Summary
Um modelo de contusão grave lesão da medula espinhal é descrito. As etapas detalhadas no pré-operatório, operatório e pós-operatório são descritos para obter um modelo consistente.
Abstract
O potencial translacional de novos tratamentos devem ser investigadas em lesão medular grave (SCI) modelos de contusão. A metodologia detalhada é descrita a obtenção de um modelo consistente de SCI grave. Utilização de uma moldura estereotáxica e computador pêndulo controlada permite a criação de lesão reprodutível. Hipotermia e infecção do trato urinário representam desafios significativos no período pós-operatório. Monitorização cuidadosa dos animais com registro de peso diário e expressão bexiga permite a detecção precoce de complicações pós-operatórias. Os resultados funcionais deste modelo de contusão são equivalentes aos modelos transecção. O modelo de contusão pode ser utilizado para avaliar a eficácia de ambas as abordagens neuroprotectores e neuroregenerative.
Introduction
Escolha do modelo de lesão adequado é fundamental para a avaliação pré-clínica de novos tratamentos para a lesão da medula espinhal (SCI). 1,2,13 Em uma recente pesquisa de médicos e cientistas no domínio do modelo de contusão neurotrauma, ao contrário de hemisection ou modelos completos transecção , foi universalmente aceito para ser clinicamente relevante. 8 Esta opinião é baseada na observação de que a maioria da lesão medular em humanos é contundente na natureza. 10 A biologia de contusão também parece ser diferente dos modelos hemissecção ou transecção. Iseda 11, et ai. comparou o efeito de injecção intra-espinal condroitinase ABC no neuroregeneração separadamente em contusão hemisecção e modelos. quatro regeneração axonal foi observada na ponte neuronal em hemisecção mas não o grupo SCI contusão. O hemisection ou modelos completos transecção também criar condições conhecidas de existir em apenas um pequeno subconjunto de clcircunstâncias inical. Por exemplo, vários investigadores têm utilizado as intervenções baseadas em andaime para o implante na cavidade lesão após hemisection ou transecção completa para promover a regeneração. 6 Essa abordagem torna-se clinicamente irrelevante, porque a criação de uma cavidade dentro lesionado medular é impraticável e provavelmente antiético.
Variabilidade na recuperação funcional continua a ser um grande desafio para os modelos de contusão. 5,12 Esta variabilidade pode ser minimizado pela utilização de pêndulo, controlado por computador e estabilização da coluna vertebral antes do impacto, para a entrega de força uniforme, através do volume da medula espinal nomeadamente as vias motoras ventralmente localizadas . Deve-se notar que a plasticidade ea contribuição garantia de sobreviventes axônios é o mecanismo predominante de recuperação após a lesão medular. 1 Portanto, mesmo pequenas variações na técnica de contusão pode produzir resultados significativamente diferentes. Para este fim, temos desenvolvidoum modelo de grave lesão da medula espinhal que produz volume de contusão consistente e recuperação funcional comparável com modelos transecção. Este modelo pode ser utilizado para investigar tanto a neuroproteção e estratégias neuroregeneração como uma prova de conceito para a eficácia do tratamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação Antes de Lesão Medular
Os instrumentos cirúrgicos necessários para este procedimento são bisturi, captadores com e sem dentes, hemostats, afastadores de auto-retenção, rongeurs de ponta fina, motorista agulha, suturas absorvíveis e clip aplicadores da pele. Outros suprimentos cirúrgicos necessários são campos cirúrgicos, lençóis estéreis para campo operatório, gaze esponjas, aplicadores de algodão-ponta, e folhas metálicas. Autoclave os instrumentos cirúrgicos e material antes da cirurgia. Use o conjunto individual de instrumentos e materiais para um animal. Limpe a área cirúrgica e aparelhos (pêndulo, fonte de luz, quadro estereotáxico, contas de vidro esterilizadores, e esquentadores), com algodão embebido em álcool.
Abra as cortinas cirúrgicas e usar luvas estéreis para armar o campo cirúrgico cuidadosamente evitando a contaminação. Abra os instrumentos individuais esterilizada e coloque cuidadosamente as do campo cirúrgico. Cubra os botões e puxadores de thaparelhos e provavelmente necessário durante o procedimento, com a folha metálica estéril. Ligar o talão esterilizador de vidro para estar pronto para o uso durante o procedimento.
2. Preparação dos Animais
Trazer os ratos para o laboratório algumas horas antes da área do procedimento real. Administrar medicação para a dor, pelo menos, uma hora antes do procedimento esperado (tipicamente buprinorphine 1,5 ml de 0,006 mg / ml por via subcutânea). Administrar antibióticos pré-operatórios (Baytril tipicamente de 4 mg / kg por via subcutânea). Anestesiar os ratos utilizando 90 mg / kg de cetamina e esperar até que não haja resposta toe-pitada. Palpar o processo espinhoso mais proeminente na coluna torácica. Este nível corresponde tipicamente com T10 processo espinhoso. Marque a localização do nível pretendido em relação a T10. Em nosso laboratório realizamos uma lesão T10. A narrativa seguinte descreve a técnica de T10 SCI. Shave a 3 centímetros x 6 cm rectângulo longitudinalmente e centrado em T10 nível. Limpe a pele três vezes wisolução Betadine ª. Aplique lubrificante oftálmico em cada olho. Transfira o rato em uma posição confortável para o campo cirúrgico cuidadosamente evitando a contaminação. Insira uma sonda rectal de temperatura para monitorizar a temperatura do núcleo e ajustar o aquecimento em conformidade para manter a temperatura do animal mais próximo do normal (~ 37,5 ° C), como possível. Cobrir o rato com uma cobertura cirúrgica com uma janela sobre o local cirúrgico.
3. Procedimento Cirúrgico
Comece com uma incisão de aproximadamente 4 centímetros usando uma lâmina # 10 centrada na marca T10. Proceder de dissecar pacientemente fáscia e camadas musculares longe das T9-T11 processos espinhosos e lâminas. Coloque afastadores para retrair o músculo e fáscia longe do osso. Enquanto a estabilização do processo espinhoso de T9 acentuadamente dividir o ligamento interespinhoso entre T9 e T10 usando uma tesoura fina. Da mesma forma a estabilizar o processo espinhoso T10 e dividir o ligamento interespinhoso entre T10-T11. Use ampliação loop para complete a divisão dos ligamentos todo o caminho através do ligamento amarelo (Figura 1). O saco tecal é facilmente perceptível uma vez que o ligamento amarelo é desconectada. Use fórceps de ponta fina para realizar cuidadosamente peça-refeição laminectomia bilateral em T10. O máximo de cuidado é tomado para evitar a pressão sobre o saco tecal e ferimento acidental com as pontas rongeur. A lâmina e processo espinhoso de T10 é completamente removido.
Coloque o animal em posição na plataforma de estabilização. Use grampos estabilizantes para imobilizar a coluna por aperto as faces laterais do corpo vertebral T11 seguido pelas faces laterais do corpo vertebral T9. Tenha cuidado para não comprimir o rato na plataforma com os grampos de estabilização, pois isso seria restringir o espaço para os movimentos respiratórios e adicione estresse indesejado do animal. Depois de garantir os ajustes da coluna vertebral no pêndulo controlado por computador são verificados. Normalmente usamos ponta pêndulo de 3,0 mm a uma speed de 4 cm / s, com uma profundidade de 2 mm e um tempo de permanência de 0,3 segundos. Estenda a ponta do pêndulo eo abaixá-lo até tocar a superfície do fio. Retrair a ponta e diminuir o dispositivo de 2 milímetros em direção à superfície da medula espinhal. Solte pistão a 4 cm / seg para causar grave contusão lesão medular. Atingir hemostasia utilizando apenas pressão suficiente para manter o aplicador com ponta de algodão no lugar, tomando cuidado para não criar qualquer pressão desnecessária sobre o cabo. Sutura muscular e camadas de fáscia com uma figura-8 ponto tomando cuidado para não puxar o muito apertado com suturas absorvíveis. Fechar a pele com um mínimo de dois pequenos grampos, até 4 ou 5 grampos podem ser utilizados, se as partes da incisão permanecer aberto após os primeiros dois ou três grampos.
3. Cuidados pós-procedimento
Ratos num ambiente quente de cerca de 33-35 ° C por 24 horas pós-cirurgia. Isto implica uma incubadora (enquanto eles são inconscientes) e um espaço gaiola aquecida, uma vez que eles começam a se mover. Uma vez que os ratos são totalmente awake, administrar 5 ml de soro fisiológico, 1,5 ml (0,006 mg / ml) de buprinorphine, e 0,1 ml de Baytril todos subcutaneamente. Continue com buprinorphine por via subcutânea duas vezes por dia para o primeiro 24-48 hr e Baytril uma vez por dia durante 7 dias. As bexigas deve ser ordenhado, três vezes por dia até o retorno da função de bexiga (<2 ml de urina na expressão de manhã cedo, durante 3 dias consecutivos). Os animais também deve ser verificado durante este tempo de infecção (sangue na urina, cor esbranquiçada, ou um odor desagradável), diminuição da atividade física ou problemas de cicatrização. Presença de infecção deve ser combatida com o aumento da dose (ou reinício) de antibióticos em consulta com veterinários locais. Pesar ratos diariamente a partir do dia após a cirurgia para avaliar a sua recuperação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volume lesão
Obtivemos grandes volumes de lesão e consistente, seguindo a técnica acima descrita. Usando um Luxol rápida coloração de uma volume de lesão média de 2,04 mm 3 (IC 1,9-2,18 95%) (n = 5 animais) foi obtido azul. Figura 2 mostra a média do volume da lesão com uma coloração representativo usando Luxol azul rápido através do epicentro da lesão.
Escores funcionais
As pontuações de comportamento medidos pela escala de Bresnahan Basso, Beattie (BBB) são mostrados na Figura 3. Ao fim de 12 semanas, os ratos no grupo de controlo atingiu uma contagem média certificação de 2,2 ± 1,1 (n = 10 animais).
Outros parâmetros
Com base em nossa experiência mais recente com 32 cirurgias de animais a taxa de sobrevivência dessa técnica é de 93,4%. Todas as mortalidades foram relacionados à infecção do trato urinário persistente (UTI), seguido pelo sacrifício de animais para evitar dor excessiva e sofrimento. Depois de terminar o curso de antibióticos por 7 dias 16,7% animais desenvolveram UTI. O número médio de dias para a detecção de UTI pós-operatória foi de 14,6 ± 7,6 dias. Curiosamente, os animais atingiram o controle da bexiga, em média, 13 dias após a lesão (média de 13,33 ± 3,6 dias). Os ratos que desenvolveram ITU levou mais tempo para alcançar o controlo da bexiga em comparação com os ratos sem ITU (controlo de bexiga em ratos com ITU - 16 ± 1 dias versus 12,8 ± 3,7 dias para o controlo da bexiga em ratos sem ITU, p = 0,03). Na coorte que atingiram o controle da bexiga no prazo de 14 dias sem UTI subseqüente foi detectado. Como mostrado na Figura 4, houve um ganho de peso inicial após a LM provável de retenção de fluidos. O peso subsequentemente diminuiu e estabilizou a um nível inferior (cerca de 10-12% inferior à linha de base) em cerca de 10 dias.
/ Files/ftp_upload/50111/50111fig1highres.jpg "/>
Figura 1. Anatomia vertebral de rato a partir de uma abordagem posterior (esquerda) que mostram os processos espinhosos e as lâminas. A posição do ligamento amarelo (LF) é representado no espaço entre as lâminas. Mid-sagital (direita), mostrando a posição relativa do ligamento amarelo e o ligamento interespinal, em relação à medula espinal.
Figura 2. Gráfico de barras mostrando volume de lesão (em mm 3, eixo Y) em animais que receberam lesão medular grave (esquerda). Uma seção longitudinal representante através epicentro lesões após a coloração azul rápido Luxol (direita).
g3highres.jpg "/>
Figura 3. BBB (eixo Y) pontuação dos ratos ao longo de três meses de follow-up (eixo X), demonstrando recuperação mínima típica do SCI grave dizer.
Figura 4. Diagrama de linha mostrando variação de peso diário (em g, eixo Y) de ratos mais de 2 semanas de duração (eixo X), após a indução de lesão medular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vários novos tratamentos têm mostrado recentemente promessa adiantada no campo de pesquisa SCI. 3 avaliação cuidadosa destes tratamentos é essencial no modelo clinicamente relevante da SCI para selecionar estratégias com potencial translacional máximo. Um esquema de classificação foi recentemente desenvolvido para avaliar a força de estudos pré-clínicos. 9 Este esquema enfatizou a importância da utilização do modelo de SCI contusão grave. Aqui nós descrevemos um modelo desse tipo de contusão SCI grave com lesão volumes consistentes e resultados funcionais semelhantes às de modelos transecção. Este modelo pode ser utilizado como uma "prova de conceito" para estabelecer a eficácia do tratamento, tanto para a neuroprotecção e estratégias de neuro-regeneração.
A geração de uniforme contundente SCI continua sendo um desafio. Para a reprodutibilidade, é essencial que a lesão seja realizado o mais uniformemente possível. O nível alvo da medula espinhal, devem ser identificados de forma consistente from animal para animal. A remoção do osso durante a laminectomia deve ser feito com cuidado para garantir que não haja fragmentos de ossos são deixados no canal espinhal, estes podem causar ferimentos compressão e introduzir variações indesejadas em mecanismos de lesão e potencial de recuperação. Adotamos várias medidas para garantir a uniformidade incluindo o tamanho do pêndulo, a estabilização rígida da coluna em uma estrutura montada com braços estabilizadores, usando uma velocidade de impacto uniforme e profundidade de impactação. É importante que o rato é colocado confortavelmente quando a pinça de estabilização são presos aos corpos vertebrais. Quaisquer variações no alinhamento da coluna vertebral ou o excesso de estresse durante o aperto pode alterar a biomecânica do impacto. Utilizou-se um impactador de 2,5 mm visto que a dimensão média de medula espinal de rato na nossa região de interesse é de 2,5-3 mm. O tempo de contato ou habitar foi uniformemente fixada em 0,3 seg em nossos experimentos. No entanto, em nossa observação e relatos de outros laboratórios, para um modelo de grave SCI a profundidade do impacto é a mais crucialparâmetro. Nos experimentos descritos neste artigo o impacto foi entregue a uma profundidade constante de 2 mm. Outros fatores que afetam a uniformidade incluem treinamento de pessoal, visualização clara do tecido e ponta pêndulo para garantir impacto direto no tecido espinhal (e não as estruturas ósseas).
Os ratos devem ser constantemente observada durante o processo de sinais vitais necessárias mais importante da temperatura do núcleo e da respiração. A hipotermia é a principal causa de mortalidade durante e imediatamente após a administração de anestesia. Monitoramento da temperatura central com sonda retal e esquentadores apropriadas evitar esta complicação. Se a respiração torna-se irregular ou o animal deixa de respirar, o procedimento deve ser imediatamente interrompido até que a respiração retorna à linha de base. Dor excessiva e acidental ou superdosagem de dor e anestesia medicamento também pode resultar em problemas respiratórios. Os ratos devem ser cuidadosamente monitorizados após o procedimento. Sua woitos deve ser medido com precisão e uma perda de> 20% do peso inicial deve pedir uma investigação sobre a ingestão de alimentos e água, infecção do trato urinário, ruptura da pele, pós-SCI íleo, etc consulta precoce com o pessoal veterinário para avaliação e tratamento é fundamental em tais situações. Como discutido anteriormente, os ratos que não recuperaram o controlo da bexiga ao dia 14 deve ser iniciada para trás em antibióticos para evitar uma infecção no trato urinário potencialmente fatal.
Lesão da medula espinal pode ser induzida por recurso a um método de deslocamento ou o método de força constante. 5,12 A técnica descrita no presente documento é um método onde a força de deslocamento é entregue a profundidade fixa dentro do tecido da medula espinal. O uso de um pêndulo controlado por computador permite um nível de controlo que não é atingível pelos outros métodos comuns de SCI experimental. A técnica de compressão de grampo não permite, uma força contundente romba com libertação imediata, ao passo que o impacto NYUou depende da gravidade para determinar a força de contusão. Estas técnicas, embora reprodutível, não permite a simulação de condições encontradas durante um acidente de automóvel, a causa mais comum de SCI agudo em seres humanos. Estudos anteriores têm demonstrado que a gravidade da lesão está directamente correlacionada com a profundidade de impacto do que a velocidade do impacto. 7 Portanto, este modelo permite um SCI grave para ser realizada rotineiramente com o potencial para modificar a gravidade através de uma gama maior de combinações de força e de deslocamento .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nenhum divulgação financeira
Nenhum divulgação financiamento.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. N. Banik e Dr. D. Mitchell para a sua orientação no desenvolvimento deste modelo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
- Blesch, A., Tuszynski, M. H. Spinal cord injury: plasticity, regeneration and the challenge of translational drug development. Trends Neurosci. 32, 41-47 (2009).
- Dobkin, B. H. Curiosity and cure: translational research strategies for neural repair-mediated rehabilitation. Dev. Neurobiol. 67, 1133-1147 (2007).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J. Neurotrauma. 28, 1329-1333 (2011).
- Iseda, T., Okuda, T., Kane-Goldsmith, N., et al. Single, high-dose intraspinal injection of chondroitinase reduces glycosaminoglycans in injured spinal cord and promotes corticospinal axonal regrowth after hemisection but not contusion. J. Neurotrauma. 25, 334-349 (2008).
- Khan, T., Havey, R. M., Sayers, S. T., et al. Animal models of spinal cord contusion injuries. Laboratory Animal Science. 49, 161-172 (1999).
- Kim, B. G., Kang, Y. M., Phi, J. H., et al. Implantation of polymer scaffolds seeded with neural stem cells in a canine spinal cord injury model. Cytotherapy. 12, 841-845 (2010).
- Kim, J. H., Tu, T. W., Bayly, P. V., et al. Impact speed does not determine severity of spinal cord injury in mice with fixed impact displacement. Journal of Neurotrauma. 26, 1395-1404 (2009).
- Kwon, B. K., Hillyer, J., Tetzlaff, W. Translational research in spinal cord injury: a survey of opinion from the SCI community. J. Neurotrauma. 27, 21-33 (2010).
- Kwon, B. K., Okon, E. B., Tsai, E., et al. A grading system to evaluate objectively the strength of pre-clinical data of acute neuroprotective therapies for clinical translation in spinal cord injury. J. Neurotrauma. 28, 1525-1543 (2011).
- Norenberg, M. D., Smith, J., Marcillo, A. The pathology of human spinal cord injury: defining the problems. J. Neurotrauma. 21, 429-440 (2004).
- Siegenthaler, M. M., Tu, M. K., Keirstead, H. S. The extent of myelin pathology differs following contusion and transection spinal cord injury. J. Neurotrauma. 24, 1631-1646 (2007).
- Talac, R., Friedman, J. A., Moore, M. J., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25, 1505-1510 (2004).
- Tator, C. H. Review of treatment trials in human spinal cord injury: issues, difficulties, and recommendations. Neurosurgery. 59, 957-982 (2006).
