Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Drosophila Vuxen Olfactory Shock Learning

doi: 10.3791/50107 Published: August 7, 2014

Summary

Metoden att mäta vuxna Drosophila associativa minne beskrivs. Analysen är baserad på förmågan hos flugan att associera en doft presenteras med en negativ förstärkare (elektriska stötar) för att sedan välja den här informationen vid ett senare tillfälle, vilket gör att minnet som ska mätas.

Abstract

Drosophila har använts i klassiska experiment konditione i över 40 år, vilket avsevärt underlättar förståelsen av minnet, inklusive att klarlägga de molekylära mekanismer som är involverade i kognitiva sjukdomar 1-7. Inlärning och minne kan analyseras i larver för att studera effekten av nervsystemets gener 8-10 och i flugor för att mäta bidrag av vuxna plasticitet gener 1-7. Vidare den korta livslängden på Drosophila underlättar analys av gener som förmedlar åldersrelaterad minnesförsämring 5,11-13. Tillgången på många inducerbara promotorer som delar Drosophila nervsystemet gör det möjligt att bestämma när och var en gen av intresse krävs för normal minne samt förmedling av olika aspekter av förstärkningssignalen 3,4,14,16.

Studera minne hos vuxna Drosophila möjliggör en detaljerad analys avbeteende och kretsar inblandade och en mätning av långtidsminnet 15 -17. Längden av den vuxna scenen rymmer mer långsiktiga genetiska, beteende, kost och farmakologiska manipulationer av minne, förutom att bestämma effekten av åldrande och neurodegenerativa sjukdomar på minnet 3-6,11-13,15-21.

Klassisk beting induceras genom samtidig presentation av en neutral lukt cue (betingad stimulus, CS +) och en förstärkning stimulans, t ex., Elektriska stötar eller sackaros, (obetingat stimulus, USA), som blir förknippade med varandra genom att djuret 1,16. En andra rade stimulus (CS -) därefter presenteras utan USA. Under testfasen, är Drosophila samtidigt presenteras med CS + och CS lukter. Efter Drosophila tillhandahålls tid att välja mellan de lukter, är fördelningen av djuren registreras. Detta förfarande aldalar associativa aversiv eller appetitive konditionering som på ett tillförlitligt sätt utan fördomar införts av medfödda preferens för någon av rade stimuli. Olika kontrollexperiment utförs också för att testa om alla genotyper svarar normalt på lukt och förstärkning ensam.

Introduction

Den metod som presenteras här är det som beskrivs av Tully och Quinn med några små ändringar 1. Experimentet utförs i två faser: flugorna är utbildade i den första fasen, och utbildade flugor testas i den andra fasen. Under utbildningen är en grupp av flugor samtidigt utsätts för lukt 1 (CS +) och en elektrisk stöt (US) i en tränings rör. Flugorna får då lukt 2 (CS -) utan en elektrisk stöt. Denna enda parning av en viss doft med en chock kallas 1-cykelutbildning, och lukter som oftast används är 4-metylcyklohexanol (MCH) och 3-oktanol (oktober).

En cykelutbildning leder till bildandet av en labil fas minne som kan upptäckas i upp till 7 timmar; dock minnet vanligtvis testas genast för att bestämma vad som är benämnt inlärning, förvärv eller 2 min minne. Minne mätt vid 30 min eller 1 timme kallas korttidsminnet, medan3 timmar minne kallas halvtidsminne. Exponeringen av flugor för repetitiva träningscykler med mellanrum mellan utbildningscykler (fördelade utbildning) leder till en konsoliderad form av långtidsminnet som är CREB transkription beroende och varar upp till en vecka. Träning utan luckor (hopade utbildning) leder till bildandet av anestesi-resistent minne (ARM), vilket liknar långtidsminnet, mäts typiskt 24 timmar efter 5 cykler av utbildning 7,13,15-17,20,21.

Med denna metod kan effekten av olika genmutationer på dessa olika faser av minnes bestämmas. Promotorn drivna uttryck av lätta eller temperaturkänsliga transgener för att aktivera eller blockera den neurala aktiviteten av specifika nervceller gör att man kan undersöka vilka nervceller krävs för minnes förvärv, konsolidering och hämtning 3,4,11,15,16,20, 22-24. Minne på 1 timme mäts typiskt när man studerar åldersrelaterad minnesförsämring eftersom denna form minne verkar särskilt utsatta för effekterna av åldrande 11-13. Ett komplett utbud av beteendemässiga och genetiska kontroller genomförs med minnesexperiment, till exempel för att avgöra om ett prestations fel är på grund av en central minnes defekt eller en perifer sensorisk defekt som hindrar flugan från att känna av chocken eller lukt cue 5 -7, 1 7, 25,26.

Protocol

1. Fly Framställning

  1. Utparning alla mutanter, Gal4 / UAS och andra linjer med en vildtyp stam, såsom CSw-, minst sex generationer före beteendeexperiment för att kontrollera för genetisk bakgrund 26.
  2. Odla flugor på en standard majsmjöl, jäst och melass kost under 00:12 h ljus-mörker-cykel vid 25 ° C om inte särskilda manipulationer kräver en annan temperatur.
    1. För att bestämma effekten av transgenuttryck: Använd 18 ° C för att förhindra uttryck av transgener i Gal4 GAL80 ts (TARGET) genom utveckling och sedan flytta flugor till en 30 ° C inkubator 1-2 dagar innan beteendeexperiment. Genomför experimentet vid 30 ° C för att bestämma effekterna av transgenuttryck 3,4,6,7,14.
    2. För experiment som använder värmeaktiverade TRPA1 kanaler för att stimulera nervceller: Höj flugorna vid 23 ° C, vilket är en temperatur kändatt upprätthålla en inaktiv kanal, och sedan övergå till ett beteende rum vid 30 ° C för att aktivera TRPA1 uttrycka nervceller.
    3. För experiment med Shibire temperaturkänslig för att blockera synaptiska utgång 11, 14,24: Bakre flugorna vid 18 ° C och utföra tester vid 30 ° C.
  3. Samla flugorna 1-2 dagar före experimentet och räkna dem i grupper om cirka 25 under lätt CO 2 anestesi. Förvara flugorna åtminstone O / N i livsmedels flaskor (utan jäst) vid 25 ° C (om inte särskilda manipulationer krävs en annan temperatur) och 70% relativ fuktighet på ett miljömässigt kontrollerat rum med 00:12 timmar ljus: mörker tills tiden av experimentet.
    OBS: Denna lagring gör flugorna att acklimatisera till vidareutbildning test i miljö kontrollerade rummet, som hade de optimala förhållandena för Drosophila lärande och, viktigare, tar bort alla dagliga envimässiga variationer som kan ha påverkat beteende fenotypen.

2 Förberedelser Innan Experiment

  1. Utför experimenten i en skräddarsydd Perspex T-labyrint (Figur 1).
  2. Kontrollera regelbundet rörkoppling för att säkerställa att en lufttät tätning erhålls under experimentet. Ändra vid behov O-ringarna som tätar insidan facken i T-labyrinten.
  3. Placera skräddarsydda koppargaller innanför träningsrören. Kontrollera och rengör dessa nät regelbundet och byt vid oxiderad. Fäst koppargaller till ledningar via krokodilklämmor som går till en switch-box ansluten till en elektrisk stimulator. Använd en voltmeter för att se till att apparaten ger önskat chock.
  4. G-klämmor för att hålla labyrinten tätt för att undvika luftläckage.
  5. Fäst T-labyrinten för att slangen som går till en luftpump, för att tillåta lukter som kan dras över flugor och därefter avlägsnas från T-labyrinten. Bibehålla milda luftflöde vid ~ 2 L / min

3. Lukt Utspädningar

  1. Använd två olika lukter vid koncentrationer så att flugorna visar en lika stor preferens för båda lukter. Använd 4-metylcyklohexanol (1:67) och 3-oktanol (1: 100) utspädd i mineralolja 7,13.
    Obs: Noggrant bestämma dessa koncentrationer, som varierar för olika laboratorium. Exempelvis andra använder 01:10 för båda lukter 24. Andra vanligen använda lukter innefattar etylacetat och iso-amylacetat.
  2. Pipettera 30 ìl av utspädda lukten i en skräddarsydd lukt cup placeras i en luktblocket täckt av ett plaströr med en perforerad topp som gör att luft dras över lukten i koppen och exponerar därmed flugorna till en lukt plym.

4. Utbildning Protocol (figurerna 1 och 2)

  1. För vuxna lukt chock conditioning, utföra alla experiment under ett svagt rött ljus (dvs., Röd LED), vilket gör det möjligt för forskare att se men förhindrar fly från att se, så att flugorna att koncentrera sig på lukt i motsats till visuella ingångar.
  2. Introducera flugorna i träningsröret och fäst sedan till T-labyrinten och tillåta dem att anpassa sig till röret och luftflöde för 90 sek.
  3. Presentera den första lukt (4-metylcyklohexanol, MCH) med en 60-V-chock (som består av tolv 1,25 sek pulser med 3,75 sek mellan pulsintervall) under sammanlagt minst 60 sek.
  4. Följ chocken med en 30 sek vila utan en lukt eller stötar.
  5. Presentera den andra lukt (3-oktanol, oktober) för 60 sekunder utan en chock.
  6. Följ chocken med en 30 sek vila utan en lukt eller stötar.
  7. Flytta flugorna från träningskammaren in i centrala avdelning T-labyrinten genom att vrida T-labyrinten på sidan och försiktigt banka ned i T-labyrinten på ett mjukt underlag, t.ex. en gammal musmatta. Behåll flugorna i den centrala avdelningen för 90 sek.
  8. Montera val rör i boTTom av anordningen för att bilda den T-labyrinten.
  9. För att mäta lärande, flytta flugorna till valet punkten för T-labyrinten, där de samtidigt utsatta för både lukt och gå mot en. Genomför en testperiod för 120 sek.
  10. Trap flugorna i valet rören genom att dra den centrala avdelningen upp därigenom blockera ändarna av val rören. Samla flugorna i varje arm av T-labyrinten och i den centrala avdelningen i livsmedels ampuller och räknas.
  11. För att mäta minne, samla flugorna efter träning (4.6) och överför dem från T-labyrinten till livsmedelsflaskor utan jäst. Store flyger i mörker vid 25 ° C och 70% luftfuktighet för den återstående tid som är nödvändig för att fastställa minnesfasen av intresse (se inledningen). Återinföra flugorna till T-labyrinten som i steg 4.7.
  12. För långtidsminnet, använd en specialbyggd labyrint som tillåter flera partier av flugor som skall utbildas samtidigt. Administrera fem cykler av träning med en 15 min mellan cykelintervall (spaced) eller utan en intercykelintervall (hopade). Behåll flugorna vid 18 ° C och 70% luftfuktighet i mörker tills testning. Före testning flytta flugorna till 25 ° C och tillåta dem att acklimatisera under åtminstone en timme. Bedöm långtidsminnet 24 h efter träning.
  13. Efter de beteendeexperiment, rengör lukt koppar med varmt vatten och luktfri rengöringsmedel. Efter torkning, belägga koppar med 10 pl Sigmacote. Torka Sigmacote genom upphettning i en mikrovågsugn. Ibland rengör T-labyrinten plexiglas rör och luktblock med varmt vatten och luktfritt rengöringsmedel.

5. Beräkning av Performance Index: Ett mått på Flies "Memory

  1. Beräkna Performance Index (PI) för varje tillstånd som antalet flugor undviker chock parade lukt (CS -) minus antalet flugor som väljer chock parade lukt (CS +) dividerat med det totala antalet flugor (CS - + CS +) 1.
    Performance index (PI) = (# CS - flugor - # CS + flyger) / (# Totalt flugor)
  2. Beräkna den slutliga PI av experimentet genom medelvärdes PI av experimentet i vilket MCH var det stöt parade lukt och en i vilken oktober var det stöt parade lukt. Detta tar bort någon bias av flugorna har en högre preferens för någon lukt.

6. sensorimotor Kontroller

  1. Utför lukt synskärpa genom införandet av ~ 40-50 flugor i T-labyrinten 6,7,17.
  2. Efter 90 sekunder, flytta flugorna till valet punkten, och låta dem 2 min att välja mellan rena lukt och luft.
  3. Samla och räkna flugorna. Beräkna undvikande procentsats genom att dividera det totala antalet flugor som valde lukten av dem som deltog i testet.
  4. För stöt reaktivitet 6,7,17, införa flugorna in i chockkammaren.
  5. Efter 90 sek vila, administrera en 60-V DC elektriska stötar, som flugorna kan fly till en liknanderör utan en chock.
  6. Låt 2 min för flugorna att välja; samla in och räkna flugorna. Beräkna stötundvikande procentsats genom att dividera antalet flugor som undvikits chocken genom att fly stötvågsröret med det totala antalet flugor i experimentet. Inkludera flugorna som finns kvar i den centrala kammaren i det totala av dem som undkom elstötar.

Representative Results

Den prestandaindex (PI) tjänar som mått på minnet. Tabell 1 visar en representativ beräkning av PI.

MCH parat med chock 3-oktober parat med chock
Flugor undviker MCH (i oktober rör) = 80
Flugor föredrar MCH (i MCH rör) = 20
PI 1 - (80-20) / 80 + 20)
= 0,6
Flugor undviker oktober (i MCH rör) = 75
Flugor föredrar oktober (i oktober rör) = 25
PI 2 = (75-25) / (75 + 25)
= 0,5
PI av experimentet = (0,6 + 0,5) /2=0.55

Tabell 1 En representativ beräkning av prestandaindex med hjälp av illustrativa data. Prestandaindex för olika experiment kan jämföras för att belysa minneseffekter. När en sådanjämförelse visas i figur 3, som innehåller resultaten från en serie experiment utfördes med Canton S vildtyp vuxna flugor (WT) och dunce learning mutant vuxna flugor 1. Medelvärdet av 10 PI är försedd med Felstaplar representerar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Dessa resultat visar att dumhuvud flugor visar en minskning i att lära jämfört med vildtypen.

Figur 1
Figur 1 Den vuxna försöksuppställningen. Flugorna utbildas och testas i en T labyrint. Utbildningen innebär att presentera en lukt A med elektrisk stöt följt av en andra lukt B utan elektrisk stöt. Efter en viloperiod i mitten kammaren flugorna presenteras med både lukt samtidigt. Flugorna är fångadei de två rören och samlas och räknades för att erhålla inlärning / minnes poäng.

Figur 2
Figur 2. vuxenutbildning protokollet. Flugorna är utbildning i två steg. Det första steget, där flugorna får en doft (CS +) paras med elstötar (US) för 60 sek. I nästa steg flugor få en andra lukt (CS) utan elektrisk stöt. Flugor får sedan vila i 90 sekunder varefter de testas för deras val mellan CS + och CS.

Figur 3
Figur 3 En representativ graf som visar dumhuvud och vildtyp lärande i vuxen Drosophila. dumhuvud flugor testades efter en session av träning. Dumhuvud flugor visar en minskning av lärande jämfört med WT (n = 10).

Discussion

Drosophila vuxna luktchockanalys lärande presenteras här möjliggör analys av de molekylära mekanismerna bakom olika faser av minnet, inklusive långtidsminnet 15-17. Förutom bestämning av effekten av dygnsrytmen 18, sover 19, kost 20,21, åldrande 11-13, neurodegenerativ sjukdom 5 och läkemedelsbehandlingar 5,6,19 på minnet.

Många mäktiga metoder har nyligen utvecklats för funktionell avbildning av de nervbanor som förmedlar luktminne i flugor 3,4,7,11,16,27. Dessa optogenetic tekniker använda den stora repertoar av olika promotorer som finns i Drosophila 14,16. Dessa promotorer används för att uttrycka genetiskt kodade kalcium och cAMP reportrar i minnes nervceller 16,27 för att studera effekten av specifika genmutationer på minne spår.

The användning av villkor promotorer och mutationer hos vuxna tillåter studiet av efterutvecklings rollen av en gen produkt i minnet 3,4,6,7,13,14. Imaging och beteende metoder kan kombineras med lätta och värmeaktiverade kanaler för att stimulera eller hämma olika nervceller i minneskretsen 11,14,16,22-24 att ytterligare belysa deras funktion. Dessutom svamp kropp minne nervceller är tillgängliga för hel-cell patch clamp inspelningar 28 samt matematiska och beräkningsmetoder som används för att modellera Drosophila luktminne 29.

Dessa experimentella framsteg, i kombination med olika former av associativa minnesprotokoll infördes här, låta Drosophila som ska användas för att modellera molekylär- och kretsnivå förändringar i associativt minne som sker som svar på belöning, straff, motivation, missbruk, åldrande och sjukdom 5,6,11-13,16,30-31.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vi erkänner Bloomington lagercentraler för flugan stammen. Detta arbete stöddes av forskningsbidrag från BBSRC (BB / G008973 / 1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Octanol Sigma 218405
4-Methyl cyclohexanol Sigma 15309-5
Benzaldehyde Sigma 418099
Mineral oil Fluka BP2629-1
Hexyl acetate Sigma 108154
Fructose Sigma F0127
Agarose Bioline BIO-41025

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology A. 157, 263-277 (1985).
  2. Bolduc, F. V., Tully, T. Fruit flies and intellectual disability. Fly (Austin). 3, 91-104 (2009).
  3. McGuire, S. E., Deshazer, M., Davis, R. L. Thirty years of olfactory learning and memory research in Drosophila melanogaster. Prog Neurobiol. 76, 328-347 (2005).
  4. Keene, A. C., Waddell, S. Drosophila olfactory memory: single genes to complex neural circuits. Nat Rev Neurosci. 8, 341-354 (2007).
  5. Chiang, H. C., Wang, L., Xie, Z., Yau, A., Zhong, Y. PI3 kinase signaling is involved in Abeta-induced memory loss in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7060-7065 (2010).
  6. Kanellopoulos, A. K., Semelidou, O., Kotini, A. G., Anezaki, M., Skoulakis, E. M. C. Learning and memory deficits consequent to reduction of the Fragile X mental retardation protein result from metabotropic glutamate-mediated inhibition of cAMP signalling in Drosophila. J Neurosci. 32, 13111-13124 (2012).
  7. Malik, B. R., Gillespie, J. M., Hodge, J. J. L. CASK and CaMKII function in the mushroom body a’/ß’ neurons during Drosophila memory formation. Front Neural Circuits. 7, 52 (2013).
  8. Gerber, B., Stocker, R. F. The Drosophila larva as a model for studying chemosensation and chemosensory learning: a review. Chem Senses. 32, 65-89 (2007).
  9. Gillespie, J. M., Hodge, J. J. L. CASK regulates CaMKII autophosphorylation in control of synaptic growth and appetitive learning. Front Molecular Neuroscience. 6, 27 (2013).
  10. Apostolopoulou, A. A., Widmann, A., Rohwedder, A., Pfitzenmaier, J. E., Thum, A. S. Appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. J Vis Exp. (72), e4334 (2013).
  11. Tonoki, A., Davis, R. L. Aging impairs intermediate-term behavioral memory by disrupting the dorsal paired medial neuron memory trace. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 6319-6324 (2012).
  12. Yamazaki, D., Horiuchi, J., Nagano, S., Tamura, T., Saitoe, M. The Drosophila DCO mutation suppresses age-related memory impairment without affecting lifespan. Nat Neurosci. 10, 478-484 (2007).
  13. Cavaliere, S., Malik, B. R., Hodge, J. J. L. KCNQ channels regulate age-related memory impairment. PLoS One. 8, e62445 (2013).
  14. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  15. Isabel, G., Pascual, A., Preat, T. Exclusive consolidated memory phases in Drosophila. Science. 304, 1024-1027 (2004).
  16. Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr Biol. 23, R752-R763 (2013).
  17. Tully, T., Preat, T., Bonyton, S. C., Del Vecchio, M. Genetic dissection of consolidated memory in Drosophila. Cell. 79, 35-47 (1994).
  18. Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning and memory. 16, 19-27 (2009).
  19. Le Glou, E., Seugnet, L., Shaw, P. J., Preat, T., Gouguel, V. Circadian modulation of consolidated memory retrieval following sleep deprivation in Drosophila. Sleep. 35, (10), 1377-1384 (2012).
  20. Placais, P. Y., Preat, T. To favour survival under food shortage, the brain disables costly memory. Science. 339, 440-442 (2012).
  21. Hirano, Y., et al. Fasting launches CRTC to faciltate long-term memory formation in Drosophila. Science. 339, 443-446 (2012).
  22. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16, 1741-1747 (2006).
  23. Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139, 405-415 (2009).
  24. Aso, Y., et al. Three dopamine pathways induce aversive odor memories with different stability. PLoS Genetics. 8, e1002768 (2012).
  25. Connolly, J. B., Tully, T. Drosophila: a Practical Approach. Roberts, D. B. Oxford University Press. 265-319 (1998).
  26. Connolly, J. B., et al. Associative learning disrupted by impaired Gs signaling in Drosophila mushroom bodies. Science. 274, 2104-2107 (1996).
  27. Davis, R. L. Traces of Drosophila memory. Neuron. 70, 8-19 (2011).
  28. Gu, H., O'Dowd, D. K. Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila kenyon cells in situ. J Neurosci. 26, 265-272 (2006).
  29. Young, J. M., Wessnitzer, J., Armstrong, J. D., Webb, B. Elemental and non-elemental olfactory learning in Drosophila. Neurobiol Learn Mem. 96, 339-353 (2011).
  30. Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. .A. Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
  31. Waddell, S. Dopamine reveals neural circuit mechanisms of fly memory. Trends Neurosci. 33, 457-464 (2010).
<em>Drosophila</em> Vuxen Olfactory Shock Learning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malik, B. R., Hodge, J. J. L. Drosophila Adult Olfactory Shock Learning. J. Vis. Exp. (90), e50107, doi:10.3791/50107 (2014).More

Malik, B. R., Hodge, J. J. L. Drosophila Adult Olfactory Shock Learning. J. Vis. Exp. (90), e50107, doi:10.3791/50107 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter