Cellulär livsduglighet beror på tid och effektiv förvaltning av protein felveckning. Här beskriver vi en metod för att visualisera de olika potentiella öden en felveckade proteiner: återveckning, nedbrytning, eller beläggs med kvarstad i inneslutningar. Vi visar användningen av en hopfällbar sensor, Ubc9<sup> Ts</sup>, För övervakning proteostasis och aggregering kvalitetskontroll i levande celler med hjälp av 4D mikroskopi.
En av de viktigaste uppgifterna för varje levande cell upprätthålla korrekt veckning av nyligen syntetiserade proteiner i ansiktet av ständigt föränderliga miljöförhållanden och en intracellulär miljö som tätt packade, klibbiga och farliga för proteinstabilitet 1. Förmågan att dynamiskt balansera proteinproduktion, vikning och nedbrytning kräver högt specialiserad maskiner kvalitetskontroll, vars absolut nödvändighet observeras bäst när det inte fungerar. Sjukdomar som ALS, Alzheimers, Parkinsons, och vissa former av cystisk fibros har en direkt koppling till protein folding komponenter kvalitetskontroll 2, och därför framtida terapeutisk utveckling kräver en grundläggande förståelse av underliggande processer. Vår experimentella utmaning är att förstå hur celler integrerar skador signaler och montera svar som är anpassade till olika omständigheter.
Den främsta anledningen till varför protein felveckning utgör en existentiell threpå att cellen är benägenheten hos felaktigt veckade proteiner att aggregera, vilket orsakar en global störning av den överfulla och känsliga intracellulära fällbar miljö 1. Den fällbara hälsa, eller "proteostasis," av det cellulära proteom bibehålls, även under tvång av åldrande, stress och oxidativ skada, genom samordnade åtgärder av olika mekanistiska enheter i ett utstuderat system för kvalitetskontroll 3,4. En specialiserad maskineri av molekylära chaperoner kan binda främmande polypeptider och främja deras vikning i det nativa tillståndet 1, rikta dem för nedbrytning av ubiquitin-proteasom-systemet 5, eller hänvisa dem till skyddande aggregering inneslutningar 6-9.
I eukaryoter är cytosoliska aggregering kvalitetskontroll belastning fördelas mellan två fack 8-10: den juxtanuclear kvalitetskontroll fack (JUNQ) och det olösliga proteinet deposition (IPOD) (Figur 1 – modell).Proteiner som ubiquitinerade av proteinveckning kvalitetskontroll maskiner levereras till JUNQ, där de behandlas för nedbrytning genom proteasomen. Felveckade proteiner som inte är ubiquitinerade vidarekopplas till iPod, där de aktivt samman i en skyddande fack.
Fram till denna punkt har den metodologiska paradigm levande celler fluorescensmikroskopi i stort sett varit att märka proteiner och spåra sina platser i cellen vid specifika tidpunkter och oftast i två dimensioner. Som ny teknik har börjat ge praktiker oöverträffad tillgång till submikron skala i levande celler, har den dynamiska arkitektur cytosolen kommer i vyn som en utmanande ny gräns för experimentell karakterisering. Vi presenterar en metod för att snabbt övervaka 3D rumsliga fördelningen av flera fluorescensmärkta proteiner i jäst cytosolen över tiden. 3D Timelapse (4D imaging) är inte bara en teknisk utmaning, råttahenne, underlättar också en dramatisk förändring i den begreppsmässiga ram som används för att analysera cellulär struktur.
Vi använder en cytosoliskt hopfällbar sensor protein i levande jäst för att visualisera olika öden för felveckade proteiner i cellulära aggregering kvalitetskontroll, med snabb 4D fluorescerande avbildning. Den temperaturkänsliga mutant av Ubc9 proteinet 10-12 (Ubc9 ts) är extremt effektiv både som en sensor av cellulär proteostasis, och en fysiologisk modell för att spåra aggregering kvalitetskontroll. Som med de flesta ts proteiner är Ubc9 ts fullt vikta och funktionella vid tillåtande temperaturer på grund av aktiva cellulära chaperoner. Över 30 ° C, eller när cellen står inför felveckning stress, Ubc9 ts misfolds och följer ödet för en infödd globulärt protein som har felveckade grund av mutation, värmedenaturering eller oxidativ skada. Genom att fusera den till GFP eller andra fluoroforer, kan den spåras i 3D eftersom den bildar stress Foci, eller är directed till JUNQ eller iPod.
Våra intuitioner om biokemiska processer härrör från experiment bänkskiva där en väl blandad lösning av reaktanter och produkter tillåts att nå jämvikt i en bägare. I en sådan inställning, kan koncentrationen av en given kemisk species uttryckas som ett enda tal, vilket är förhållandet mellan en molär mängd av molekyler till en makroskopisk volym. Mycket av det vi vet om proteiners struktur och funktion härrör från att använda metoder som återspeglar den klassiska, bulk reaktion bild: western blotting, centrifugering och spektrofotometriska mätningar som utförts på extrakt från homogenat av hela populationer av celler.
Som den teknik vi använder för att titta på celler under förstoring förbättras med stormsteg, blir det allt tydligare att de förhållanden under vilka de flesta biokemiska reaktioner sker in vivo bär endast den minsta likhet med dem i det klassiska bänk scenario. Inte bara är det inre av celLa packade tätt miljö, där trängsel effekter väsentligt förändrar verksamheten i olika reaktanter är det också tvärtom av väl blandat. Detta förklarar den ofta skillnaden mellan in vitro och in vivo effektiviteten hos ett brett spektrum av komplexa makromolekylära reaktioner.
Ingenstans är intuitioner som härrör från klassisk in vitro biokemiska experiment mer benägna att vilseleda i frågor som hänför sig till in vivo-vikning, felveckning och aggregering av proteiner. Medan studier av proteinkemi i bulk reaktioner kan behandla frågan om vika för ett givet protein som en enkel ja eller nej fråga måste alla försök att spåra dynamiken i hela populationer av makromolekyler i en levande cell vara känslig för hela fördelningen av möjliga konformationella resultat tillgängliga för en polypeptidkedja, och särskilt risken för felveckning och aggregering. Till exempel kan vi undersöka en bulk cell lysatt av en aggregerande protein genom western blotting, och bestämma att proteinet är mestadels olösligt och inte ubiquitineras. Emellertid, i den levande cellen en diskret subpopulation av proteinet, svåra att upptäcka när genomsnitt över många celler, kan vara lösliga och ubiquitineras i en viss avdelning där den lokala koncentrationen av arten är extremt hög. Det senare scenariot kan ha mer betydande konsekvenser för lönsamheten i cellen än den större delen delpopulation. Dessutom, medan chaperones visa olika pleiotropa beteenden och funktioner in vitro, blir det uppenbart att i cellen deras diskreta funktioner rumsligt och tidsmässigt begränsad.
I den nyligen framväxande paradigm för att förstå biokemi, blir koncentrationen en variabel egenskap hos varje specifik nano-miljö i cellen, och de molekylära händelser som ligger till grund för biologiska processer måste analyseras inte bara i tid, men också i SPACe. 4D avbildningsteknik som presenteras här kan känslig modellering av protein felveckning i levande celler, men det kan användas för att studera ett antal andra biologiska processer och hur de regleras i rum, tid, och efter förändringar i miljöförhållanden. I detta dokument använder vi Ubc9 ts fällbara sensor som effektivt demonstrerar stegen och alternativ för att hantera uppkomsten av proteinaggregering i cytosolen. Förutom att illustrera cellbiologin om sammanläggning kvalitetskontroll kan detta tillvägagångssätt fungera som ett kraftfullt verktyg för att dechiffrera effekten av specifika störningar eller genetiska mutationer på proteostasis (exempelvis Ubc9 ts kan användas för att mäta proteinveckning stress som svar på oxidation, uttrycket av en toxisk aggregat, eller mutationer i kvalitetskontroll vägen).
4D avbildning är också viktigt för noggrann bestämning proteinlokalisering eller samlokalisering mellan två olika proteiners och för detektering fenomen som kanske vara övergående men viktiga. Till exempel, speciellt i en liten sfärisk organism, såsom jäst, kan det tyckas vara så att en struktur eller aggregat har juxtanuclear lokalisering, medan 4D avbildning kan visa att detta är helt enkelt en artefakt av vinkeln för inspektion.
I exemplet experimentet vi presenterar här, visar vi att använda en modell felveckade proteiner, Ubc9 ts att följa kontrollen aggregering kvalitet över tid och rum i cytosolen. Vid den tillåtna temperaturen, är Ubc9 ts viks och diffunderade i kärnan och cytosolen. Vid värmeinducerad misfolding bildar det inledningsvis snabbt sprida små Foci sammanlagda stress som behandlas för proteasomal nedbrytning. När proteasomen partiellt inhiberas, är dessa Stress Foci omvandlas till JUNQ och inneslutningar IPOD under loppet av ca 2 timmar. Om ubiquitinmedierad nedbrytning är inte tillgänglig som en kvalitetskontroll alternativ, UbC9 ts omedelbart omdirigeras till iPod integration för skyddande aggregering. Dessa verktyg ger otroliga möjligheter att upptäcka nya genetiska faktorer som aggregering kvalitetskontroll och att undersöka deras rumsliga och tidsmässiga reglering i cellen.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
MG132 | Mercury | mbs474790 | |
con A | Sigma | C2010 | |
Glass bottom plates | ibidi | ibd81158 | |
4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software. |