сравнению с цепным ростом полимеризации PEGDA, тиоловых-ен реакции меньше кислорода тормозится, что приводит к более быстрой скорости гелеобразования. 16,17 Thiol-ен гидрогели также имеют более высокую эффективность полимеризации и лучше гель биофизические свойства по сравнению с цепным ростом PEGDA гидрогелей, 7 , 18 </ SUP>, что приводит к ограниченной сотовой ущерб, причиненный радикалов во время фотополимеризации.
Ранее тиоловых-ен гидрогелей образована 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) макромера и бис-цистеин содержащих пептидов сшивающие агенты, такие как протеазы, чувствительных к пептиды были использованы для клеточной инкапсуляции. 7,18 Высокая управляемость сетей PEG гидрогель предлагает гибкой и управляемой 3D микросреду для исследования выживаемости клеток и активность, в то время как использование протеаз чувствительных к пептидной последовательности обеспечивает легкий путь для восстановления клеточных конструкций формируется, конечно, в гидрогелей. В этом протоколе мы используем шаг роста фотополимеризованных тиоловых-ен гидрогелей изготовлены с использованием 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) и химотрипсин-чувствительных пептида сшивающего агента (CGGY ↓ C) для инкапсуляции MIN6 β-клеток. Этот протокол систематически разрабатывает методы для изучения выживаемости, пролиферации и сфероида формирования MIN6β-клеток в тиоловых-ен гидрогелей. Мы также обеспечить метод для β-клетку сфероида восстановления и биологических характеристик восстановленных сфероидов.
Описанный протокол представляет подробную информацию о легкой инкапсуляции клеток в тиоловых-ен гидрогелей формируется за шагом роста фотополимеризации. В то время как стехиометрических соотношении 1:1 норборнена в тиоловые функциональные группы была использована в данном протокол?…
The authors have nothing to disclose.
Этот проект был профинансирован NIH (R21EB013717) и IUPUI OVCR (RSFG). Автор благодарит г-жа Хан Ши-ей технической помощи.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
FBS | Gibco | 16000-044 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
1 ml disposable syringe | BD biosciences |