Summary
En kontusion modell av svår ryggmärgsskada beskrivs. Detaljerade preoperativ, operativ och postoperativ steg beskrivs för att erhålla en enhetlig modell.
Abstract
Den translationella potential av nya behandlingar bör utredas i svår ryggmärgsskada (SCI) kontusion modeller. En detaljerad metod beskrivs för att erhålla en enhetlig modell för svår SCI. Användning av en stereotaktisk ram och datorstyrd provkroppen möjliggör skapandet av reproducerbar skada. Hypotermi och urinvägsinfektion utgöra betydande utmaningar i den postoperativa perioden. Noggrann övervakning av djur med daglig vikt inspelning och urinblåsa uttryck möjliggör tidig upptäckt av postoperativa komplikationer. De funktionella resultaten av denna kontusion modell motsvarar transektion modeller. Den kontusion Modellen kan användas för att utvärdera effekten av både nervfibrer som neuroregenerative metoder.
Introduction
Val av lämplig skador modell är avgörande för preklinisk utvärdering av nya behandlingsmetoder för ryggmärgsskada (SCI). 1,2,13 I en nyligen genomförd undersökning av läkare och forskare inom området neurotrauma kontusion modell, till skillnad hemisection eller kompletta modeller transektion , var allmänt accepterat att vara kliniskt relevant. 8 Denna åsikt är baserad på observationen att majoriteten av ryggmärgsskada hos människa är Contusive i naturen. 10 biologi kontusion förefaller också att vara annorlunda från hemisection eller transektion modeller. 11 Iseda, et al. jämförde effekten av intraspinal kondroitinas ABC injektion på neuroregeneration separat i hemisection och modeller kontusion. observerades i den neuronala bron i hemisection men inte kontusion SCI grupp 4 axonal återbildning. Den hemisection eller kompletta modeller transektion skapar också förutsättningar är kända för att existera i endast en mycket liten delmängd av CLinical omständigheter. Till exempel har flera forskare anställda byggnadsställning-baserade interventioner för implantation i lesionen hålrum efter hemisection eller fullständig transection att främja regenerering. 6 Denna metod blir kliniskt irrelevant eftersom skapandet av en hålighet i skadade ryggmärgen är opraktisk och förmodligen oetiskt.
Variationen i funktionell återhämtning är fortfarande en stor utmaning för kontusion modellerna. 5,12 Denna variation kan minimeras genom användning av datorstyrda provkroppen och stabilisering av ryggraden innan effekterna för jämn kraft leverans över hela ryggmärgen volymen speciellt ventralt belägna motoriska banor . Det bör noteras att plasticitet och säkerheter bidrag från överlevande axoner är den dominerande mekanismen för återhämtning efter ryggmärgsskada. 1 därför även mindre variationer i kontusion teknik kan ge helt olika resultat. För detta ändamål har vi utvecklaten modell av svår ryggmärgsskada som ger konsekvent kontusion volym och funktionell återhämtning jämförbar med transektion modeller. Denna modell kan användas för att undersöka både neuroprotection och strategier neuroregeneration som ett proof of concept för behandling effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Förberedelse Innan ryggmärgsskada
De kirurgiska instrument som krävs för detta förfarande är skalpell, pickuper med och utan tänder, peanger, självhÇllande upprullningsdon, fina rongeurs spets, nål förare, absorberbara suturer och huden applikatorer klipp. Andra kirurgiska varor som erfordras är kirurgiska dukar, sterila lakan för kirurgiska området, svampar gasbinda, bomull-tip applikatorer, och metallfolie. Autoklaveras kirurgiska instrument och före det kirurgiska ingreppet. Använd individuella uppsättning av instrument och tillbehör för ett djur. Rengör kirurgiska området och apparater (provkroppen, ljuskälla, stereotaktisk ram, glaspärla autoklaver och värmedynor) med alkohol våtservetter.
Öppna kirurgiska dukar och använder sterila handskar för att drapera det kirurgiska området nogsamt undvika kontaminering. Öppna de enskilda instrumenten sterilt och försiktigt placera dem i det kirurgiska området. Täck knoppar och handtag av the apparatur behövs sannolikt under förfarandet med den sterila metallfolie. Switch-on glaset pärla autoklav för att vara redo för användning under förfarandet.
2. Förberedelse av djuren
Ta råttorna till laboratoriet området några tim innan själva proceduren. Administrera smärtstillande minst en timme före förväntad förfarande (typiskt buprinorphine 1,5 ml av 0,006 mg / ml subkutant). Administrera preoperativa antibiotika (typiskt Baytril 4 mg / kg subkutant). Söva råttorna med 90 mg / kg av ketamin och vänta tills det finns ingen toe-nypa respons. Palpera den mest framträdande taggutskottet i bröstryggraden. Denna nivå motsvarar vanligtvis med T10 taggutskottet. Markera platsen för avsedd nivå i förhållande till T10. I vårt labb utför vi en T10 skada. Följande berättelse beskriver tekniken med T10 SCI. Shave a 3 cm x 6 cm rektangel längdled och centrerad på T10 nivå. Rengör huden tre gånger with Betadine-lösning. Applicera oftalmologiska smörjmedel på varje öga. Överför råttan i en bekväm ställning till det kirurgiska området nogsamt undvika kontaminering. Sätt en rektal temperatur sond för att övervaka kärntemperatur och justera värme följaktligen att hålla djur temperatur så nära normal (~ 37,5 ° C) som möjligt. Täck råttan med ett operationslakan med ett fönster ovanför operationsområdet.
Tre. Kirurgisk procedur
Börja med en ungefärlig 4 cm snitt med en # 10 blad centrerad på T10 märket. Fortsätt att tålmodigt dissekera fascia och lager muskler ifrån T9-T11 spinous processer och lameller. Placera upprullningsdon att dra muskeln och fascia bort från benet. Medan stabilisera taggutskottet av T9 kraftigt dela interspinous ligamentet mellan T9 och T10 med fina sax. Likaså stabilisera T10 taggutskottet och dela interspinous ligament mellan T10-T11. Använd slinga förstoringen att kompletterate uppdelningen av ligament hela vägen genom ligamentum flavum (Figur 1). Den tekalsäcken är uppenbart när ligamentum flavum är bortkopplad. Använd fin spets rongeurs att noggrant utföra punktinsatser laminektomi bilateralt vid T10. Yttersta försiktighet iakttas för att undvika en press nedåt på tekalsäcken och oavsiktlig skada från rongeur tips. Lamina och taggutskottet av T10 är helt bort.
Flytta djuret på plats på stabilisering plattform. Använd stabiliserande klämmor för att fixera ryggraden genom att klämma de laterala aspekterna av T11 kotkroppen följt av de laterala aspekterna av T9 kotkroppen. Var noga med att inte komprimera råttan i plattformen med de stabiliserande klämmor eftersom detta skulle begränsa utrymmet för respiratoriska rörelser och lägga oönskade stress djuret. Efter att ha säkrat ryggradsdelarna inställningarna på den datorstyrda provkroppen är markerade. Vi använder typiskt provkroppens spetsen av 3,0 mm vid ett speed av 4 cm / s med ett djup på 2 mm och en uppehållstid av 0,3 sek. Förläng provkroppen spets och sänk den tills den precis vidrör sladden ytan. Dra in spetsen och sänka anordningen 2 mm mot ryggmärgen yta. Släpp kolven vid 4 cm / s för att orsaka svår kontusion ryggmärgsskada. Uppnå hemostas med bara tillräckligt tryck för att hålla bomullen-tip applikator på plats, var noga med att inte skapa onödig press på sladden. Sutur muskler och skikten fascia med en siffra-8 stygn försiktigt så att inte dra för hårt med absorberbara suturer. Stäng huden med ett minimum av två små häftklamrar, upp till 4 eller 5 häftklamrar kan användas om delar av snittet förblir öppna efter de första två eller tre häftklamrar.
Tre. Post-förfarande Care
Placera råttor i en varm miljö av ca 33 till 35 ° C under 24 h efter kirurgi. Detta innebär en inkubator (medan de är medvetslösa) och en uppvärmd bur utrymme när de börjar röra sig. När råttorna är helt awake, administrera 5 ml saltlösning, 1,5 ml (0,006 mg / ml) av buprinorphine, och 0,1 ml Baytril alla subkutant. Fortsätt med buprinorphine subkutant två gånger per dag för första 24-48 h och Baytril en gång om dagen i 7 dagar. Blåsor bör manuellt uttryckas tre gånger om dagen tills återgång av urinblåsans funktion (<2 ml urin i tidigt på morgonen uttryck för 3 dagar i följd). Djur bör också kontrolleras under denna tid för infektion (blod i urinen, vitaktig färg, eller dålig lukt), minskad fysisk aktivitet eller problem med sårläkning. Närvaro av infektion bör bemötas med en ökad dos (eller återinsättande) av antibiotika i samråd med lokala veterinärer. Väg råttor dagligen börjar dagen efter operationen för att bedöma deras tillfrisknande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lesion Volym
Vi har erhållit stora och jämna lesion volymer genom att följa den teknik som beskrivs ovan. Med hjälp av en Luxol snabb blå färgning av ett medelvärde lesion volym av 2,04 mm 3 (95% CI 1,9-2,18) (n = 5 djur) erhölls. Figur 2 visar medelpoäng för lesion volym med en representativ färgning med Luxol snabb blå genom lesionen epicentrum.
Funktionella Scores
De beteendemässiga poäng mätt med Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) skalan visas i figur 3. Vid 12 veckor råttorna i kontrollgruppen uppnådde en genomsnittlig BBB poäng av 2,2 ± 1,1 (n = 10 djur).
Andra Parametrar
Baserat på vår senaste erfarenhet med 32 djur operationer överlevnaden av denna teknik är 93,4%. Alla mortaliteten var relaterade till ihärdig urinvägsinfektion (UVI) följt av djuroffer för att undvika överdriven smärta och lidande. Efter avslutad kurs av antibiotika i 7 dagar 16,7% djuren utvecklade UVI. Det genomsnittliga antalet dagar för detektion av UVI postoperativ var 14,6 ± 7,6 dagar. Intressant djuren uppnått blåskontroll i medeltal 13 dagar efter skadan (medelvärde 13,33 ± 3,6 dagar). Råttor som utvecklade UVI tog längre tid att uppnå blåskontroll jämfört med råttorna utan UVI (blåskontroll hos råttor med UVI - 16 ± 1 dagar kontra 12,8 ± 3,7 dagar för blåskontroll hos råttor utan UVI, p = 0,03). I kohorten som uppnått blåskontroll inom 14 dagar utan efterföljande UVI upptäcktes. Såsom visas i figur 4, det fanns en ursprunglig vinst i vikt efter SCI sannolikt från vätskeretention. Vikten sjönk därefter och stabiliserade på en lägre nivå (ca 10-12% lägre än utgångsvärdet) i cirka 10 dagar.
/ Files/ftp_upload/50111/50111fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Vertebral anatomi råtta från bakre snitt (vänster) visar spinalutskotten och lameller. Positionen för ligamentum flavum (LF) är avbildat i utrymmet mellan laminaten. Mid-saggital sektion (höger) som visar den relativa positionen för ligamentum flavum och interspinous ligament i förhållande till ryggmärgen.
Figur 2. Stapeldiagram som visar lesion volym (i mm 3, Y-axel) hos djur som erhållit allvarlig ryggmärgsskada (vänster). En representativ längdsnitt genom skada epicenter efter Luxol snabb blå färgning (höger).
g3highres.jpg "/>
Figur 3. Mean BBB (Y-axeln) poäng av råttorna under loppet av 3 månaders uppföljning (X-axeln) visar minimal återhämtning typisk för svår SCI.
Figur 4. Linje diagram som visar variationen i dagliga vikt (i g, Y-axel) av råttor över två veckor (X-axeln) efter induktion av ryggmärgsskada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera nya behandlingar har nyligen visat tidigt löfte inom SCI forskning. 3 Noggrann utvärdering av dessa behandlingar är viktigt i kliniskt relevant modell av SCI att välja strategier med maximal translationell potential. Ett system för betygssättning har nyligen utvecklats för att utvärdera styrkan i prekliniska studier. Detta system betonas vikten av att använda kontusion modell av svår SCI 9. Här beskriver vi en sådan kontusion modell av svår SCI med konsekventa lesion volymer och funktionella ställningar påminner om transektion modeller. Denna modell kan användas som ett "proof of concept" för att fastställa behandlingens effektivitet både för neuroprotection och strategier neuroregeneration.
Den generation av enhetliga Contusive SCI fortsatt utmanande. För reproducerbarhet, är det viktigt att skadan skall utföras så enhetligt som möjligt. Den målsatta nivån av ryggmärgen måste identifieras konsekvent frOM djur till djur. Borttagning av benet under laminektomi bör göras noggrant för att säkerställa att inga benfragment kvar i ryggmärgskanalen, dessa kan orsaka kompression skada och införa oönskade variationer i skademekanismer och återvinning potential. Vi har antagit flera åtgärder för att säkerställa enhetlighet, inklusive storleken på provkroppen, stel stabilisering av ryggraden på en ram med monterad stabiliserande armar, med en jämn effekt hastighet och djup impaktion. Det är viktigt att råttan placeras bekvämt när de stabiliserande pincett är fastklämda till kotkropparna. Eventuella variationer i spinal anpassning eller överskott stress under fastspänning kan ändra biomekanik påverkan. Vi använde en 2,5 mm provkroppen eftersom den genomsnittliga storleken på råttryggmärg i vår region av intresse är 2.5-3 mm. Kontakttiden eller uppehållstiden har likformigt satt till 0,3 sek i våra experiment. Men i vår observation och rapporter från andra labb, för en svår modell av SCI djupet av effekten är den mest avgörandeparameter. I de experiment som beskrivs i detta dokument effekterna levererades på ett konstant djup av 2 mm. Andra faktorer som påverkar enhetlighet inkluderar utbildning av personal, tydlig visualisering av vävnaden, och pendelns spets för att garantera direkt inverkan på sladden vävnaden (och inte de beniga strukturerna).
Råttorna bör ständigt beaktas under förfarandet för nödvändiga vitala viktigast kärntemperatur och andning. Hypotermi är den ledande orsaken till dödlighet under och omedelbart efter anestesi administrering. Övervakning av kärntemperaturen med rektal sond och lämpliga värmedynor kommer att undvika denna komplikation. Om andningen blir oregelbunden eller djuret slutar att andas, ska proceduren omedelbart stoppas tills andning återgår till baslinjen. Överdriven smärta och eller oavsiktlig överdosering av smärta och bedövningsmedel medicinering kan också leda till andningsproblem. Råttorna ska övervakas noga efter ingreppet. Deras wåttor bör mätas exakt och en förlust på> 20% från utgångsvärdet vikt bör föranleda en utredning mat och vatten intag, urinvägsinfektion, nedbrytning av huden, post-SCI ileus, etc. Tidigt samråd med veterinärmedicinsk personal för bedömning och behandling är avgörande i sådana situationer. Som diskuterats tidigare, bör råttor som inte har återfått blåskontroll vid dag 14 startas igen på antibiotika för att undvika en potentiellt dödlig infektion urinvägarna.
Ryggmärgsskada kan induceras av antingen ett deplacement metod eller konstant kraft metoden. 5,12 Den teknik som beskrivs i detta dokument är förskjutningsmetod där kraften levereras till fast djup i ryggmärg. Användningen av en datorstyrd Provkroppen möjliggör en nivå av kontroll som är inte uppnås av andra vanliga metoder för experimentell SCI. Klippet komprimering tekniken tillåter inte en trubbig, Contusive kraft med omedelbar frisättning, medan NYU påverkaneller beror på gravitationen för att bestämma kraft kontusion. Dessa tekniker även reproducerbar, tillåter inte simulering av förhållanden som förekommer vid en trafikolycka, den vanligaste orsaken till akut SCI hos människor. Tidigare studier har visat att skadornas svårighetsgrad är direkt korrelerad med djup inverkan än hastigheten för påverkan. 7 Därför denna modell möjliggör en svår SCI att rutinmässigt med potential att ändra svårighetsgraden genom ett större utbud av kombinationer av kraft och förskjutning .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Finansiell avslöjande ingen
Finansiering avslöjande ingen.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma till Dr N. Banik och Dr D. Mitchell för deras vägledning i utvecklingen av denna modell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
- Blesch, A., Tuszynski, M. H. Spinal cord injury: plasticity, regeneration and the challenge of translational drug development. Trends Neurosci. 32, 41-47 (2009).
- Dobkin, B. H. Curiosity and cure: translational research strategies for neural repair-mediated rehabilitation. Dev. Neurobiol. 67, 1133-1147 (2007).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J. Neurotrauma. 28, 1329-1333 (2011).
- Iseda, T., Okuda, T., Kane-Goldsmith, N., et al. Single, high-dose intraspinal injection of chondroitinase reduces glycosaminoglycans in injured spinal cord and promotes corticospinal axonal regrowth after hemisection but not contusion. J. Neurotrauma. 25, 334-349 (2008).
- Khan, T., Havey, R. M., Sayers, S. T., et al. Animal models of spinal cord contusion injuries. Laboratory Animal Science. 49, 161-172 (1999).
- Kim, B. G., Kang, Y. M., Phi, J. H., et al. Implantation of polymer scaffolds seeded with neural stem cells in a canine spinal cord injury model. Cytotherapy. 12, 841-845 (2010).
- Kim, J. H., Tu, T. W., Bayly, P. V., et al. Impact speed does not determine severity of spinal cord injury in mice with fixed impact displacement. Journal of Neurotrauma. 26, 1395-1404 (2009).
- Kwon, B. K., Hillyer, J., Tetzlaff, W. Translational research in spinal cord injury: a survey of opinion from the SCI community. J. Neurotrauma. 27, 21-33 (2010).
- Kwon, B. K., Okon, E. B., Tsai, E., et al. A grading system to evaluate objectively the strength of pre-clinical data of acute neuroprotective therapies for clinical translation in spinal cord injury. J. Neurotrauma. 28, 1525-1543 (2011).
- Norenberg, M. D., Smith, J., Marcillo, A. The pathology of human spinal cord injury: defining the problems. J. Neurotrauma. 21, 429-440 (2004).
- Siegenthaler, M. M., Tu, M. K., Keirstead, H. S. The extent of myelin pathology differs following contusion and transection spinal cord injury. J. Neurotrauma. 24, 1631-1646 (2007).
- Talac, R., Friedman, J. A., Moore, M. J., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25, 1505-1510 (2004).
- Tator, C. H. Review of treatment trials in human spinal cord injury: issues, difficulties, and recommendations. Neurosurgery. 59, 957-982 (2006).
