Summary
מודל חבורה של פגיעה בחוט השדרה חמורה מתואר. צעדים טרום ניתוחי, אופרטיביים ולאחר הניתוח מפורטים מתוארים להשיג מודל עקבי.
Abstract
פוטנציאל translational של טיפולים חדשניים יש לחקור בפגיעה בעמוד השדרה חוט חמור (SCI) מודלים contusion. המתודולוגיה מפורטת מתוארת להשיג מודל של SCI החמור עקבי. שימוש במסגרת stereotactic וimpactor מבוקר מחשב מאפשרת יצירה של פגיעה לשחזור. היפותרמיה ודלקת בדרכי שתן מציבים אתגרים משמעותיים בתקופה שלאחר הניתוח. ניטור קפדני של בעלי חיים עם הקלטה במשקל מדי יום, ומאפשר ביטוי שלפוחית השתן לגילוי מוקדם של סיבוכים שלאחר ניתוח. התוצאות הפונקציונליות של חבלת מודל זה הן שווי ערך לדגמי חיתוך רוחב. יכול להיות מנוצל מודל החבלה כדי להעריך את היעילות של שני neuroprotective וneuroregenerative גישות.
Introduction
בחירה של מודל פציעה המתאים היא קריטית להערכה קלינית של טיפולים חדשניים לפגיעה בחוט השדרה (SCI). 1,2,13 בסקר שנערך לאחרונה של רופאים ומדענים בתחום מודל חבלת Neurotrauma, בניגוד לדגמי hemisection או חיתוך רוחב מלא , היה מקובל להיות רלוונטי מבחינה קלינית. 8 דעה זו מבוססת על התצפית כי רוב הפגיעה בחוט השדרה בבני האדם הוא contusive בטבע. 10 הביולוגיה של חבורה מופיעה גם להיות שונים ממודלי hemisection או חיתוך רוחב. Iseda 11, et אל. לעומת ההשפעה של זריקת intraspinal chondroitinase ABC על neuroregeneration בנפרד בhemisection ודגמי contusion. 4 התחדשות axonal נצפתה בגשר העצבי בhemisection אבל הקבוצה לא SCI החבלה. Hemisection או מודלים חיתוך רוחב מלאים גם ליצור תנאים ידועים להתקיים רק בחלק קטן מאוד של CLנסיבות inical. לדוגמה, מספר חוקרים מועסקים התערבויות מבוססות פיגום להשתלה בחלל הנגע לאחר hemisection או חיתוך רוחב מלא כדי לקדם התחדשות. 6 גישה זו הופכת להיות לא רלוונטית מבחינה קלינית משום יצירת חלל בתוך חוט השדרה פגוע אינן מעשי ובטח לא מוסרית.
השתנות בהחלמה תפקודית עדיין מהווים אתגר מרכזי עבור דגמי contusion. 5,12 השתנות זו ניתן למזער על ידי השימוש בimpactor וייצוב של עמוד השדרה מבוקרת מחשב לפני ההשפעה למסירת כוח אחידה על פני נפח חוט השדרה ובעיקר את המסלולים המוטוריים הממוקמים ventrally . יש לציין כי גמישות ותרומת טחונות מהאקסונים ששרדו הוא המנגנון העיקרי של התאוששות לאחר פגיעה בחוט השדרה. 1 וריאציות לכן אפילו קלות בטכניקת בלבול עשויות להניב תוצאות שונות באופן משמעותי. לשם כך פיתחנומודל של פגיעה בחוט השדרה חמורה אשר מניבה נפח חבלה עקבית והתאוששות תפקודית דומה עם דגמי חיתוך רוחב. מודל זה עשוי להיות מנוצל לחקירה גם neuroprotection ואסטרטגיות neuroregeneration כהוכחת רעיון ליעילות הטיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה לפני הפגיעה בחוט השדרה
את מכשירי הניתוח הנדרשים להליך זה הם אזמל, טנדרים עם ובלי שיניים, hemostats, retractors שמירה עצמי, rongeurs קצה קנס, נהג מחט, תפרים נספגים, וapplicators קליפ עור. אספקה אחר כירורגיות הנדרשות הן וילונות כירורגיות, סדינים סטריליים לשדה ניתוח, ספוגים גזה, צמר גפן applicators-קצה, ורדיד מתכתי. חיטוי מכשירי הניתוח והציוד שקדמו לניתוח. השתמש בסט הבודד של מכשירים וציוד לבעלי חיים אחד. נקה את האזור ומכשירים (impactor, מקור אור, מסגרת stereotactic, מעקרי חרוז זכוכית, וכריות חימום) עם מגבוני אלכוהול כירורגית.
פתח את וילונות הכירורגיות ולהשתמש בכפפות סטריליות לעטוף את שדה ניתוח הימנעות זיהום בזהירות. פתח את המכשירים הבודדים sterilely ולמקם בזהירות אלה בתחום כירורגית. לכסות את הכפתורים וידיות של המנגנון דואר סביר צורך במהלך ההליך עם הרדיד המתכתי סטרילי. החלף על מעקר חרוז הזכוכית כדי להיות מוכן לשימוש במהלך ההליך.
2. הכנת בעלי חיים
להביא לכמה שעות אזור המעבדה בחולדות לפני ההליך בפועל. לנהל משככי כאבי שעה לפחות אחד לפני ההליך הצפוי (בדרך כלל 1.5 מיליליטר buprinorphine של 0.006 מ"ג / מ"ל תת עורי). לנהל אנטיביוטיקה לפני הניתוח (בדרך כלל Baytril 4 מ"ג / ק"ג תת עורי). הרדימי את החולדות באמצעות 90 מ"ג / ק"ג של קטמין ולחכות עד שאין תגובת הבוהן קמצוץ. למשש את תהליך spinous הבולט ביותר בעמוד השדרה החזי. רמה זו בדרך כלל מתכתבת עם T10 תהליך spinous. לסמן את המיקום של רמה נועדה ביחס לT10. במעבדה שלנו אנו מבצעים פציעת T10. הסיפור הבא מתאר את הטכניקה של T10 SCI. שבי מלבן ס"מ X 6 3 longitudinally ומרוכז ברמת T10. לנקות את העור שלוש פעמים wiתמיסת פולידין ה. החל סיכה עיניים בכל עין. העבר את העכבר בעמדה נוחה לשדה ניתוח הימנעות זיהום בזהירות. הכנס בדיקה טמפרטורה רקטלית לנטר את טמפרטורת הליבה ולהתאים את החימום בהתאם כדי לשמור על טמפרטורת בעלי חיים קרובים לנורמלי (~ 37.5 מעלות צלזיוס) ככל האפשר. לכסות את העכברוש עם וילון כירורגית עם חלון מעל האתר כירורגית.
3. הליך כירורגי
להתחיל עם חתך משוער 4 ס"מ באמצעות # 10 להב מרוכז על סימן T10. להמשיך לנתח fascia ושכבות שרירים סבלנות הרחק ממילון T9-T11 התהליכים ורבדי spinous. הנח retractors לחזור משם שריר וfascia מהעצם. תוך ייצוב תהליך spinous של מילון T9 בחדות לחלק את רצועת interspinous בין T9 ו T10 באמצעות מספריים עדינים. כמו כן לייצב את תהליך spinous T10 ולחלק את רצועת interspinous בין T10-T11. השתמש בלולאה להגדלה משליםte חלוקת רצועות לאורך כל דרך flavum ligamentum (איור 1). השק thecal הוא ברור מפעם אחת flavum ligamentum מנותק. השתמש rongeurs קצה קנס לבצע בזהירות laminectomy חתיכת ארוחת ילטרלי בT10. זהירות רבה היא נלקחה כדי למנוע לחץ כלפי מטה על השק thecal ופציעה שלא במתכוון מקצות rongeur. Lamina ותהליך spinous של T10 נמחק לחלוטין.
הזז את בעלי החיים למקומו על פלטפורמת ייצוב. השתמש במהדק ייצוב כדי לשתק את עמוד השדרה על ידי כיווץ ההיבטים לרוחב של גוף השדרה T11 ואחריו את ההיבטים לרוחב של גוף T9 השדרה. היזהר שלא לדחוס את העכברוש לתוך הפלטפורמה עם מהדק הייצוב כמו זה יגביל מקום לתנועות נשימה ולהוסיף מתח לא רצוי בבעלי החיים. לאחר הבטחת את הגדרות עמוד השדרה על impactor מבוקרת מחשב מסומנות. אנחנו בדרך כלל להשתמש בטיפ impactor של 3.0 מ"מ בSPeed של 4 ס"מ / s עם עומק של 2 מ"מ וזמן להתעכב של 0.3 שניות. להאריך את קצה impactor ולהוריד אותו עד שהוא רק נוגע במשטח הכבל. לחזור בו ולהוריד את קצה מכשיר מ"מ 2 לכיוון פני חוט השדרה. לשחרר את הבוכנה ב4 ס"מ / שני כדי לגרום לפגיעה בחוט השדרה חבלה חמורה. להשיג hemostasis רק באמצעות לחץ מספיק כדי לשמור על מוליך כותנה שהקצה במקום, נזהר שלא ליצור כל לחץ מיותר על הכבל. שריר התפר ושכבות fascia עם דמות 8 תפר נזהר שלא למשוך חזק מדי באמצעות תפרים נספגים. סגור את העור עם מינימום של 2 סיכות קטנות; עד 4 או 5 סיכות ניתן להשתמש אם החלקים של החתך יישארו פתוחים לאחר 2 או 3 הסיכות הראשונות.
3. טיפול שלאחר ההליך
חולדות מקום בסביבה חמה של כ 33-35 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות שלאחר הניתוח. זה כרוך בחלל כלוב מחומם חממה (בזמן שהם לא מודעים) וברגע שהם מתחילים לזוז. ברגע שחולדות הן באופן מלא AWהאייק, לנהל 5 מ"ל של תמיסת מלח, 1.5 מ"ל (0.006 מ"ג / מ"ל) של buprinorphine, ו0.1 מ"ל של Baytril כל תת עורי. המשך עם buprinorphine תת עורי פעמיים ביום במשך 24-48 שעות הראשונה וBaytril פעם ביום למשך 7 ימים. שלפוחיות צריכים לבוא לידי ביטוי שלוש פעמים ביום באופן ידני עד לחזרה של תפקוד שלפוחית השתן (<2 מ"ל של שתן בביטוי מוקדם בבוקר במשך 3 ימים רצופים). גם בעלי חיים צריכים להיבדק בתקופה זו לזיהום (דם בשתן, צבע לבנבן, או ריח רע), ירידה בבעיות עם ריפוי פצע פעילות גופנית או. נוכחות של זיהום יש הגיבה עם מינון מוגבר (או חניכה מחדש) של אנטיביוטיקה בהתייעצות עם וטרינרים מקומיים. שוקל חולדות יומיות המתחילות ביום שלאחר ניתוח על מנת להעריך ההחלמה שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נפח נגע
יש לנו להשיג כרכי נגע גדולים ועקביים על ידי ביצוע הטכניקה שתוארה לעיל. באמצעות צביעת נפח נגע ממוצע של 2.04 מ"מ 3 (95% CI = 1.9-2.18) (n = 5 חיות) הושג מהר Luxol כחול. איור 2 מראה מתכוון נפח נגע עם כתמים באמצעות נציג כחול מהר Luxol דרך מוקד הנגע.
עשרות פונקציונליים
את תוצאות ההתנהגות כפי שהיא נמדדת על ידי הסולם באסו, ביטי, Bresnahan (BBB) מוצגות באיור 3. בגיל 12 שבועות החולדות בקבוצת הביקורת השיגו ציון ממוצע של 2.2 BBB ± 1.1 (n = 10 בעלי חיים).
פרמטרים אחרים
בהתבסס על הניסיון שלנו העדכנית ביותר עם 32 ניתוחים בבעלי חיים את שיעור ההישרדות של טכניקה זו הוא 93.4%. כל ההרוגים היו קשורים לדלקת בדרכי שתן מתמשכת (דלקת בדרכי שתן) ואחרי הקרבת בעלי חיים כדי למנוע כאב וסבל מוגזם. לאחר שסיים את הקורס של אנטיביוטיקה למשך 7 ימים 16.7% חיות פיתחה דלקת בדרכי שתן. מספר הממוצע של ימים לצורך זיהוי של דלקת בדרכי שתן לאחר הניתוח היה 14.6 ± 7.6 ימים. מעניין לציין את בעלי החיים שהושגו שליטה בשלפוחית השתן על 13 ימים לאחר פציעת ממוצע (13.33 ± 3.6 ימים). חולדות שפיתחו דלקת בדרכי שתן לקחו זמן רב יותר כדי להשיג שליטה בשלפוחית השתן, בהשוואה לחולדות ללא דלקת בדרכי שתן (שליטה על שלפוחית השתן בחולדות עם דלקת בדרכי שתן - 16 ימי ± 1 לעומת 12.8 ± 3.7 ימים לשליטה על שלפוחית השתן בחולדות ללא דלקת בדרכי שתן, p = 0.03). בכל הדור שהושג שליטה על שלפוחית השתן בתוך 14 ימים שלאחר מכן לא התגלו דלקת בדרכי שתן. כפי שניתן לראות באיור 4, היה רווח ראשוני במשקל לאחר SCI סביר מאגירת נוזלים. משקל ירד ולאחר מכן התייצב לרמה נמוכה יותר (כ 10-12% נמוכים יותר מאשר בתחילת מחקר) בכ -10 ימים.
/ Files/ftp_upload/50111/50111fig1highres.jpg "/>
איור 1. האנטומיה החוליות של עכברוש מהגישה האחורית (משמאל), הממחישה את התהליכים ורבדי spinous. עמדת ligamentum flavum (LF) מתוארת במרחב שבין הרבדים. סעיף אמצע saggital (מימין) מראה את המיקום היחסי של flavum ligamentum ורצועת interspinous ביחס לחוט השדרה.
איור 2. גרף עמודות המציגים נפח נגע (ב3 מ"מ, ציר Y) בבעלי החיים שקיבלו פגיעה בחוט השדרה חמורה (משמאל). חתך לאורך דרך נציג מוקד פציעה לאחר הצביעה כחולה מהר Luxol (מימין).
g3highres.jpg "/>
איור 3. ציון ממוצע BBB (ציר Y) של החולדות במהלך 3 חודשי מעקב (ציר X) מפגין התאוששות מינימאלית טיפוסית של SCI החמור.
איור 4. תרשים הקו מציג וריאציה במשקל יומי (בגרם, ציר Y) של חולדות על פני משך שבועות 2 (ציר X) לאחר גיוס של פגיעה בחוט השדרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טיפולים חדשניים כמה לאחרונה הראו הבטחה מוקדמת בתחום מחקר SCI. 3 הערכה זהירה של טיפולים אלה היא חיונית בדגם רלוונטי קליני של SCI כדי לבחור אסטרטגיות עם פוטנציאל translational מרבי. ערכה של דירוג פותחה לאחרונה כדי להעריך את כוחו של מחקרים פרה. 9 תכנית זו הדגישה את החשיבות של ניצול מודל חבורה של SCI החמור. כאן אנו מתארים מודל כזה של חבלה החמור עם SCI כרכי נגע עקבי ועשרות פונקציונליים דומים לאלו של דגמי חיתוך רוחב. מודל זה עשוי להיות מנוצל כמו "הוכחה של מושג 'להקים יעילות טיפול הן לneuroprotection ואסטרטגיות neuroregeneration.
הדור של המדים contusive SCI נותר מאתגר. לשחזור, זה חיוני כי פציעה להתבצע באופן אחיד ככל האפשר. הרמה ממוקדת של חוט השדרה חייבת להיות מזוהות באופן עקבי frבעלי חיים אום לבעלי החיים. הסרת העצם במהלך laminectomy צריך להיעשות בזהירות כדי לוודא שאין שברי עצמות נותרו בתעלת עמוד השדרה, אלה עלולים לגרום לפציעת דחיסה ולהציג את שינויים לא רצויים במנגנוני פציעה ופוטנציאל התאוששות. אנחנו אימצו כמה צעדים כדי להבטיח אחידות גודל כולל של impactor, ייצוב עמוד השדרה הנוקשה של חברה במסגרת עם זרועות ייצוב רכובות, תוך שימוש במהירות השפעה אחידה ועומק של impaction. חשוב שהעכברוש להיות ממוקם בנוחות כאשר המלקחיים הייצוב הם הידק לגופי החוליות. כל שינויים ביישור עמוד השדרה או מתח עודף במהלך clamping עשויים לשנות את ביומכניקה של השפעה. אנחנו השתמשנו impactor 2.5 מ"מ מאז בגודל של חוט השדרה חולדה הממוצע באזור של אינטרס שלנו הוא 2.5-3 מ"מ. קשר הזמן או להתעכב נקבע באופן אחיד על 0.3 שניות בניסויים שלנו. עם זאת בהסתכלות שלנו ודיווחים ממעבדות אחרות, למודל חמור של SCI העומק של השפעה הוא מכריע ביותרפרמטר. בניסויים שתוארו במאמר זה את ההשפעה נמסרה בעומק קבוע של 2 מ"מ. גורמים אחרים המשפיעים על אחידות כוללים הכשרת כוח אדם, ויזואליזציה ברורה של הרקמות, וקצה impactor כדי להבטיח השפעה ישירה ברקמת החוט (ולא במבנים הגרמיים).
החולדות יש לשים לב כל הזמן במהלך ההליך לסימנים חיוניים הדרושים טמפרטורה ונשימה ליבה החשוב ביותר. היפותרמיה היא הגורם המוביל לתמותה במהלך ומייד לאחר מתן הרדמה. ניטור של טמפרטורת ליבה עם בדיקה רקטלית וכריות חימום מתאימות יהיה למנוע סיבוך זה. אם הנשימה הופכת לא סדירה או בעלי החיים מפסיק את הנשימה, את ההליך יש להפסיק מייד עד שנשימה חוזרת לנקודת התחלה. כאב מוגזם או שלא במתכוון ועל מינון של כאב ותרופות הרדמה עלול גם לגרום לבעיות נשימה. החולדות צריכים להיות במעקב שלאחר ההליך בזהירות. w שלהםשמיניים יש למדוד במדויק ואובדן> 20% ממשקל בסיסי צריך להנחות חקירת צריכת מזון ומים, זיהום בדרך שתן, התמוטטות עור, ההודעה SCI-ileus, וכו 'התייעצות מוקדמת עם צוות וטרינרי להערכה וטיפול הוא קריטי במצבים כאלה. כפי שנאמר קודם לכן, חולדות שלא חזרו לשליטה בשלפוחית השתן על ידי 14 ימים יש להתחיל בחזרה על אנטיביוטיקה כדי למנוע דלקת בדרכי שתן עלול להיות קטלניות.
פגיעה בחוט השדרה יכולה להיגרם גם על ידי שיטת עקירה או שיטת כוח קבועה. 5,12 הטכניקה המתוארת במאמר זה היא שיטה שבי עקירת כוח מועבר לעומק קבוע בתוך רקמת חוט השדרה. השימוש בimpactor מבוקרת מחשב מאפשר רמת השליטה שאינה בר השגה על ידי השיטות הנפוצות האחרות של הניסוי SCI. טכניקת דחיסת קליפ אינה מאפשרת לכוח בוטה, contusive עם שחרורו מיידי, ואילו השפעת אוניברסיטת ניו יורקאו תלוי בכוח הכבידה כדי לקבוע את כוח של חבורה. טכניקות אלו למרות ששחזור, אינן מאפשרות סימולציה של מצבים בהם נתקל במהלך תאונת רכב מנוע, הגורם השכיח ביותר של SCI החריף בבני אדם. מחקרים קודמים הראו כי חומרת פציעתו קורלציה ישירה עם עומק של השפעה מהמהירות של השפעה. 7 לכן מודל זה מאפשר לSCI חמור שיש לבצע באופן שגרתי עם הפוטנציאל לשנות את החומרה באמצעות מגוון גדול יותר של שילובים של כוח ועקירה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אף גילוי פיננסי
אף גילוי מימון.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר נ 'וד"ר Banik ד מיטשל להדרכה שלהם בפיתוח של דגם זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
- Blesch, A., Tuszynski, M. H. Spinal cord injury: plasticity, regeneration and the challenge of translational drug development. Trends Neurosci. 32, 41-47 (2009).
- Dobkin, B. H. Curiosity and cure: translational research strategies for neural repair-mediated rehabilitation. Dev. Neurobiol. 67, 1133-1147 (2007).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J. Neurotrauma. 28, 1329-1333 (2011).
- Iseda, T., Okuda, T., Kane-Goldsmith, N., et al. Single, high-dose intraspinal injection of chondroitinase reduces glycosaminoglycans in injured spinal cord and promotes corticospinal axonal regrowth after hemisection but not contusion. J. Neurotrauma. 25, 334-349 (2008).
- Khan, T., Havey, R. M., Sayers, S. T., et al. Animal models of spinal cord contusion injuries. Laboratory Animal Science. 49, 161-172 (1999).
- Kim, B. G., Kang, Y. M., Phi, J. H., et al. Implantation of polymer scaffolds seeded with neural stem cells in a canine spinal cord injury model. Cytotherapy. 12, 841-845 (2010).
- Kim, J. H., Tu, T. W., Bayly, P. V., et al. Impact speed does not determine severity of spinal cord injury in mice with fixed impact displacement. Journal of Neurotrauma. 26, 1395-1404 (2009).
- Kwon, B. K., Hillyer, J., Tetzlaff, W. Translational research in spinal cord injury: a survey of opinion from the SCI community. J. Neurotrauma. 27, 21-33 (2010).
- Kwon, B. K., Okon, E. B., Tsai, E., et al. A grading system to evaluate objectively the strength of pre-clinical data of acute neuroprotective therapies for clinical translation in spinal cord injury. J. Neurotrauma. 28, 1525-1543 (2011).
- Norenberg, M. D., Smith, J., Marcillo, A. The pathology of human spinal cord injury: defining the problems. J. Neurotrauma. 21, 429-440 (2004).
- Siegenthaler, M. M., Tu, M. K., Keirstead, H. S. The extent of myelin pathology differs following contusion and transection spinal cord injury. J. Neurotrauma. 24, 1631-1646 (2007).
- Talac, R., Friedman, J. A., Moore, M. J., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25, 1505-1510 (2004).
- Tator, C. H. Review of treatment trials in human spinal cord injury: issues, difficulties, and recommendations. Neurosurgery. 59, 957-982 (2006).
