Summary
심각한 척수 손상의 타박상 모델이 설명되어 있습니다. 자세한 수술 전, 수술 및 수술 후 단계는 일관된 모델을 얻기 위해 설명되어 있습니다.
Abstract
새로운 치료의 번역 가능성은 심각한 척수 손상 (SCI) 타박상 모델에서 조사해야한다. 자세한 방법론은 심각한 SCI의 일관된 모델을 얻기 위해 설명되어 있습니다. 정위 구조 및 컴퓨터 제어 충격기의 사용은 재현성 부상을 생성 할 수 있습니다. 저체온증과 요로 감염은 수술 후 기간에 상당한 도전을 제기. 일일 체중 기록 및 방광 식 동물의주의 깊은 모니터링이 수술 후 합병증의 조기 발견 할 수 있습니다. 이 타박상 모델의 기능적 결과를 절개 모델과 동일합니다. 타박상 모델은 신경과 neuroregenerative 방법 모두의 효능을 평가하기 위하여 이용 될 수있다.
Introduction
적절한 손상 모델의 선택은 척수 손상에 대한 새로운 치료법 (SCI)의 전임상 평가에 매우 중요합니다. 의사와 neurotrauma 타박상 모델 분야의 과학자의 최근 조사에 1,2,13, hemisection 또는 전체 절개 모델에 반대 보편적으로 임상 적으로 받아 들여졌다. 8이 견해는 인간의 척수 손상의 대부분은 자연 contusive 것을 관찰을 기반으로합니다. 10 타박상의 생물학은 hemisection 또는 절개 모델에서 다른 것으로 보인다. 11 Iseda, 등이 알이. hemisection 및 타박상 모델에서 별도 neuroregeneration에 intraspinal chondroitinase ABC 주입의 효과를 비교 하였다. 4 축삭 재생이 hemisection에 신경 다리에서 관찰하지만, 타박상 SCI 그룹되지 않았습니다. hemisection 또는 전체 절개 모델은 또한 CL의 단지 아주 작은 하위 집합에 존재하는 것으로 알려진 조건을 만들inical 상황. 예를 들어, 몇몇 연구자들은 hemisection 또는 재생을 촉진하는 완전 절개 후 병변 캐비티에 주입을위한 발판 기반의 개입을 고용했다. 6 손상된 척수 내에서 공동의 생성은 비실용적이고 아마 비 윤리적이기 때문에이 방법은 임상 적으로 관련이됩니다.
기능 회복의 변화는 타박상 모델의 주요 과제 남아있다. 5,12이 변화는 척수 볼륨에 걸쳐 균일 한 힘의 전달에 영향을 미치는 특히 ventrally있는 모터 경로 전에 컴퓨터 제어 충격기와 척추 안정화의 사용으로 최소화 할 수있다 . 그것은 생존 축삭에서 소성 및 담보 비중이 척수 손상 후 회복의 주된 메커니즘 주목해야합니다. 타박상 기술 1 따라서도 약간의 변동이 크게 다른 결과를 얻을 수 있습니다. 이를 위해 우리는 개발일관성 타박상 볼륨과 절개 모델과 비교 기능 회복을 산출 심각한 척수 손상 모델. 이 모델은 치료 효과에 대한 개념의 증거로 신경 보호 및 neuroregeneration 전략을 모두 조사에 활용 될 수있다.
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Protocol
1. 척수 손상 전 준비
이 절차에 필요한 수술 도구, 치아, hemostats, 자체 유지 견인기, 좋은 팁 rongeurs, 바늘 드라이버, 흡수성 봉합, 피부 클립 도포와와없는 픽업 메스입니다. 필요한 다른 수술 용품 수술 커튼, 수술 필드 멸균 시트, 거즈 스폰지, 면봉 도포 및 금속 호일입니다. 수술하기 전에 수술 장비 및 소모품을 압력솥. 하나의 동물에 대한 장비 및 소모품의 개별 집합을 사용합니다. 외과 영역 및 알코올 잎사귀와 장치 (충격기, 광원, 정위 프레임, 유리 구슬 살균 및 가열 패드) 청소합니다.
수술 커튼을 열고 조심스럽게 오염을 방지 수술 필드를 드레이프 멸균 장갑을 사용한다. 무균 개별 악기를 열고 조심스럽게 수술 분야의 사람들을 배치합니다. 일의 손잡이와 핸들 커버전자 장치는 가능성 멸균 금속 호일 절차를 수행하는 동안 필요합니다. 스위치에 유리 구슬 살균기 절차를 수행하는 동안 사용하기 위해 준비합니다.
2. 동물의 준비
실제 절차 전에 실험실 영역 몇 시간에 쥐를 가져옵니다. 앞으로 기대 절차 (일반적으로 0.006 밀리그램 / ML 피하의 buprinorphine 1.5 ml)에 적어도 하나의 시간 진통제를 관리 할 수 있습니다. 수술 전 항생제 (일반적으로 Baytril 4 ㎎ / kg 피하) 관리 할 수 있습니다. 90 ㎎ / 케타민의 kg을 사용하여 쥐를 마취하고 아무 발가락 핀치 응답이 없을 때까지 기다립니다. 흉추에서 가장 눈에 띄는 극돌기를 만져. 이 수준은 일반적으로 T10 극돌기에 해당합니다. T10과 관련하여 구성 수준의 위치를 표시합니다. 우리가 실험실에서 우리는 T10 상해를 수행합니다. 다음 이야기는 T10 SCI의 기술을 설명합니다. 길이 방향 3cm x 6 센티미터 사각형을 면도 T10 수준을 중심으로. 피부를 세 번 위스콘신 청소번째 베타 딘 용액. 각 눈에 안과 윤활제를 적용합니다. 주의 깊게 오염을 방지 수술 필드에 편안한 위치에 쥐를 전송합니다. 코어 온도를 모니터링하고 주변 정상 (~ 37.5 ° C) 가능한에 관해서는 동물의 온도를 유지하기 위해 적절하게 난방을 조정하는 직장 온도 프로브를 삽입합니다. 수술 부위 위의 창 수술 장식 주름 쥐를 다룹니다.
3. 수술
T10 마크를 중심으로 # 10 블레이드를 사용하여 대략 4cm 절개로 시작합니다. 참을성 멀리 T9-T11 극돌기 프로세스와 엽층의 근막과 근육 레이어를 해부를 진행합니다. 뼈 근육과 근막을 멀리 철회 견인기를 놓습니다. T9의 극돌기를 안정화하는 동안 크게 고급 가위를 사용하여 T9와 T10 사이의 극간 인대를 나눕니다. 마찬가지로 T10 극돌기를 안정시키고 T10-T11 사이의 극간 인대를 나눕니다. 보완하기 위해 루프 배율을 사용인대 flavum (그림 1)를 통해 테 인대의 부분은 모든 방법. 인대 flavum가 연결되면 thecal 낭은 명백하다. 주의 T10에서 양측 조각 - 식사 후궁을 수행하기 위해 좋은 팁 rongeurs를 사용합니다. 정성이 rongeur 끝에서 thecal 주머니 및 부주의 부상에 하향 압력을 방지하기 위해 수행됩니다. 라미와 T10의 극돌기가 완전히 제거됩니다.
안정화 플랫폼의 위치로 동물을 이동합니다. T9 척추의 측면 측면 뒤에 T11 척추의 측면 측면을 체결하여 척추를 고정시키기 위해 안정 클램프를 사용합니다. 이 호흡 운동을위한 공간을 제한하고 원치 않는 스트레스에게 동물을 추가로 안정화 클램프 플랫폼에 쥐를 압축하지 않도록주의하십시오. 확보 한 후 컴퓨터 제어 충격기에 척추 설정이 확인됩니다. 우리는 일반적으로 SP에 3.0 mm의 임팩터 팁을 사용하여2mm의 깊이와 0.3 초 드웰 시간에 4cm / S의 EED. 임팩터 팁을 확장하고 그냥 코드 표면에 닿을 때까지 내립니다. 끝을 철회하고 척수 표면을 향해 장치 2mm를 내립니다. 심한 타박상 척수 손상을 일으킬 4cm / s의 속도로 피스톤을 해제합니다. 코드에 불필요한 압력을 생성하지 않도록주의 대신에면 끝 도포를 유지하기 위해 충분한 압력을 사용하여 지혈을 달성. 그림 - 8 스티치가 조심로 봉합 근육과 근막 층은 흡수성 봉합사를 사용하여 너무 꽉 당겨하지. 2 개의 작은 스테이플의 최소 피부를 닫습니다, 절개 부분은 첫 번째 2 또는 3 스테이플 후 열려있는 경우 최대 4 ~ 5 스테이플을 사용할 수있다.
3. 시술 후 관리
24 시간 후 수술에 대해 33 ~ 35 ° C의 따뜻한 환경에서 장소 쥐. 그들이 움직이기 시작되면이 인큐베이터 (그들은 의식이있는 동안) 및 가열 케이지 공간을 수반한다. 일단 쥐가 완전히 아입니다아케는 식염수의 피하 buprinorphine의 1.5 ML (0.006 밀리그램 / ML) 및 Baytril 0.1 mL를 5ml를 관리. 칠일 동안 하루에 한 번 첫 24-48 시간 및 Baytril 위해 피하 하루에 두 번 buprinorphine를 계속합니다. 방광은 수동으로 방광 기능의 반환 (3 일 연속 이른 아침 식 소변 <2 ㎖)까지 하루에 세 번 표현해야한다. 동물도 감염이 시간 (소변에 혈액, 흰 색, 악취) 중에 선택해야 신체 활동 또는 상처 치유 문제를 감소. 감염의 존재는 지역 수의사와 상담 항생제의 증가 용량 (또는 다시 시작)를 반대해야한다. 매일 자신의 회복을 평가하기 위해 수술 다음날부터 쥐 무게.
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Representative Results
병변 볼륨
우리는 기술은 위에 설명에 따라 크고 일관된 병변 볼륨을 얻을 수있다. 2.04 mm 3 (1.9-2.18 CI 95 %) (N = 5 동물)를 얻었다의 평균 병변 볼륨을 염색 Luxol 빠른 파란색. 그림 2를 사용하여 병변 진원지를 통해 Luxol 빠른 블루를 사용하는 대표적인 염색 병변 볼륨을 의미합니다.
기능 점수
바소, 비티, 브레스 (BBB) 규모로 측정 한 행동 점수는 그림 3에 나와 있습니다. 12주에서 대조군 쥐가 2.2 ± 1.1 (n은 = 10 동물)의 평균 BBB 점수를 달성했다.
다른 매개 변수
32 동물 수술과 함께 가장 최근의 경험을 바탕으로이 기술의 생존율은 93.4 %이다. 모든 치사를 피하기 위해 동물의 희생 뒤에 지속적인 요로 감염 (UTI)에 관련이 있었다 과도한 고통과 고난. 칠일에 대한 항생제의 과정을 마친 후 16.7 %의 동물 UTI을 개발했다. 요로 감염 수술의 검출을위한 일의 평균 수는 14.6이었다 ± 7.6 일. 흥미롭게 동물은 부상 후 보통 13 일 (13.33 평균 ± 3.6 일)에 방광 통제를 달성. UTI을 개발 쥐 UTI없이 쥐 (- 16 ± 12.8 대 일일 ± UTI, p = 0.03가없는 쥐의 방광 통제를위한 3.7 일 UTI와 쥐의 방광 제어)에 비해 방광 통제를 달성하는 데 시간이 더 오래 걸렸다. 일대에있는 더 이후의 요로 감염이 발견되지 않았습니다 14 일 이내에 방광 통제를 달성. 그림 4에서 보는 바와 같이, 유체 보존에서 SCI 가능성이 후 체중 초기 이득이 있었다. 무게는 연속적으로 감소하고 약 10 일 낮은 수준 (기준보다 약 12 % 이하)로 안정화.
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그림 1. 추간판 프로세스와 엽층을 보여주는 후방 접근법 (왼쪽)에서 쥐의 척추 해부학. 인대 flavum (LF)의 위치는 엽층 사이의 공간에 설명되어 있습니다. 인대 flavum와 척수 관련하여 극간 인대의 상대적 위치를 보여주는 중간 saggital 부분 (오른쪽).
그림 2. 막대 그래프는 심각한 척수 손상 (왼쪽) 수신 동물에서 병변 볼륨 (mm 3, Y 축)를 표시합니다. Luxol 빠른 블루 염색 후 손상 진원지를 통해 대표 종단면 (오른쪽).
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그림 3. 심각한 SCI 전형적인 최소한의 회복을 보여주는 후속 최대 3 개의 달의 과정 (X 축)에 쥐 BBB (Y 축) 점수를 의미한다.
그림 4. 척수 손상 유발 후 2 주간 시간 (X 축)를 통해 쥐의 일상 중량 (g, Y 축)의 변화를 보여주는 선 그림.
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Discussion
여러 가지 새로운 치료는 최근 SCI 연구 분야의 초기 약속을 보여 주었다. 이러한 치료 3주의 평가는 최대 번역 가능성 전략을 선택하는 SCI의 임상 적 모델에 필수적입니다. 등급의 계획은 최근 전임상 연구의 강도를 평가하기 위해 개발되었다. 9이 제도는 심각한 SCI의 타박상 모델을 활용의 중요성을 강조했다. 여기에 우리가 절개 모델들을 닮은 일관된 병변 볼륨 및 기능 점수가 심한 SCI의 그런 타박상 모델을 설명합니다. 이 모델은 신경 보호 및 neuroregeneration 전략 모두에 치료 효능을 설정하는 '개념의 증거'로 활용 될 수 있습니다.
균일 contusive SCI의 생성은 도전 남아있다. 재현성을 위해, 그것은 부상으로 균일 가능한 수행하는 것이 필수적이다. 척수의 목표 수준은 지속적으로 FR 식별해야동물의 OM 동물입니다. 후궁 동안 뼈의 제거가 더 뼈 조각이 척추 운하에 남아되지 않습니다 보장하기 위해 신중하게 수행되어야한다 이러한 압축 부상의 원인이 부상 메커니즘과 복구 가능성에 원치 않는 변화를 소개 할 수 있습니다. 우리는 일정한 충격 속도와 끼워 깊이를 사용하여 마운트 안정화 팔 프레임 척추 충격기, 엄격한 안정화의 균일 성 등의 크기를 보장하기 위해 몇 가지 단계를 채택했습니다. 그것은 안정 집게가 척추 몸에 고정 될 때 쥐가 편안하게 배치하는 것이 중요합니다. 클램핑 동안 척추 정렬하거나 초과하는 스트레스의 모든 변화가 미치는 영향의 역학을 변경할 수 있습니다. 우리의 관심 영역에서 쥐 척수의 평균 크기는 2.5-3 mm이기 때문에 우리는 2.5 mm 충격기를 사용했습니다. 접촉 시간이나 망설임이 균일 우리의 실험에서 0.3 초로 설정되었습니다. 그러나 SCI의 가혹한 모델에 대한 우리의 관찰 및 기타 연구소의 보고서에 미치는 영향의 깊이가 가장 중요합니다매개 변수입니다. 이 문서에 설명 된 실험에 미치는 영향은 2mm의 일정한 깊이에 전달했다. 균일에 영향을 미치는 다른 요인은 코드 조직 (그리고 뼈 구조)에 직접적인 영향을 보장하기 위해 인재 육성, 조직의 명확한 시각화 및 임팩터 팁 (가) 있습니다.
쥐가 지속적으로 필요한 생체 신호 가장 중요한 핵심 온도와 호흡 과정 동안 관찰해야한다. 저체온증은 마취 관리 동안과 직후 사망의 주요 원인이다. 직장 프로브와 적절한 가열 패드와 코어 온도 모니터링이 합병증을 피할 것이다. 호흡이 불규칙 지거나 동물이 호흡을 중단하는 경우 절차가 바로 기준으로 수익을 호흡 할 때까지 중단되어야한다. 통증과 마취 약물의 용량에 과도한 통증이나 실수도 호흡 문제가 발생할 수 있습니다. 쥐 신중하게 포스트 절차를 모니터링해야합니다. 그들의 W형상을 정확하게 측정해야하며 기본 무게에서> 20 %의 손실이 음식과 물을 섭취, 요로 감염, 피부 고장, 포스트 SCI 장폐색 등의 평가 및 치료를위한 수의 직원과 초기 상담에 대한 조사하라는 메시지를 표시해야하는 것은 매우 중요하다 이러한 상황합니다. 앞서 논의했듯이, 일 (14)에 의해 방광 통제를 회복하지 않은 쥐 잠재적으로 치명적인 요로 감염을 방지하기 위해 항생제를 다시 시작해야합니다.
척수 손상은 변위 방법 또는 일정한 힘 방법 중 하나에 의해 유도 될 수있다. 5,12 본 논문에서 설명하는 기술은 힘이 척수 조직 내에서 고정 된 깊이까지 전달되는 변위 방법입니다. 컴퓨터 제어 충격기의 사용은 실험 SCI의 다른 일반적인 방법으로 달성되지 제어의 수준 수 있습니다. 클립 압축 기술은 즉각적인 릴리스 무딘, contusive 힘을 허용하지 않습니다 동안 NYU에 미치는 영향나 타박상의 힘을 결정하는 중력에 따라 달라집니다. 이 기술은 재현성 있지만, 자동차 사고, 인간의 급성 SCI의 가장 흔한 원인 중 발생하는 조건의 시뮬레이션을 허용하지 않습니다. 이전 연구는 부상의 심각도에 직접 영향의 속도보다 충격의 깊이와 상관 것으로 나타났습니다. 따라서 7이 모델은 힘과 변위의 조합의 더 큰 범위에서 심각도를 수정하는 일상적 가능성 수행 할 심각한 SCI 수 있습니다 .
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Disclosures
재정 공시 없음
자금 유출 없음.
Acknowledgments
저자는 박사 N. Banik이 모델의 개발에 자신의 지침 박사 D. 미첼에게 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
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