פרוטוקול ריבוזומלי רנ"א (rRNA) דלדול פותח כדי להעשיר RNA שליח (mRNA) לRNA-seq של metatranscriptome בטן היתוש. בדיקות דגימה ספציפיות rRNA, ששמשו להסרת rRNA דרך חיסור, נוצרו מהיתושים וחיידקי המעיים שלה. ביצועים של הפרוטוקול יכולים להוביל להסרה של כ 90-99% מrRNA.
בטן היתוש להכיל קהילות מיקרוביאלי דינמיות על פני שלבים שונים של מחזור החיים של החרק. אפיון של היכולות ותפקודים הגנטיים של קהילת המעיים יספק תובנה לתוך ההשפעות של חיידקי מעיים על תכונות חי יתושים. Metagenomic RNA-Seq הפך כלי חשוב לנתח transcriptomes מחיידקים המצויים בקהילת חיידקים שונים. RNA השליח בדרך כלל מהווה רק 1-3% מכלל רנ"א, בעוד rRNA מהווה כ 90%. זה מאתגר להעשרת RNA שליח ממדגם רנ"א מיקרוביאלי metagenomic כי מיני mRNA פרוקריוטים רוב חסרים (A) זנבות פולי יציבים. זה מונע בידוד Oligo ד (ט) בתיווך-mRNA. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שמעסיק מדגם נגזר rRNA ללכוד בדיקות כדי להסיר rRNA ממדגם RNA סך metagenomic. כדי להתחיל, גם יתושים וברי rRNA של חיידקים קטנים וגדולים למקטע הם מוגברים מדגימת DNA קהילת metagenomic. ואז, commuבדיקות nity ספציפיות biotinylated antisense RNA ריבוזומלי מסונתזות במבחנה באמצעות RNA פולימראז T7. בדיקות rRNA biotinylated הם הכלאה לרנ"א בסך הכל. הכלאיים נתפסו על ידי חרוזי streptavidin מצופים והוצאו מכלל רנ"א. פרוטוקול חיסור מבוסס ביעילות מסיר גם יתושים וrRNA של חיידקים מדגימת RNA המוחלטת. המדגם המועשר mRNA עובר עיבוד נוסף להגברת RNA ו-RNA-Seq.
טכנולוגיית הדור הבא של רצף התקדמה מחקר metagenomics מאוד על ידי המאפשר להעריך את ההרכב הטקסונומי והפונקציונלי גנטיים של מכלול של חיידקים. RNA-רצף (RNA-Seq) 1 יכול לעקוף שיטות תרבות מבוססת לחקור metatranscriptomes מיקרוביאלי ב2-5 הקשרים שונים. מכשול עיקרי לחיידקי RNA-seq הוא הקושי בהעשרה-mRNA, כמין mRNA פרוקריוטים אינו polyadenylated ביציבות. לכן, העשרת Oligo ד (ט) בתיווך שליח אינה ישימה. הסרת rRNA שפע היא גישה חלופית להעשרה-mRNA. ערכות מסחריות rRNA דלדול, כגון ערכת Microexpress קטריאלי mRNA העשרה (Ambion), RiboMinus transcriptome בידוד קיט (חיידקים) (חי טכנולוגיות), ורק mRNA-ערכה פרוקריוטים mRNA בידוד (Epicentre) שמעדיפים מדרדרת rRNA עם exonuclease, היו בשימוש להסרת rRNA 6-8. עם זאת, בדיקות ללכוד בMicroexpressאו RiboMinus טוב להסרת rRNA הידוע מחיידקים גראם חיוביים וגראם שליליים טיפוסיים (ראה מפרטים של יצרנים), אבל פחות מתאים עם rRNA מחיידקים לא ידועים. כתוצאה מכך, ההסרה עשויה להיות פחות יעילה עבור 8-10 דגימות metagenomic. חוץ מזה, נאמנות שפע mRNA הייתה מוטלת בספק, כאשר טיפול exonuclease יושם 11. בסך הכל, דלדול rRNA חיסור מבוסס היה פחות מוטה ויעיל יותר בהעשרת mRNA בהגדרות metagenomic 10-13.
בטן היתוש להכיל חיידקי קהילה דינמית 14. אנו מעוניינים באפיון הפונקציה של microbiome בטן היתוש באמצעות RNA-Seq. במדגם RNA המבודד מאומץ היתושים, שני RNA היתושים וחיידקים הם הווה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול הותאם לשימוש בדיקות rRNA ספציפיות קהילתיות יעילות כדי לרוקן rRNA יתושים וחיידקים על ידי הכלאת חיסור. MRNA כתוצאהדגימות מועשרות מתאימות לRNA-Seq. העבודה הכוללת מתוארת באיור 1.
קהילת חיידקים מורכבת מתגוררת במערכת האקולוגית בטן יתוש 14,16,17. Metatranscriptomic רצף (RNA-seq) יכול לחשוף מידע פונקציונלי תלוי בהקשר של חקירה כל חיידקי transcriptome 4,18. מבחינה טכנית, העשרת Oligo-ד (ט) בתיווך של mRNA פרוקריוטי אינה ישימה בשל העדר (A) זנבות של השליחים פולי היציבים. ל?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH 1SC2GM092789-01A1, והטרשת הנפוצה הייתה תלמיד מחקר של תוכניות NMSU הווארד יוז רפואי מכון מחקר לתואר ראשונות. הסרטון ביים והפיק על ידי איימי Lanasa ומתואם על ידי ד"ר פיליפ לואיס עם מדיה מכון קריאייטיב ב NMSU.
Reagent/Material | |||
Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
Equipment | |||
Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |