Cellular levedyktighet avhenger rettidig og effektiv styring av protein misfolding. Her beskriver vi en metode for å visualisere de ulike potensielle skjebner i en misfolded protein: refolding, fornedrelse, eller håndtering i inneslutninger. Vi viser bruk av en sammenleggbar sensor, Ubc9<sup> Ts</sup> For overvåking proteostasis og aggregering kvalitetskontroll i levende celler ved hjelp 4D mikroskopi.
En av de viktigste oppgavene for enhver levende celle er å opprettholde riktig folding av nysyntetiserte proteiner i møte med stadig skiftende miljøforhold og en intracellulær miljø som er tett pakket, klebrig, og farlige til protein stabilitet 1. Muligheten til å dynamisk balansere protein produksjon, folding og degradering krever høyt spesialisert kvalitetskontroll maskiner, som har absolutt nødvendighet er observert best når det svikter. Sykdommer som ALS, Alzheimers, Parkinsons, og visse former for Cystisk fibrose har en direkte kobling til protein folding kvalitetskontroll komponenter 2, og derfor fremtidig terapeutisk utvikling krever en grunnleggende forståelse av underliggende prosesser. Vår eksperimentelle utfordring er å forstå hvordan celler integrere skader signaler og montere svar som er skreddersydd for ulike forhold.
Den primære grunnen til at protein misfolding representerer en eksistensiell threpå til cellen er tilbøyelighet av feil foldet proteiner til aggregat, og dermed forårsaker en global forstyrrelse av overfylt og delikat intracellulær folding miljø 1. Den sammenleggbare helse, eller "proteostasis," av den cellulære proteomet opprettholdes, selv under press av aldring, stress og oksidativ skade ved koordinert handling av ulike mekanistiske enheter i en forseggjort kvalitetssystem 3,4. En spesialisert maskineri av molekylære anstand kan binde ikke-innfødte polypeptider og fremme deres folding i naturlig tilstand 1, målrette dem for nedbrytning av ubiquitin-proteasome system 5, eller henvise dem til beskyttende aggregering inneslutninger 6-9.
I eukaryoter, er cytosoliske aggregering kvalitetskontroll belastningen fordelt mellom to kamrene 8-10: den juxtanuclear kvalitetskontroll kupé (JUNQ) og det uoppløselige protein innskudd (IPOD) (figur 1 – modell).Proteiner som er ubiquitinmolekyler av proteinfolding kvalitetskontroll maskiner leveres til JUNQ, hvor de blir behandlet for nedbrytning ved proteasomet. Misfolded proteiner som ikke ubiquitinmolekyler viderekobles til IPOD, hvor de aktivt samlet i en beskyttende lomme.
Frem til dette punktet har den metodiske paradigmet av live-cell fluorescensmikroskopi i stor grad vært å merke proteiner og spore sine steder i cellen på bestemte tidspunkter og vanligvis i to dimensjoner. Som ny teknologi har begynt å gi forskere enestående tilgang til submikron skala i levende celler, har den dynamiske arkitektur cytosol komme til syne som en utfordrende ny grense for eksperimentell karakterisering. Vi presenterer en fremgangsmåte for raskt å overvåke 3D romlige fordelinger av flere fluorescensmerkede proteiner i gjær cytosol over tid. 3D timelapse (4D imaging) er ikke bare en teknisk utfordring, rottehenne, det forenkler også en dramatisk endring i det konseptuelle rammeverket brukes til å analysere cellestruktur.
Vi bruker et cytosoliske folding sensor protein i levende gjær å visualisere forskjellige skjebner for misfolded proteiner i mobilnettet aggregering kvalitetskontroll, ved hjelp av rask 4D fluorescerende imaging. Den temperaturfølsomme mutant av den Ubc9 proteinet 10-12 (Ubc9 ts) er ekstremt effektiv både som en sensor av mobilnettet proteostasis, og en fysiologisk modell for sporing aggregering kvalitetskontroll. Som med de fleste ts proteiner, er Ubc9 ts fullt foldet og funksjonelle ettergivende temperaturer på grunn av aktive cellulære anstand. Over 30 ° C, eller når cellen ansikter misfolding stress, Ubc9 ts misfolds og følger skjebnen til en innfødt globular protein som har blitt misfolded grunn mutasjon, varme denaturering, eller oksidativ skade. Ved å fusjonere det til GFP eller andre fluoroforer, kan det spores i 3D som den danner Stress Foci, eller er dirigeres til JUNQ eller iPod.
Våre intuisjon om biokjemiske prosesser utlede fra benk topp eksperimenter hvor en godt blandet løsning av reaktanter og produkter er tillatt å nå likevekt i et begerglass. I et slikt miljø, kan konsentrasjonen av en gitt kjemisk art uttrykkes som et enkelt tall, som er forholdet av en molar mengde av molekyler i et makroskopisk volum. Mye av det vi vet om protein struktur og funksjon stammer fra bruk av metoder som gjenspeiler den klassiske, bulk reaksjon bilde: vestlige blotter, sentrifugering, og spektrofotometriske målinger utført på utdrag fra homogenater av hele populasjoner av celler.
Som teknologien vi bruker for å se på celler under forstørrelse øker i store sprang, blir det stadig tydeligere at forholdene der de fleste biokjemiske reaksjoner finner sted in vivo bærer bare den minste likhet med de av den klassiske benken toppen scenario. Ikke bare er det indre av cella tettpakket miljø, der samles effekter store forandringer av aktiviteter av ulike reaktanter, er det også helt motsatt av godt blandet. Dette utgjør den hyppige misforhold mellom in vitro og in vivo effektiviteten av et bredt spekter av komplekse makromolekylære reaksjoner.
Ingensteds er intuisjoner som stammer fra klassisk in vitro biokjemiske eksperimenter mer utsatt for å villede som i spørsmål knyttet til in vivo folding, misfolding, og aggregering av proteiner. Mens studier av protein kjemi i bulk reaksjoner kan behandle spørsmålet om folding for et gitt protein som et enkelt ja eller nei spørsmål, må ethvert forsøk på å spore dynamikken i hele populasjoner av makromolekyler i en levende celle være følsomme for hele fordelingen av mulige konformasjonsforandringer utfall tilgjengelige til en polypeptidkjede, og særlig risiko for misfolding og aggregering. For eksempel kan vi undersøke en bulk celle lysate av en aggregering protein av vestlige blotting, og fastslår at proteinet er for det meste uløselig og ikke ubiquitinated. Men i den levende celle en diskret subpopulasjon av proteinet, vanskeligere å avdekke når midling over mange celler, kan være oppløselige og ubiquitinated i en bestemt kammer hvor den lokale konsentrasjon av artene er ekstremt høy. Sistnevnte scenario kan ha flere viktige konsekvenser for levedyktigheten av cellen enn den større bulk subpopulasjon. Videre, mens anstand vise en rekke mitogen atferd og funksjoner i vitro, blir det tydelig at i cellen sin diskrete funksjoner er romlig og tidsmessig begrenset.
I de nylig dannede paradigme for forstå biokjemi, blir konsentrasjon en variabel for hvert spesifikke nano-miljøet i cellen, og de molekylære hendelser som ligger til grunn biologiske prosesser må analyseres ikke bare i tid, men også i space. 4D imaging tilnærming presenteres her muliggjør følsom modellering av protein misfolding i levende celler, selv om det kan brukes til å studere en rekke andre biologiske prosesser og hvordan de er regulert i rom, tid, og som følge av endringer i omgivelsene. I denne artikkelen bruker vi Ubc9 ts folding sensor, som effektivt viser stadier og alternativer for å håndtere utbruddet av protein aggregering i cytosol. I tillegg til å illustrere den cellebiologi aggregeringsnivå kvalitetskontroll kan denne tilnærmingen tjene som et kraftig verktøy for å tyde virkningen av bestemte forstyrrelser eller genetiske mutasjoner på proteostasis (f.eks Ubc9 ts kan brukes til å måle protein folding stresseffekten oksidasjon, ekspresjonen av en giftig aggregat, eller mutasjoner i kvalitetskontroll reaksjonsveien).
4D bildebehandling er også avgjørende for nøyaktig bestemmelse protein lokalisering eller colocalization mellom to ulike proteins, og for detektering fenomener som kanskje være forbigående, men viktig. For eksempel, spesielt i en liten rund organisme som gjær, kan det synes å være slik at en struktur eller samlet har juxtanuclear lokalisering, mens 4D bildebehandling kan avsløre at dette er rett og slett en gjenstand av vinkelen inspeksjon.
I eksemplet eksperimentet vi presenterer her, demonstrerer vi bruk av en modell misfolded protein, Ubc9 ts, å følge aggregering kvalitetskontroll over tid og sted i cytosolen. Ved den permissive temperaturen, blir Ubc9 ts foldet og diffundert i cellekjernen og cytosol. Ved varme-indusert misfolding, danner det utgangspunktet raskt spre små aggregerte Stress Foci som behandles for proteasomal degradering. Når proteasome er delvis hemmet, er disse Stress Foci konvertert til JUNQ og IPOD inneslutninger i løpet av ca 2 timer. Hvis ubiquitin-mediert nedbrytning er ikke tilgjengelig som en kvalitetskontroll alternativet, Ubc9 ts umiddelbart omdirigert til IPOD inkludering for beskyttende aggregering. Disse verktøyene gir utrolige muligheter til å oppdage nye genetiske faktorer involvert i aggregering kvalitetskontroll, og å utforske deres romlige og tidsmessige regulering i cellen.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
MG132 | Mercury | mbs474790 | |
con A | Sigma | C2010 | |
Glass bottom plates | ibidi | ibd81158 | |
4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software. |