Summary
Ciddi omurilik yaralanması bir kontüzyon modeli açıklanmıştır. Ayrıntılı ameliyat öncesi, ameliyat ve ameliyat sonrası adımları tutarlı bir model elde etmek açıklanmıştır.
Abstract
Yeni tedavilerin öteleme potansiyel ciddi spinal kord yaralanması (SKY) kontüzyon modellerinde araştırılmalıdır. Ayrıntılı bir metodoloji şiddetli SCI tutarlı bir modeli elde etmek için açıklanmıştır. Bir stereotaktik çerçeve ve bilgisayar kontrollü darbe kullanımı tekrarlanabilir yaralanma oluşturulmasını sağlar. Hipotermi ve idrar yolu enfeksiyonu ameliyat sonrası dönemde önemli sorunlar oluşturmaktadır. Günlük ağırlık kayıt ve mesane ifade ile hayvanların dikkatle izlenmesi ameliyat sonrası komplikasyonların erken tanısı için izin verir. Bu kontüzyon modelin fonksiyonel sonuçlar transection modelleri eşdeğerdir. Kontüzyon modeli nöroprotektif ve nöro-rejeneratif yaklaşımlar hem de etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
Uygun yaralanması modelinde seçim omurilik yaralanması için yeni tedaviler (SCI) klinik öncesi değerlendirilmesi için çok önemlidir. Hekim ve Nörotravmaya kontüzyon modeli alanında bilim adamlarının yeni bir araştırmada 1,2,13, hemiseksiyona veya tam kesisi modellere karşı , evrensel klinik olarak kabul edilmiştir. 8 Bu görüş insanlarda omurilik yaralanması çoğunluğu doğada contusive gözlemine dayanmaktadır. 10 kontüzyon biyoloji de hemiseksiyona veya kesisi modellerden farklı gibi görünüyor. 11 İSEDA, et al. hemiseksiyona ve kontüzyon modelleri ayrı ayrı Nörorejenerasyon üzerinde intraspinal kondroitinaz ABC enjeksiyon etkisi karşılaştırıldı. 4 aksonal rejenerasyon hemiseksiyona içinde nöronal köprü gözlenen ancak kontüzyon SKY grubu değildi. Hemiseksiyona veya tam kesisi modelleri de cl sadece çok küçük bir alt var olduğu bilinen koşullar oluşturmakinical koşullar. Örneğin, bazı araştırmacılar hemiseksiyona veya yenilenmesini teşvik için tam transeksiyonu sonra lezyon boşluğunda implantasyon için iskele tabanlı müdahaleler istihdam var. 6 yaralı omurilik içinde bir boşluk yaratılması pratik ve belki etik olduğu için bu yaklaşım, klinik alakasız olur.
Fonksiyonel iyileşme değişkenlik kontüzyon modelleri için önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. 5,12 Bu değişkenlik omurilik hacmi boyunca tek güç teslimat için etkisi özellikle ön yerleşimli motor yolları önce bilgisayar kontrollü darbe ve omurga stabilizasyon kullanımı ile minimize edilebilir . Bu hayatta aksonlar plastisite ve teminat katkı omurilik yaralanması sonrası iyileşme baskın mekanizma olduğunu belirtmek gerekir. Kontüzyon tekniğinde 1 Bu nedenle bile küçük farklılıklar önemli ölçüde farklı sonuçlar verebilir. Bu amaçla biz geliştirdiktutarlı kontüzyon hacmi ve transection modelleri ile karşılaştırılabilir fonksiyonel iyileşme verir ciddi omurilik yaralanması bir modeli. Bu model tedavi etkinliği için konsept bir kanıtı olarak nöro ve Nörorejenerasyon stratejileri hem araştırmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Spinal Kord Yaralanması önce hazırlanması
Bu prosedür için gerekli cerrahi aletler, diş, hemostat, kendini istinat retraktörleri, ince uçlu rongeurs, iğne sürücü, emilebilir dikişlerle, ve cilt klip uygulayıcılar olan ve olmayan manyetikler neşter vardır. Gerekli diğer cerrahi malzemeleri cerrahi örtüler, cerrahi alan için steril levhalar, gazlı bez sünger, pamuk uçlu aplikatörler ve metalik folyo vardır. Ameliyat öncesi cerrahi aletler ve malzemeleri otoklavlayın. Bir hayvan için araç ve gereçlerin tek tek seti kullanın. Cerrahi alan ve alkol mendil ile cihazı (darbe, ışık kaynağı, stereotaktik çerçeve, cam boncuk sterilizatör ve ısıtma pedleri) temizleyin.
Cerrahi örtüler açın ve dikkatle kirlenme kaçınarak cerrahi alan asmak için steril eldiven kullanın. Steril bireysel araçları açın ve dikkatle cerrahi alanında bu yerleştirin. Th kolları ve kolları Kapake cihazı olasılıkla steril metal folyo ile işlem sırasında gerekli. Açma cam boncuk sterilizatör işlem sırasında kullanıma hazır olması.
2. Hayvanların hazırlanması
Gerçek işlem öncesi laboratuvar alanı birkaç saat için fareler getirin. Önceden tahmin işlemi (tipik olarak 0.006 mg / ml 'deri altı buprinorphine 1.5 mi) arasında, en az bir saat ağrı kesici uygulayın. Preoperatif antibiyotik (genellikle Baytril 4 mg / kg deri altı) yönetmek. 90 mg / Ketamin kg kullanarak sıçan uyutmak ve hiçbir ayak-tutam tepki kadar bekleyin. Torakal en önemli spinöz proses palpe ediniz. Bu seviye genellikle T10 spinöz proses ile gelir. T10 ile ilgili olarak amaçlanan düzeyde yerini işaretleyin. Laboratuarımızda bir T10 yaralanma gerçekleştirin. Aşağıdaki anlatı T10 SCI tekniğini açıklar. Boyuna 3 cm x 6 cm dikdörtgen Tıraş ve T10 düzeyinde merkezli. Cilt üç kez wi temizleyininci Betadine çözüm. Her göze göz yağ uygulayın. Dikkatli bir şekilde kirlenmesini önlemek cerrahi alanına rahat bir konumda sıçan aktarın. Çekirdek sıcaklığını izlemek ve normale yakın (~ 37.5 ° C) mümkün olarak hayvan sıcaklığı tutmak için buna göre ısıtma ayarlamak için bir rektal ısı probu yerleştirin. Cerrahi alan üzerinde bir pencere ile bir cerrahi örtü ile sıçan örtün.
3. Cerrahi Prosedür
T10 işareti merkezli bir 10. bıçak kullanarak yaklaşık 4 cm kesi ile başlar. Sabırla uzak T9-T11 spinöz süreçleri ve lamina gelen fasya ve kas tabakaları incelemek geçin. Kemikten kas ve fasya uzak geri çekmek için Retraktörler yerleştirin. T9 spinöz proses stabilize iken keskin ince makas kullanarak T9 ve T10 arasındaki interspinöz bağ bölün. Benzer şekilde T10 spinöz proses stabilize ve T10-T11 arasındaki interspinöz bağ bölün. Tamamlayıcı için döngü büyütme kullanınligamentum flavum (Şekil 1) ile te bağ bölünmesi tüm yol. Ligamentum flavum kesilir sonra dural kese kolayca açıktır. Dikkatli T10 de iki taraflı parça-yemek laminektomi gerçekleştirmek için ince uçlu rongeurs kullanın. Son derece dikkatli rongeur ipuçları dural kese ve yanlışlıkla yaralanma üzerinde aşağı yönlü baskı önlemek için alınır. Lamina ve T10 spinöz proses tamamen kaldırılır.
Istikrar platformda yerine hayvan taşımak. T9 vertebra vücudun yan yönlerini takip T11 vertebra vücudun yan yönlerini sıkma tarafından omurga hareketsiz stabilize kelepçeleri kullanın. Bu solunum hareketleri için yer kısıtlamak ve istenmeyen stres hayvan eklersiniz olarak stabilize kelepçeli platform haline sıçan sıkıştırmak için dikkatli olun. Güvence sonra bilgisayar kontrollü darbe üzerindeki omurga ayarları kontrol edilir. Biz genellikle bir sp az 3.0 mm darbe ucu kullanın2 mm'lik bir derinlikte ve 0.3 saniyelik bir kalma süresi ile 4 cm / s JNC. Darbe ucu uzatın ve sadece kablosu yüzey temas edene kadar daha düşük. Ucu geri çekin ve omurilik yüzeyine doğru cihaz 2 mm daha düşük. Şiddetli kontüzyon omurilik yaralanması neden 4 cm / sn piston bırakın. Kablosu üzerine gereksiz baskı oluşturmak için dikkatli olmak, bir yerde pamuk uçlu aplikatör tutmak için yeterli basıncı kullanarak hemostaz ulaşmak. Bir rakam-8 dikiş dikkatli olmak dikiş kas ve fasya katmanları emilebilir dikişlerle kullanarak çok sıkı çekmek için değil. 2 küçük zımba en az ile cilt kapatın, kesi parçaları ilk 2 veya 3 zımba sonra açık kalırsa 4 kadar veya 5 zımba kullanılabilir.
3. Işlem sonrası Bakım
24 saat sonrası ameliyat için yaklaşık 33-35 ° C sıcak bir ortamda fareler. Onlar hareket etmeye başlar sonra bu bir kuluçka (onlar bilinçsiz iken) ve ısıtmalı kafes alanı gerektirir. Bir kez fareler tamamen aw olanAKE, tuzlu su ve her deri altından buprinorphine 1.5 ml (0.006 mg / ml) ve Baytril 0.1 ml 5 ml yönetmek. 7 gün boyunca günde bir kez ilk 24-48 saat ve Baytril için deri altından günde iki kez buprinorphine ile devam edin. Mesane elle mesane fonksiyon dönüş (3 gün boyunca sabah ifade idrar <2 ml) kadar günde üç kez ifade edilmelidir. Hayvanlar da enfeksiyon için bu kez (idrarda kan, beyazımsı renkli, ya da kötü koku) sırasında kontrol edilmelidir, fiziksel aktivite veya yara iyileşmesi ile ilgili sorunlar azalmıştır. Enfeksiyon varlığı yerel veteriner danışarak antibiyotik artan doz (veya yeniden başlatma) ile karşılık olmalıdır. Günlük kendi kurtarma değerlendirmek için ameliyat bir gün sonra başlayan fareler tartılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lezyon Ses
Bu teknik yukarıda tarif izlenerek ve tutarlı bir lezyon geniş hacimleri elde edilmiştir. 2.04 mm 3 (1,9-2,18% 95 CI) (n = 5 hayvan) elde edildi ve ortalama lezyon hacmi boyama bir Luxol hızlı mavi. Şekil 2 kullanarak lezyon merkez üssü ile Luxol hızlı mavi kullanarak bir temsilci boyama ile lezyon hacmi anlamına gelir.
Fonksiyonel Skorlar
Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) ölçeği ile ölçülen davranış skoru, Şekil 3'te gösterilmiştir. 12 haftada kontrol grubunda sıçan 2.2 ± 1.1 (n = 10 hayvan) bir ortalama BBB skor elde etti.
Diğer Parametreler
32 hayvan ameliyatları ile en son deneyime dayalı bu tekniğin hayatta kalma oranı% 93.4 olduğunu. Tüm ölümleri önlemek için hayvan kurban takip kalıcı idrar yolu enfeksiyonu (İYE) ile ilişkili olduğunu aşırı ağrı ve acı. 7 gün boyunca antibiyotik ders bittikten sonra% 16.7 hayvanlar İYE geliştirdi. İYE ameliyat sonrası tespiti için gün sayısı ortalaması 14.6 ± 7.6 gün. İlginç hayvanlar yaralanma sonrası ortalama 13 gün (13.33 ortalama ± 3.6 gün) mesane kontrolü elde. İYE geliştirilen Sıçanlar İYE olmayan sıçan (- 16 ± 12,8 'e karşı 1 gün ± İYE, p = 0.03 olmadan sıçanlarda mesane kontrolü için 3.7 gün İYE ile sıçanlarda Mesane kontrolü) ile karşılaştırıldığında mesane kontrolü sağlamak için uzun sürdü. Kohortta hiçbir sonraki İYE tespit edildi 14 gün içinde mesane kontrolü elde. Şekil 4 'de gösterildiği üzere, sıvı tutma Sci muhtemelen sonra kilo kazancı bir ilk oldu. Ağırlık daha sonra düştü ve yaklaşık 10 gün içinde daha düşük bir seviyede (başlangıç göre yaklaşık% 10-12 daha düşük) için stabilize.
/ Files/ftp_upload/50111/50111fig1highres.jpg "/>
Şekil 1. Spinöz süreçleri ve lamina gösteren posterior yaklaşım (solda) sıçan vertebra anatomisi. Ligamentum flavum (LF) konumu lamina arasındaki boşluk gösterilmiştir. Ligamentum flavum ve omurilik ile ilgili olarak interspinöz bağ göreli konumunu gösteren mid-sagital bölümü (sağ).
Şekil 2. Çubuk grafik ciddi omurilik yaralanması (solda) alan hayvanlarda lezyon hacmi (mm 3, Y ekseninde) gösteren. Luxol hızlı mavi boyama sonra yaralanma merkez üssü ile bir temsilci boyuna kesit (sağda).
g3highres.jpg "/>
Şekil 3,. Şiddetli SCI tipik minimum kurtarma gösteren takip 3 ay boyunca (X ekseni) üzerinde sıçan BBB (Y ekseni) ortalama puan.
Şekil 4. Omurilik hasarı oluşturulduktan sonra 2 hafta süre (X ekseni) üzerinde sıçanların günlük ağırlık (g, Y ekseninde) varyasyon gösteren hat şeması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çeşitli yeni tedaviler son SCI araştırma alanında erken söz göstermiştir. Bu tedavilerin 3 dikkatli değerlendirilmesi maksimum öteleme potansiyeli olan stratejileri seçmek için SCI klinik modeli önemlidir. Sınıflandırma bir düzeni son klinik öncesi çalışmalar gücünü değerlendirmek için geliştirilmiştir. 9 Bu düzeni ciddi SCI kontüzyon modeli kullanarak önemini vurguladı. Burada kesisi modelleri andıran tutarlı lezyon hacmi ve fonksiyonel skorları şiddetli SCI böyle bir kontüzyon modeli tarif. Bu model nöro ve Nörorejenerasyon stratejileri için hem tedavi etkinliğini kurmak için bir 'kavram ispatı' olarak kullanılabilir.
Üniforma contusive SCI nesil zorlu kalır. Tekrarlanabilirlik, bu yaralanma gibi mümkün olduğu kadar muntazam yapılması esastır. Omurilik hedef seviyesi sürekli fr tanımlanmalıdırhayvan om hayvan. Laminektomi sırasında kemik Kaldırma hiçbir kemik parçaları spinal kanal kalır emin olmak için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır; bu sıkıştırma yaralanmalara neden ve yaralanma mekanizmaları ve kurtarma potansiyel istenmeyen değişiklikler getirebilir. Biz tek tip bir etki hızı ve sıkışma derinliği kullanarak, monte stabilize silah ile bir çerçeve üzerinde omurga darbe, sert istikrar bütünlüğü dahil olmak üzere büyüklüğü sağlamak için çeşitli adımlar benimsemiştir. Bu stabilize forseps vertebralarda için kenetlenmiş zaman sıçan rahatça yerleştirilmesi önemlidir. Sıkıştırma sırasında spinal uyum ya da aşırı stres farklılıkları etki biyomekanik değiştirebilir. Ilgi bölgemizde sıçan omurilik ortalama büyüklüğü 2.5-3 mm beri 2.5 mm çarpma kullanılır. Temas süresi ya da bekleme düzgün deneylerde 0,3 sn olarak belirlenmiştir. Ancak SCI ciddi bir model için bizim gözlem ve diğer laboratuvarları raporlar, içinde darbe derinliği en önemli olanparametresi. Bu yazıda anlatılan deneylerde etkisi 2 mm sabit bir derinlikte teslim edildi. Tekdüzelik etkileyen diğer faktörler kord doku (ve kemik yapıları) doğrudan etki sağlamak için personel eğitimi, doku açık görselleştirme ve çarpma ucu içerir.
Sıçanlar sürekli gerekli vital bulguları en önemlisi çekirdek sıcaklığını ve nefes alabilmesi için işlem sırasında dikkat edilmelidir. Hipotermi anestezi uygulaması sırasında ve hemen sonrasında ölüm önde gelen nedenidir. Rektal prob ve uygun ısıtma pedleri ile çekirdek sıcaklığının izlenmesi bu komplikasyonu önlemek olacaktır. Solunum düzensiz olur ya da hayvan nefes sona erer, işlem hemen başlangıca döner nefes kadar durdurulmalıdır. Ağrı ve anestezik ilacın dozu fazla aşırı ağrı ve veya yanlışlıkla da solunum problemleri neden olabilir. Sıçanlar dikkatle işlem sonrası izlenmelidir. Onların wSekiz doğru ölçülmelidir ve başlangıç ağırlığı>% 20 bir kayıp gıda ve su alımı, idrar yolu enfeksiyonu, deri arıza, post-SCI ileus, vb değerlendirme ve tedavi için veteriner kadrosu ile Erken istişare soruşturma istemi gerekir önemlidir Böyle durumlarda. Daha önce tartışıldığı, günlük 14 ile mesane kontrolü ele geçirdi değil sıçan bir potansiyel olarak ölümcül bir idrar yolu enfeksiyonu önlemek için antibiyotik geri başlanmalıdır.
Spinal kord yaralanması bir deplasman yöntemi veya sabit kuvvet yöntemi ya tarafından uyarılabilir. 5,12 Bu yazıda anlatılan teknik gücü omurilik dokusu içinde sabit derinliğe kadar teslim edilir değiştirme yöntemidir. Bir bilgisayar kontrollü Darbe n kullan deneysel spinal kord diğer ortak yöntemlerle ulaşılabilir değil kontrolü düzeyi sağlar. Klip sıkıştırma tekniği, derhal serbest bırakılması ile bir künt, contusive gücü için izin vermez ise NYU etkisiveya kontüzyon kuvveti belirlemek için yerçekimi bağlıdır. Bu teknikler tekrar üretilebilir, ancak, bir motorlu araç kazası, insanlarda akut omurilik yaralanması en yaygın nedeni sırasında karşılaşılan koşullar simülasyon izin vermez. Önceki çalışmalar, yaralanma şiddetine doğrudan etkinin hızının daha etkisi derinliği ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Dolayısıyla 7 Bu modeli ve deplasman kombinasyonları daha geniş bir aralık içerisinde şiddetini değiştirmek için rutin olarak potansiyeli ile yapılması gereken bir şiddetli SCI sağlar .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Finansal açıklama yok
Finansman açıklama yok.
Acknowledgments
Yazarlar Dr N. Banik ve bu modelin geliştirilmesinde kendi rehberlik için Dr D. Mitchell minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
- Blesch, A., Tuszynski, M. H. Spinal cord injury: plasticity, regeneration and the challenge of translational drug development. Trends Neurosci. 32, 41-47 (2009).
- Dobkin, B. H. Curiosity and cure: translational research strategies for neural repair-mediated rehabilitation. Dev. Neurobiol. 67, 1133-1147 (2007).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J. Neurotrauma. 28, 1329-1333 (2011).
- Iseda, T., Okuda, T., Kane-Goldsmith, N., et al. Single, high-dose intraspinal injection of chondroitinase reduces glycosaminoglycans in injured spinal cord and promotes corticospinal axonal regrowth after hemisection but not contusion. J. Neurotrauma. 25, 334-349 (2008).
- Khan, T., Havey, R. M., Sayers, S. T., et al. Animal models of spinal cord contusion injuries. Laboratory Animal Science. 49, 161-172 (1999).
- Kim, B. G., Kang, Y. M., Phi, J. H., et al. Implantation of polymer scaffolds seeded with neural stem cells in a canine spinal cord injury model. Cytotherapy. 12, 841-845 (2010).
- Kim, J. H., Tu, T. W., Bayly, P. V., et al. Impact speed does not determine severity of spinal cord injury in mice with fixed impact displacement. Journal of Neurotrauma. 26, 1395-1404 (2009).
- Kwon, B. K., Hillyer, J., Tetzlaff, W. Translational research in spinal cord injury: a survey of opinion from the SCI community. J. Neurotrauma. 27, 21-33 (2010).
- Kwon, B. K., Okon, E. B., Tsai, E., et al. A grading system to evaluate objectively the strength of pre-clinical data of acute neuroprotective therapies for clinical translation in spinal cord injury. J. Neurotrauma. 28, 1525-1543 (2011).
- Norenberg, M. D., Smith, J., Marcillo, A. The pathology of human spinal cord injury: defining the problems. J. Neurotrauma. 21, 429-440 (2004).
- Siegenthaler, M. M., Tu, M. K., Keirstead, H. S. The extent of myelin pathology differs following contusion and transection spinal cord injury. J. Neurotrauma. 24, 1631-1646 (2007).
- Talac, R., Friedman, J. A., Moore, M. J., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25, 1505-1510 (2004).
- Tator, C. H. Review of treatment trials in human spinal cord injury: issues, difficulties, and recommendations. Neurosurgery. 59, 957-982 (2006).
