Utarmning av ribosomalt RNA för Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq
Summary
En ribosomalt RNA (rRNA) utarmning protokoll utvecklades för att berika budbärar-RNA (mRNA) för RNA-punkter i mygga tarmen metatranscriptome. Exempel specifika rRNA sonder, som används för att avlägsna rRNA via subtraktion, skapades från mygga och dess mikrober gut. Utförande av protokollet kan resultera i avlägsnande av ungefär 90-99% av rRNA.
Abstract
Mygga tarmen rymmer dynamiska mikrobiella samhällen i olika stadier av insektens livscykel. Karakterisering av den genetiska kapacitet och funktionalitet i tarmen samhället kommer att ge inblick i effekterna av tarmfloran på mygga livet egenskaper. Metagenomic RNA-Seq har blivit ett viktigt verktyg för att analysera transcriptomes från olika mikrober som finns i en mikrobiell gemenskap. Budbärar-RNA innefattar vanligen endast 1-3% av totalt RNA, medan rRNA utgör cirka 90%. Det är en utmaning att berika budbärar-RNA från en metagenomic mikrobiell RNA-prov eftersom de flesta prokaryota mRNA saknar stabila poly (A) svans. Detta förhindrar oligo-d (T) isolering medierad mRNA. Här beskriver vi ett protokoll som utnyttjar prov härlett rRNA fånga prober för att avlägsna rRNA från en metagenomic total RNA-prov. Till att börja med är både mygga och mikrobiella små och stora subenhet fragment rRNA amplifieras från en metagenomic gemenskap DNA-prov. Därefter kommunikapens specifika biotinylerade antisens ribosomalt RNA-prober syntetiseras in vitro med användning av T7 RNA-polymeras. De biotinylerade rRNA prober hybridiserades till totalt RNA. Hybriderna fångas av streptavidin-belagda pärlor och avlägsnas från totalt RNA. Detta subtraktion-baserat protokoll avlägsnar effektivt både mygg och mikrobiell rRNA från hela RNA-prov. MRNA berikade provet bearbetas vidare för RNA förstärkning och RNA-sekvens.
Introduction
Nästa generations sekvensering teknik har kraftigt framåt metagenomik studie genom att bedöma Artsammansättning och genetisk funktionalitet i en mikrobiell samling. RNA-sekvensering (RNA-Seq) 1 kan kringgå kultur-baserade metoder för att undersöka mikrobiella metatranscriptomes i olika sammanhang 2-5. Ett stort hinder för mikrobiell RNA-seq är svårigheten att berika mRNA, som prokaryota mRNA inte stabilt polyadenyleras. Därför är oligo-d (T)-medierad budbärare anrikning inte tillämplig. Avlägsnande av riklig rRNA är ett alternativt tillvägagångssätt för att berika mRNA. Kommersiella rRNA utarmning kit, såsom Microexpress Bakteriell mRNA Anrikning sats (Ambion), RiboMinus Transkriptomanalys Isolation Kit (Bakterier) (Life Technologies), och mRNA-ONLY Prokaryot mRNA Isolation Kit (Epicentre) som företrädesvis bryter ned rRNA med ett exonukleas, har använts för avlägsnande rRNA 6-8. Men den infångningsprober i Microexpresseller RiboMinus är bra för att ta bort kända rRNA från typiska grampositiva och gramnegativa bakterier (se tillverkarens specifikationer), men mindre kompatibel med rRNA från okända mikrober. Följaktligen kan avlägsnandet vara mindre effektiva för metagenomic prover 8-10. Dessutom var mRNA överflöd trohet ifrågasättas när exonukleasbehandling tillämpades 11. Sammantaget var subtraktion-baserade rRNA utarmning mindre partisk och mer effektiva i mRNA-anrikning i metagenomic inställningar 10-13.
Mygga tarmen rymmer en dynamisk mikrobiell gemenskap 14. Vi är intresserade av att karakterisera funktionen av mygga tarmen microbiome med RNA-Seq. I en RNA-prov isolerat från mygga inälvor, både mygga och mikrobiella RNA är närvarande. Här beskriver vi ett modifierat protokoll som ska användas samhället specifika rRNA sonder att effektivt bryter mygga och mikrobiell rRNA genom subtraktiv hybridisering. Den resulterande mRNAberikade prover är lämpliga för RNA-sekvens. Den totala arbetsflödet visas i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
En komplex mikrobiella bosatt i mygga tarmen ekosystem 14,16,17. Metatranscriptomic sekvensering (RNA-seq) kan avslöja kontextberoende funktionell information genom att fråga hela mikrobiella transkriptom 4,18. Tekniskt är oligo-d (T)-medierad anrikning av prokaryot mRNA inte tillämplig på grund av frånvaron av stabila poly (A) svansar budbärarna. Alternativt har rRNA utarmning använts för mRNA-anrikning. Här utvecklade vi en subtraktion-baserat protokoll för att tömma rRNA med rRNA son…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH bidrag 1SC2GM092789-01A1, och MS var en forskaren i NMSU Howard Hughes Medical Institution Grundutbildning forskningsprogram. Videoen riktades och producerad av Amy Lanasa och samordnas av Dr Philip Lewis med Creative Media Institute i NMSU.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
