Summary
リボソームRNA（rRNA）の枯渇プロトコルは蚊腸metatranscriptomeのRNA-seqのためのメッセンジャーRNA（mRNA）を豊かにするために開発されました。引き算を介しrRNAを除去するために使用されたサンプル特定のrRNAプローブは、蚊とその腸内微生物から作成されています。プロトコルのパフォーマンスは、rRNAの約90から99パーセントの除去をもたらすことができます。
Abstract
蚊の腸は昆虫のライフサイクルのさまざまな段階でダイナミック微生物群集を収容する。腸コミュニティの遺伝能力と機能の特徴づけは、蚊生活特性に及ぼす腸内細菌叢に及ぼす影響への洞察を提供します。メタゲノムRNA-Seqは微生物群集中に存在する様々な微生物からトランスクリプトームを解析するための重要なツールとなっている。 rRNAは約90％を占めながら、メッセンジャーRNAは通常、全RNAのわずか百分の1から3を備えている。それは、ほとんどの原核生物のmRNA種が安定してポリ（A）尾部を欠いているため、メタゲノム微生物RNAサンプルからメッセンジャーRNAを豊かにするために挑戦している。これは、オリゴd（T）媒介mRNA分離を防ぐことができます。ここでは、メタゲノムトータルRNAサンプルからrRNAを除去するためにrRNAの捕獲プローブ由来の試料を用いてプロトコルを記述します。開始するには、両方の蚊と微生物、大小のサブユニットrRNAの断片は、メタゲノムコミュニティのDNAサンプルから増幅されています。その後、コミュnity特異的なビオチン化アンチセンスリボソームRNAプローブは、T7 RNAポリメラーゼを用いてin vitro で合成される。ビオチン化されたrRNAのプローブは、全RNAにハイブリダイズさせる。ハイブリッドは、ストレプトアビジンコートビーズによって捕獲され、全RNAから削除されます。この減算ベースのプロトコルでは、効率的にtotal RNAサンプルから蚊や微生物rRNAの両方を削除します。 mRNAを濃縮試料をさらにRNA増幅およびRNA - seqのために処理される。
Introduction
次世代シーケンシング技術は大きく分類学的組成や微生物集団の遺伝的機能を評価できるようにすることで、メタゲノム研究を進めてきた。 RNA-シーケンシング（RNA-seq）が1は、異なる文脈2-5に微生物metatranscriptomesを調査するために、培養ベースのメソッドをバイパスすることができます。原核生物のmRNA種を安定的ポリアデニル化されていないため、微生物のRNA-seqの大きな障害とは、mRNAを濃縮することが困難であることである。したがって、オリゴd（T）媒介メッセンジャー濃縮は適用されません。豊富なrRNAの除去は、mRNAを豊かにするための代替的なアプローチです。そのようなMicroexpress細菌のmRNA濃縮キット（Ambion）、RiboMinusトランアイソレーションキット（細菌）（Life Technologies）を、優先的エキソヌクレアーゼでrRNAを劣化させるのmRNA-ONLY原核mRNAアイソレーションキット（エピセンター）などの商業rRNAの枯渇キットは、使用されてきたrRNAの6-8を取り除くため。 Microexpressでしかし、捕捉プローブまたはRiboMinusは未知の微生物から典型的なグラム陽性菌およびグラム陰性菌から知られているrRNAを除去するための良い（メーカーの仕様を参照してください）が、リボソームRNAとの互換性に欠けています。その結果、除去はメタゲノムサンプル8-10にはあまり効率的であるかもしれません。エキソヌクレアーゼ処理が11を塗布した場合に加えて、mRNA存在量の忠実度には疑問だった。全体的に、減算ベースrRNAの枯渇がより少ないバイアスとメタゲノムの設定10-13のmRNAの濃縮度のより効果的であった。
蚊の腸はダイナミック微生物群集14が収容されている 。我々は、RNA-Seqを使って蚊腸microbiomeの機能を特徴付けることに興味を持っています。蚊の根性から単離されたRNAサンプルでは、蚊や微生物RNAの両方が存在している。ここでは、効率的にサブトラクティブハイブリダイゼーションにより、蚊や微生物rRNAを除去するために、地域社会固有のrRNAのプローブを使用するように修正されたプロトコルを記述します。得られたmRNA濃縮されたサンプルは、RNA - seqのに適しています。ワークフロー全体を図1に描かれている。
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Protocol
手順
1。蚊飼育
- 27.5での昆虫館でリア蚊ハマダラカ G3の歪℃の明/暗の湿度80％と12時12時間の周期を持つ。
- 比1:1でビール酵母でグランドキャットフードと幼虫を養う。
- 産卵のために3日目発芽後にマウスの血液を蚊の成虫を養う。
2。蚊腸解剖
- オートクレーブ解剖ツール（スライドや鉗子）。
- アスピレーターを用いて50蚊を収集し、CO 2流量ベッド（アルティメットFlypad）の上に置きます。蚊の体表面をきれいにする70％エタノールを含む3ペトリ皿に順次蚊の標本をすすぐ。
- 実体顕微鏡下のスライドガラス上に試料を置きます。腸を取り出します。
- メタゲノムDNA単離するための条件あたり50根性を収集します。メタゲノムRNA単離のための条件あたり50根性を収集します。 3。メタゲノムDNAの単離
- 300μlのTEで50蚊根性を置きます。氷の上で速度2,000 rpmでバイオジェンPRO200ホモジナイザー（PROの科学社、米国）を用いて、1分のためにそれらをホモジナイズする。
- リゾチーム溶液と細胞懸濁液へのRNase Aを1μl既製溶解液2μlを追加します。 30分間37℃でインキュベートし、ボルテックスで混和。
- メタのLysis Solution（2X）とチューブにプロテイナーゼKを1μlの300μlを添加する。ボルテックスで混ぜる。簡単に言うと、ソリューションのすべてをチューブの底にあることを確実にするためにチューブをパルス遠心し、3〜5分間氷上で、次いで室温に15分間で、場所を65℃でインキュベートする。
- 10秒間激しくボルテックスすることによりチューブとのミックスに、MPCのタンパク質沈殿試薬350μlを添加する。
- ペレットトン4時に彼12,000 xgで10分間の遠心分離により破片℃、
- クリーン2 mlチューブに上清を移し、ペレットを捨てる。
- 上清にイソプロパノール570μlを添加する。反転チューブを数回転倒混和する。
- ペレット4で12,000 xgで10分間遠心分離によりDNA℃、 DNAペレットを外れずにイソプロパノールを削除します。
- ペレットを洗浄する75％エタノール500μlを添加する。 4℃、12,000 xgで5分間遠心DNAペレットを乱さずにエタノールを除去します。 2分間室温でペレットを空気乾燥。注：DNAペレット過乾燥させないでください。
- TEバッファー50μlのDNAペレットを再懸濁します。
- 1％アガロースゲル上で電気泳動を経由して、キットに付属;フォスミドコントロールDNA（100 ng /μlに40キロバイト）と比較することにより単離されたDNAのサイズを検証します。
- 500μlのTriPureアイソレーション試薬による2 mlチューブで50蚊根性を入れてください。ホモジナイザーを用いて氷の上で速度2,000 rpmで1分間ホモジナイズする。核タンパク質複合体の解離を許可するように室温で5分間放置します。
- 12秒のために、100μlのクロロホルムと渦を追加し、2分間室温で放置します。
- 10分間、10,000×gで遠心分離します。慎重に、相を分離を乱すことなく、チューブを取り出します。
- 新しいチューブに水相を移し、250μlのイソプロパノールを加えよく混ぜ、20分間-20℃で置く。
- 4℃で10分間12,000 xgで遠心し沈殿℃のRNAに。
- ペレットを外れずに、上清を捨てる。 750μlの75％エタノールでペレットを洗浄します。
- ペレットを乱すことなく、上清をピペットで。 Airは2分間、チューブを乾燥させてください。
- 30μlのヌクレアーゼフリー水を用いてRNAを再懸濁します。
- 37℃でDNaseで全RNAを扱う20分間C、およびその後15分間75℃でインキュベートすることにより、DNaseを不活性化する。 30μlのヌクレアーゼフリー水でエタノールに再懸濁しRNAとRNAを沈殿させる。
- 光度計を用いてトータルRNAの量を決定します。
- リボソームRNA遺伝子断片のPCR増幅
このステップでは、トータルRNAサンプルのrRNAに相補的であるアンチセンスリボソームRNA（arRNA）プローブを生成するためにin vitro転写用のテンプレートとして使用されるサンプル固有のrRNAのプールを作成します。- rRNAの断片のPCR（ 表1）のプライマーセットを設計し、合成する。
- 50でPCRを実行する50 ngのDNAテンプレート、1×PCR緩衝液、1.5ミリメートルのMg 2とTaq DNAポリメラーゼ（Qiagen）を用いて反応液Clを、94℃で変性を35サイクルと0.2μMのプライマー℃で10秒間、40℃15秒のアニーリング℃で細菌の23Sリコン、および50℃、他のアンプリコン、72で拡張するための1分（72℃最終伸長℃で5分間）℃で。
- 1％アガロースゲルでPCR産物を表示します。
- 50μlの溶出バッファーで溶出をQIAクイックPCR精製キットを用いてPCR産物を精製する。光度計を用いて濃度を定量化する。
- ビオチン標識アンチセンスのrRNAプローブ（arRNA） の in vitro転写。注：このステップでは、様々なrRNAのアンプリコンからサンプル特異的なプローブをMEGAscript T7キットを用いて合成される。
- 成分（ 表2）の下に混合することにより、各サンプル固有のrRNAのアンプリコンのための20μlの反応を設定します。 37℃で一晩インキュベート℃、
- DNAテンプレートを削除するには20分間37℃でインキュベートし、反応を1μlのDNase I（キットに含まれる）を追加します。
- ℃をarRNAを合成した沈殿物に4℃で10分間12,000 xgで遠心分離し、反応液に100μlの100％エタノールを加える。上清を捨て、750μlの75％エタノールでペレットを洗浄する。 50μlのヌクレアーゼフリー水でRNAプローブを再懸濁します。
- 光度計を用いてRNA濃度を定量化する。 -80ストアプローブ℃、
- 成分（ 表2）の下に混合することにより、各サンプル固有のrRNAのアンプリコンのための20μlの反応を設定します。 37℃で一晩インキュベート℃、
- ビオチン化arRNA rRNAとを減算。注：このステップは、全RNAサンプルでrRNAにハイブリダイズするビオチン化arRNAを採用しています。 rRNAをarRNAハイブリッドをストレプトアビジンコート磁気ビーズによってキャプチャされます。手順はマイナーな修正と参考文献13に記載されたプロトコルに基づいています。
- 試薬
- 0.1NのNaOH、20Xナトリウム塩素を準備IDE-クエン酸ナトリウム（SSC）と20％ホルムアミドで1×SSCで。
- 交配
- 細菌の16Sおよび23Sプローブ（0.75μgの各々）、蚊の18Sおよび28Sプローブ（0.75μgの各々）と1μgの全RNA、1μlのRNase阻害剤、2.5μlの20X SSC緩衝液、200μlのPCRチューブに10μlの100％ホルムアミドを混ぜる、50μlにヌクレアーゼフリー水を追加します。
- 70℃のサーマルサイクラーとインキュベートに反応管を置き℃、5分間は、二次構造を開き、℃で1分間℃刻み各°Cの5を使用してrRNAおよびarRNAプローブのハイブリダイゼーションを可能にするために25に下降する。
- rRNAの除去
- 1.7ミリリットルチューブに300μlのストレプトアビジンコーティングビーズを転送します。ビーズを固定化するために磁気分離ラックにチューブを置きます。上清を除去します。 0.1N NaOHおよびマイル300μlのビーズを再懸濁よくX。磁気ラックに戻ってチューブを配置し、上清をピペットで。 1X SSC300μlのビーズを再懸濁し、ビーズを固定し、上清をピペットで、よく混ぜる。 1X SSCの1以上の時間300μlの洗浄を繰り返します。
- 1.7ミリリットルチューブに、ビーズの3アリコート、それぞれ100μlを加える。磁気ラックにチューブを入れ、ピペッティングにより上清を除去する。注：ビーズのアリコートをビオチン化したrRNAをarRNAハイブリッドを捕捉する3ラウンドのために使用されます。
- 50μlのハイブリダイゼーション反応に20％ホルムアミド、50μlの1×SSCを追加します。第1ビードアリコートチューブに反応を移し、よく混ぜます。ビオチン化プローブ-rRNAのハイブリッドがストレプトアビジンビーズによって捕捉されるように室温で10分間インキュベートします。インキュベーション中に混在させるチューブを2分毎にフリックします。
- ビーズを固定化するために磁気ラックにチューブを置き、第二aliqに上清を移すビーズのUOTは、よく混ぜて、上記のようにインキュベートする。ビーズの第三チューブに上清を移すことによって第三のキャプチャを行っています。混和後、。
- 製造元のマニュアルに従ってホルムアミドを除去するためのRNeasy MinEluteキットを使用して、新しいチューブと行動の浄化に非rRNAの上清を移す。
- バイオアナライザ（ 図4）のAgilent RNA 6000ピコチップキットを用いることによりrRNAの枯渇の効率を確認してください。
- 試薬
注：メタゲノムDNAは後述の修正を加えてメタG - ノームのDNA単離キット（エピセンターバイオテクノロジーズ）を用いて単離される。
4。 total RNA抽出
注：作業領域をきれいにRNaseの混入を最小限に抑えるためRNaseZap持つ。メタゲノムRNAはマイナーな修正とTriPure分離試薬（Roche）を使用して蚊の腸の検体から分離された。
5。リボソームRNAの枯渇
注：プロトコルは前述の方法12,13,15に基づいて開発されました。
注：rRNAの枯渇したRNAサンプルが8必要に応じて増幅をmRNAに加算されます。
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Representative Results
（2）サンプル特異的捕捉のrRNAプローブの作成、rRNAの（3）枯渇サブトラクティブハイブリダイゼーションによる総RNAからrRNAをPCR用のメタゲノムDNA鋳型の製造（1）：このプロトコルは、次の3つのセクションが含まれています。高品質メタゲノムDNAとRNAの単離は、全体のプロセスに不可欠です。修正されたメタG-ノームDNA単離プロトコルは、 図2に示すように、蚊根性から高品質なメタゲノムDNAを、もたらします。それは蚊根性から高品質な全RNAを単離するために挑戦することができます。これはおそらく蚊根性のRNaseを含む様々な酵素の存在によるものである。我々は、ロシュTriPureへキアゲンRNA分離キットのトータルRNA抽出性能を比較した。アジレントバイオアナライザー分析のエレクトロTriPureを使用して抽出したtotal RNAはQiagenキットを用いて得られたRNAには見られない明確なrRNAのピーク（ 図3）が含まれていることを示した。おそらく、蚊由来のRNaseは効果的に不活化されTriPureにおけるフェノールによるd。一般的に、50蚊根性収率〜20μgの全RNA。現在のrRNAの除去過程の総RNAインプットの理想的な量はrRNAの減算および収量の効率を最適化〜1μgを、〜150ngの精製されたRNAであり、 図4は、rRNA減算前と後のRNA電気泳動の比較を示す。非rRNAの種は大きく残り、RNAに富んでいた間にrRNAを効率的に除去されました。大きいサイズのRNA（> 2,000 bp）の存在は、濃縮されたmRNAの良質（ 図4B）を示します。プロトコルは、処理のためのRNAの大きい入力に対応するためにスケールアップすることができます。通常5μgのRNAは、RNA-seqのプロセスのために必要とされる。したがって、我々は、RNA - seqのためのrRNAの枯渇したRNAの十分な量を生成するためにMessageAmp II - 細菌のRNA増幅キットを使用していました。我々は、150 ngを使用している以上の増幅の再現性を保証するために、RNA増幅用のRNAを精製することをお勧めします。このプロトコルはapplてきました蚊の腸のRNA - seqのプロジェクトにiedを。 rRNAの枯渇を効果的に誘導されたサンプルの捕捉プローブを使用することによって達成された。 表3は、rRNAの割合は4つのサンプルのRNA - seqの出力を読み込む。二糖給餌と2つの血液で育てられた腸サンプルが枯渇およびRNA - seqのために処理した。 23-24M生成イルミナシーケンスは、各サンプルの読み取り。 rRNAの減算は、効果的に腸サンプルにおける蚊の組織や微生物の両方の90から99パーセントのrRNAを除去。枯渇は砂糖で育てられた腸サンプルにおいてほぼ完了した、と6.12から10.98パーセントのrRNAは、血中で育てられた試料（ 表3）に残っていた。
| 単位複製配列 | フォワード5'-3 ' | 5'-3 'を逆に |
| 細菌の16S | 27F | 803R_T7 |
| AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | TAATACGACTCACTATAGG NCTACCTGGGTATCTAATCC | |
| 347F | 1492R_T7 | |
| GGAGGCAGCAGTRRGGAAT | TAATACGACTCACTATAGG GACGGCTACCTTGTTACGACTT | |
| 細菌の23S | 189F | 2490R_T7 |
| GAASTGAAACATCTHAGTA | TAATACGACTCACTATAGG GCGACATCGAGGTGCCAAAC | |
| 1075F | 2241R_T7 | |
| GTTGGCTTRGARGCAGC | TAATACGACTCACTATAG GGACCGCCCCAGTHAAACT | |
| 蚊18S | 18SF1 | 18SR1_T7 |
| GGTTGATCCTGCCAGTAGTAT | TAATACGACTCACTATAGGカリフォルニアAACGCTTTCGCTTCTGT | |
| 18SF2 | 18SR2_T7 | |
| GGGCCGGCGTTGGCCGAGAAT | TAATACGACTCACTATAGG TTCACTTACGGAAACCTTG | |
| 蚊28S | 28SF1 | 28SR1_T7 |
| AGG AAC CAC AGG TAC GGA CC | TAATACGACTCACTATAGG ACCACCAAGCATGGGTCGCC | |
| 28SF2 | 28SR2_T7 | |
| AGGAACCACAGGTACGGACC | TAATACGACTCACTATAG GTCCCGGAGGTGCCTCAA |
rRNAの断片増幅細菌16Sと23のプライマーについて表1のプライマーセットは、20,19に基づいて設計されています。 T7プロモーター配列は太字で示しています。
| 2μlの | |
| PCR産物（0.5-1μg）を | μlを1.5 |
| ATP（75mm）の | 2μlの |
| GTP（75mm）の | 2μlの |
| CTP（75mm）の | μlを1.5 |
| UTPケーブル（75mm）の | μlを1.5 |
| ビオチン-11-CTP（10mm）が | 3.75μlの |
| ビオチン-16-UTP（10mm）が | 3.75μlの |
| T7 RNAポリメラーゼ | 2μlの |
表2のrRNAプローブのin vitro合成のコンポーネント。
| サンプル | 合計は、読み取り | 蚊のrRNA読み込み（％） | 微生物の16Sは（％）を読み取る | 微生物の23Sは、読み取り（％） | rRNAの読み取りの合計％* |
| SM1 | 24341850 | 121987（0.50） | 3717（0.02） | 6810（0.03） | 0.54 |
| SM2 | 23487202 | 114430（0.49） | 30271（0.13） | 38261（0.16） | 0.78 |
| BM1 | 23438304 | 265433（1.13） | 2054777（8.77） | 253051（1.08） | 10.98 |
| BM2 | 24212240 | 110240（0.46） | 1186423（4.90） | 185074（0.76） | 6.12 |
表3。スタットrRNAのisticsは、RNA-seqの出力を読み込む。 SM：砂糖給餌腸; BM：血液給餌腸。 *：蚊rRNAおよび微生物rRNAのパーセンテージの合計が読み込まれます。
図1。メタゲノムDNAやRNAの分離の処理手順を示すフローチャート、rRNAの捕捉プローブの合成、ハイブリダイゼーション、およびビーズをベース枯渇をキャプチャします。
図2。メタゲノムDNA単離、DNAサンプルを1％アガロースゲル上で分離した。 1、フォスミドDNA（40キロバイト）、2、蚊の腸内メタゲノムDNAを。
図3。蚊腸から品質のRNAを抽出する上で、効率のための2つのtotal RNA抽出試薬の比較は。エレクトロのオーバーレイは、TriPureアイソレーション（青）から全RNA rRNAのピークと広いRNAの分布を持っていたことを示していながら、キアゲンアイソレーション（赤）からその明確なrRNAのピークがありませんでした。
図4。 rRNAの枯渇。エレクトロの効率は、前（A）と（B）のrRNAの枯渇後にトータルRNAを示しています。 rRNAのピークを効率的に除去された。 rRNAの枯渇した試料中の4キロバイトの遺跡よりも大きいRNA。 RNA濃度は107.6でng /μlに（A）と（B）でng /μLの8.6であった。
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Discussion
複雑な微生物群集は、蚊の腸内生態系14,16,17に格納されています。 Metatranscriptomicシング（RNA-seq）は全体の微生物のトランスクリプトーム4,18を問い合わせることによってコンテキスト依存機能情報を明らかにすることができます。技術的には、原核生物のmRNAのオリゴd（T）媒介濃縮が原因でメッセンジャーの安定したポリ（A）尾の不在には適用されません。別の方法として、rRNAの枯渇は、mRNAの濃縮に使用されている。ここでは、蚊の腸内微生物群集での非常に自身のメタゲノムDNAから作られたrRNAのプローブを使用したrRNAを枯渇させるために減算ベースのプロトコルを開発しました。 rRNAの除去効率は、rRNA PCRによって生成されたrRNAの捕捉プローブの取材に応じて異なります。異なるプライマーのアニーリング効率が異なる分類群19によってまちまち保存領域を標的と設定します。したがって、我々はメタゲノムサンプルでプライマーのさまざまな組み合わせを試してみることをお勧めし、次にプーリングrRNAの製品は、カバレッジを最大化します。私たちの手順では、我々は前進2とプライマーセットの4つの組み合わせ（ 表1）を形成することができる2つのリバースプライマー、のrRNA PCR産物を組み合わせることにより、捕捉プローブを作成します。また、rRNAの二次構造を形成していきます。プローブ13との完全な長さのrRNAに比べ、小さいrRNAの断片は、サンプルrRNAに捕捉プローブのハイブリダイゼーションを容易にすることができる二次構造を形成し、低い傾向がある。ビオチン化されたプローブは、効率的にtotal RNAサンプルのrRNAにハイブリダイズし、ハイブリッドは、ストレプトアビジンコーティングビーズで捕捉することによって除去されます。手順は、rRNA（ 図4）の大部分を削除します。我々が処理した4試料では、rRNAの90から99パーセントは効果（ 表3）枯渇した。この手順は、さらに昆虫関連microbiome研究の様々な修正することができます。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、NIHの助成金1SC2GM092789-01A1でサポートされており、MSはNMSUハワードヒューズ医学研究所学部研究プログラムの研究学者だった。ビデオは監督と生産エイミーLanasaによってとNMSUのクリエイティブメディア研究所で博士フィリップ·ルイスによってコーディネートされた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
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