Summary
Un modèle de contusion de la lésion médullaire sévère est décrite. Les étapes détaillées pré-opératoire, opératoires et post-opératoires sont décrits pour obtenir un modèle cohérent.
Abstract
Le potentiel de translation de nouveaux traitements devrait être étudiée dans de graves blessures à la moelle épinière (SCI) des modèles de contusions. Une méthodologie détaillée est décrite afin d'obtenir un modèle cohérent de graves SCI. Utilisation d'un cadre stéréotaxique et de frappe commandé par ordinateur permet la création d'un dommage reproductible. L'hypothermie et les infections des voies urinaires posent des défis importants dans la période post-opératoire. Une surveillance attentive des animaux avec l'enregistrement de poids quotidien et l'expression de la vessie permet la détection précoce des complications post-opératoires. Les résultats fonctionnels de ce modèle de contusion sont équivalentes aux modèles de transsection. Le modèle de contusion peut être utilisé pour évaluer l'efficacité de deux approches neuroprotectrices et neurorégénérative.
Introduction
Choix du modèle de blessure appropriée est cruciale pour l'évaluation préclinique de nouveaux traitements pour les blessures de la moelle épinière (SCI). 1,2,13 Dans un récent sondage de médecins et de scientifiques dans le domaine de modèle de contusion traumatisme neurologique, par opposition à hemisection ou modèles de section complète , a été universellement considéré comme cliniquement pertinente. 8 Cette opinion est fondée sur le constat que la majorité des blessures de la moelle épinière chez l'homme est contondant dans la nature. 10 La biologie de contusion semble également être différents des modèles de Hémisection ou résection. 11 Iseda, et al. comparé l'effet de l'injection intra-rachidienne chondroitinase ABC sur neurorégénération séparément dans hemisection et modèles de contusions. 4 régénération axonale a été observée dans le pont neuronal dans hemisection mais pas le groupe SCI de contusion. Le hemisection ou modèles de section complète créent également des conditions connues pour exister que dans un très petit sous-ensemble de clinical circonstances. Par exemple, plusieurs chercheurs ont utilisé des interventions échafaudage à base d'implantation dans la cavité lésion après hemisection ou section complète pour favoriser la régénération. 6 Cette approche devient cliniquement pertinente parce que la création d'une cavité à l'intérieur de la moelle épinière lésée est irréaliste et probablement contraire à l'éthique.
La variabilité de la récupération fonctionnelle reste un défi majeur pour les modèles de contusions. 5,12 Cette variabilité peut être minimisée par l'utilisation de l'impacteur contrôlé par ordinateur et à la stabilisation de la colonne vertébrale avant l'impact pour la livraison de force uniforme à travers le volume de la moelle épinière en particulier les des voies motrices ventrale situés . Il faut noter que la plasticité et la contribution de garanties de la part des axones survivants est le mécanisme prédominant de récupération après une lésion de la moelle épinière. 1 variations conséquent, même mineures dans la technique de contusion peuvent donner des résultats très différents. À cette fin, nous avons développéun modèle de lésion de la moelle épinière sévère qui donne le volume de contusion cohérente et la récupération fonctionnelle comparable aux modèles de transsection. Ce modèle peut être utilisé pour étudier à la fois la neuroprotection et les stratégies de Neuroregeneration comme une preuve de concept de l'efficacité du traitement.
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Protocol
1. Préparation avant la lésion de la moelle épinière
Les instruments chirurgicaux nécessaires à cette procédure sont scalpel, micros avec et sans dents, pinces hémostatiques, écarteurs autostatique, Rongeurs pointe fine, le conducteur de l'aiguille, les sutures absorbables et applicateurs de clips de la peau. D'autres fournitures chirurgicales requises sont draps chirurgicaux, draps stériles pour champ opératoire, des éponges de gaze, applicateurs coton-tip, et une feuille métallique. Autoclave des instruments chirurgicaux et des fournitures avant la chirurgie. Utilisez le jeu individuel d'instruments et de fournitures pour un animal. Nettoyez la zone et un appareil (impacteur, de source de lumière, cadre stéréotaxique, billes de verre stérilisateurs et coussins chauffants) avec tampons imbibés d'alcool chirurgical.
Ouvrez les draps chirurgicaux et utiliser des gants stériles pour draper le champ opératoire en évitant soigneusement de contamination. Ouvrez les instruments individuels stérile et placer soigneusement ceux dans le domaine chirurgical. Couvrir les boutons et les poignées de thAppareil d'électronique susceptible nécessaire au cours de la procédure avec la feuille métallique stérile. Mettre en marche la stérilisateur à billes de verre pour être prêt à l'emploi au cours de la procédure.
2. Préparation des animaux
Apportez les rats à la zone laboratoire quelques heures avant l'intervention réelle. Administrer des médicaments de la douleur d'au moins une heure avant la procédure prévue (généralement buprinorphine 1,5 ml de 0,006 mg / ml sous-cutanée). Administrer des antibiotiques préopératoires (typiquement Baytril 4 mg / kg sous-cutanée). Anesthésier les rats à l'aide de 90 mg / kg de kétamine et d'attendre jusqu'à ce qu'il n'y a pas de réponse toe-pincement. Palper l'apophyse épineuse plus important au niveau du rachis thoracique. Ce niveau correspond généralement à T10 apophyse épineuse. Marquez l'emplacement du niveau prévu par rapport à T10. Dans notre laboratoire, nous effectuons une blessure T10. Le récit qui suit décrit la technique de T10 SCI. Raser un cm x 6 cm rectangle 3 longitudinalement et centrée au niveau T10. Nettoyer la peau trois fois wisolution de Betadine ème. Appliquer du lubrifiant ophtalmique sur chaque œil. Transférez le rat dans une position confortable pour le champ opératoire en évitant soigneusement de contamination. Insérer une sonde de température rectale à surveiller la température d'âme et d'ajuster en conséquence le chauffage pour maintenir la température des animaux est proche de la normale (~ 37,5 ° C) que possible. Recouvrir le rat avec un champ opératoire avec une fenêtre au-dessus du site chirurgical.
3. Procédure chirurgicale
Commencez avec une participation d'environ 4 cm incision à l'aide d'une lame # 10 centré sur la marque T10. Passez à disséquer patiemment fascia et les couches musculaires loin des apophyses épineuses T9-T11 et limbes. Placez les rétracteurs de rétracter les muscles et fascia loin de l'os. Alors que la stabilisation de l'apophyse épineuse de T9 fortement diviser le ligament interépineux entre T9 et T10 à l'aide de ciseaux fins. De même stabiliser l'apophyse épineuse T10 et diviser le ligament interépineux entre T10-T11. Utilisez une lentille de grossissement à compléterontte la division des ligaments tout au long du ligament jaune (Figure 1). Le sac dural est évidente une fois le ligament jaune est débranché. Utilisez rongeurs de pointe fine pour effectuer soigneusement laminectomie fragmentaire bilatérale au T10. Le plus grand soin est pris pour éviter une pression à la baisse sur le sac dural et blessures involontaires des conseils de rongeur. La lame et apophyse épineuse de T10 est complètement enlevé.
Déplacez l'animal en position sur plate-forme de stabilisation. Utiliser des brides de stabilisation pour immobiliser la colonne vertébrale par serrage des faces latérales du corps vertébral T11 suivie par les aspects latéraux du corps vertébral T9. Veillez à ne pas comprimer le rat dans la plate-forme avec les pinces de stabilisation car cela restreindrait espace pour les mouvements respiratoires et ajouter du stress indésirable l'animal. Après avoir sécurisé les paramètres de la colonne vertébrale sur l'impacteur contrôlé par ordinateur sont vérifiés. Nous utilisons généralement pointe de frappe de 3,0 mm à une spEED de 4 cm / s avec une profondeur de 2 mm et un temps de séjour de 0,3 s. Etendre la pointe du pendule et l'abaisser jusqu'à ce qu'il touche la surface de la moelle. Rétracter la pointe et abaisser le dispositif de 2 mm vers la surface de la moelle épinière. Relâchez piston à 4 cm / s pour provoquer une contusion sévère blessure à la moelle épinière. Atteindre l'hémostase avec juste assez de pression pour maintenir l'applicateur coton-tige en place, en faisant attention de ne pas créer une pression inutile sur le cordon. muscle de suture et des couches de fascia avec un chiffre 8 point en faisant attention à ne pas tirer le trop serré par des sutures absorbables. Fermer la peau avec un minimum de 2 petites agrafes; jusqu'à 4 ou 5 agrafes peuvent être utilisés si une partie de l'incision restent ouvertes après les 2 ou 3 premières agrafes.
3. Soins post-procédure
Placer les rats dans un environnement chaleureux d'environ 33-35 ° C pendant 24 heures après la chirurgie. Cela implique un incubateur (alors qu'ils sont inconscients) et un espace de cage chauffée dès qu'ils commencent à bouger. Une fois que les rats sont entièrement awake, administrer 5 ml de solution saline, 1,5 ml (0,006 mg / ml) de buprinorphine, et 0,1 ml de Baytril tout sous-cutanée. Continuer avec buprinorphine voie sous-cutanée deux fois par jour pendant 24-48 premières heures et Baytril une fois par jour pendant 7 jours. Vessies doivent être exprimées manuellement trois fois par jour jusqu'au retour de la fonction vésicale (<2 ml d'urine dans l'expression du matin pendant 3 jours consécutifs). Les animaux doivent également être vérifiés durant cette période d'infection (sang dans les urines, la couleur blanchâtre, ou une mauvaise odeur), diminution de l'activité physique ou des problèmes de cicatrisation. Présence d'une infection doit être contré avec un dosage augmenté (ou ré-initiation) d'antibiotiques en consultation avec les vétérinaires locaux. Peser les rats commencent quotidien le lendemain de l'intervention pour évaluer leur récupération.
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Representative Results
Lésion Volume
Nous avons obtenu de grands volumes et cohérente des lésions en suivant la technique décrite ci-dessus. L'utilisation d'un Luxol rapide coloration au bleu un volume moyen de lésion de 2,04 mm 3 (CI 01.09 au 02.18 95%) (n = 5 animaux) a été obtenue. Figure 2 montre signifie volume de la lésion avec une coloration représentative en utilisant Luxol bleu rapide grâce à l'épicentre de la lésion.
Les scores fonctionnels
Les scores comportementaux tels que mesurés par le Bresnahan (BBB) échelle Basso, Beattie, sont présentés dans la figure 3. À 12 semaines, les rats du groupe contrôle ont obtenu une note moyenne de 2,2 Bureau ± 1,1 (n = 10 animaux).
Autres paramètres
Basé sur notre expérience la plus récente avec 32 cabinets d'animaux le taux de survie de cette technique est de 93,4%. Tous les taux de mortalité étaient liés à une infection des voies urinaires persistants (UTI), suivie par le sacrifice d'animaux pour éviter douleur et la souffrance excessive. Après avoir terminé la cure d'antibiotiques pendant 7 jours 16,7% animaux ont développé des infections urinaires. Le nombre moyen de jours pour la détection des infections urinaires post-opératoire était de 14,6 ± 7,6 jours. Fait intéressant, les animaux atteints contrôle de la vessie sur la moyenne 13 jours après la lésion (moyenne 13,33 ± 3,6 jours). Les rats qui ont développé une infection urinaire pris plus de temps pour obtenir un contrôle de la vessie comparativement aux rats sans UTI (contrôle de la vessie chez les rats avec UTI - 16 ± 1 jours versus 12,8 ± 3,7 jours pour le contrôle de la vessie chez les rats sans UTI, p = 0,03). Dans la cohorte qui atteint le contrôle de la vessie dans les 14 jours aucune infection urinaire ultérieure n'a été détectée. Comme le montre la figure 4, il y avait un gain initial de poids après SCI susceptibles de rétention d'eau. Le poids par la suite diminué et s'est stabilisé à un niveau inférieur (environ 10-12% inférieur à celui de référence) dans environ 10 jours.
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Figure 1. Anatomie vertébrale de rat de la voie d'abord postérieure (à gauche) démontrant les apophyses épineuses et des feuilles de plastique. La position du ligament jaune (LF) est représenté dans l'espace entre les lames. Section mi-sagittale (à droite) montrant la position relative du ligament jaune et le ligament inter-épineux par rapport à la moelle épinière.
Figure 2. Diagramme à barres montrant le volume de la lésion (en mm 3, l'axe Y) chez les animaux recevant une lésion médullaire sévère (à gauche). Une section longitudinale représentant à travers épicentre de blessure après coloration au bleu rapide Luxol (à droite).
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Figure 3. BBB (axe Y) score des rats au cours du 3 mois de suivi (axe X) démontrant récupération minimale typique d'une grave SCI moyenne.
Figure 4. diagramme linéaire montrant les variations de poids par jour (g, axe Y) de rats sur une durée de 2 semaines (axe X) après l'induction de lésions de la moelle épinière.
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Discussion
Plusieurs nouveaux traitements ont récemment révélé prometteur dans le domaine de la recherche SCI. 3 évaluation minutieuse de ces traitements est essentielle dans le modèle cliniquement pertinent de la SCI à choisir des stratégies à fort potentiel de translation maximum. Un système de notation a été récemment mis au point pour évaluer la force des études précliniques. 9 Ce schéma a souligné l'importance d'utiliser le modèle de contusion sévère SCI. Nous décrivons ici un tel modèle de contusion sévère SCI avec des volumes de lésion et une scores fonctionnels ressemblant à ceux des modèles de transsection. Ce modèle peut être utilisé comme une «preuve de concept» pour établir l'efficacité d'un traitement à la fois pour la neuroprotection et les stratégies de Neuroregeneration.
La génération de l'uniforme contondante SCI reste difficile. Pour la reproductibilité, il est essentiel que le dommage doit être effectuée de manière aussi uniforme que possible. Le niveau cible de la moelle épinière doit être identifié systématiquement from animal à animal. Retrait de l'os au cours de la laminectomie doit être fait avec soin afin de s'assurer qu'aucun des fragments d'os sont laissés dans le canal rachidien, ceux-ci pourraient causer des blessures de compression et introduire des variations indésirables dans les mécanismes de blessure et le potentiel de récupération. Nous avons adopté plusieurs mesures pour garantir l'uniformité y compris la taille d'élément de frappe, la stabilisation de la colonne vertébrale rigide sur un cadre avec montés bras de stabilisation, en utilisant une vitesse d'impact uniforme et la profondeur de l'impaction. Il est important que le rat se positionner confortablement lorsque la pince de stabilisation sont serrés sur les corps vertébraux. Toutes les variations dans l'alignement spinal ou l'excès de stress lors du serrage peuvent modifier la biomécanique de l'impact. Nous avons utilisé un impacteur 2,5 mm depuis la taille moyenne de moelle épinière de rat dans notre région d'intérêt est de 2,5-3 mm. Le temps de contact ou habiter a été uniformément fixé à 0,3 s dans nos expériences. Cependant, dans notre observation et les rapports d'autres laboratoires, pour un modèle sévère de la SCI de la profondeur de l'impact est le plus crucialparamètre. Dans les expériences décrites dans cet article l'impact a été livré à une profondeur constante de 2 mm. D'autres facteurs affectant l'uniformité comprennent la formation du personnel, la visualisation claire du tissu, et la pointe de percuteur pour assurer un impact direct dans le tissu du cordon (et non les structures osseuses).
Les rats doivent être constamment observé au cours de la procédure de signes vitaux nécessaires le plus important de la température à cœur et de la respiration. L'hypothermie est la principale cause de mortalité pendant et immédiatement après l'administration de l'anesthésie. Surveillance de la température centrale avec une sonde rectale et coussins chauffants appropriés permettra d'éviter cette complication. Si la respiration devient irrégulière ou l'animal cesse de respirer, la procédure doit être arrêté immédiatement jusqu'au retour de la respiration à l'état initial. Douleur excessive et ou par inadvertance sur la dose de douleur et anesthésique peuvent également entraîner des problèmes respiratoires. Les rats doivent être attentivement suivis post-procédure. Leur whuit doivent être mesurés avec précision et une perte de> 20% du poids de base devraient inciter une enquête sur l'alimentation et la prise d'eau, infection des voies urinaires, des lésions cutanées, post-SCI iléus, etc consultation préalable avec le personnel vétérinaire d'évaluation et de traitement est crucial dans de telles situations. Comme indiqué précédemment, les rats qui n'ont pas repris le contrôle de la vessie par jour 14 devraient être lancés en arrière sur les antibiotiques pour éviter une infection des voies urinaires potentiellement mortelle.
Lésions de la moelle épinière peut être induite soit par une méthode de déplacement ou de méthode à force constante. 5,12 La technique décrite dans ce document est la méthode de déplacement où la force est livré à une profondeur fixe dans les tissus de la moelle épinière. L'utilisation d'un élément de frappe commandé par ordinateur permet à un niveau de contrôle qui n'est pas réalisable par les autres méthodes courantes d'expérimentation SCI. La technique de compression du plan-séquence ne permet pas, une force contondante émoussé à libération immédiate, alors que l'impact NYUou dépend de la gravité pour déterminer la force de contusion. Ces techniques bien reproductible, ne permettent pas de simuler les conditions rencontrées lors d'un accident de véhicule à moteur, la cause la plus fréquente de la SCI aiguë chez les humains. Des études antérieures ont montré que la gravité de la blessure est directement corrélée avec la profondeur de l'impact de la vitesse d'impact. 7 C'est pourquoi ce modèle permet une sévère SCI à effectuer régulièrement avec la possibilité de modifier la gravité grâce à une plus grande gamme de combinaisons de force et le déplacement .
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Disclosures
Aucun dispositif de transparence financière
aucun de divulgation de financement.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr N. Banik et le Dr D. Mitchell pour leurs conseils dans l'élaboration de ce modèle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
- Blesch, A., Tuszynski, M. H. Spinal cord injury: plasticity, regeneration and the challenge of translational drug development. Trends Neurosci. 32, 41-47 (2009).
- Dobkin, B. H. Curiosity and cure: translational research strategies for neural repair-mediated rehabilitation. Dev. Neurobiol. 67, 1133-1147 (2007).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J. Neurotrauma. 28, 1329-1333 (2011).
- Iseda, T., Okuda, T., Kane-Goldsmith, N., et al. Single, high-dose intraspinal injection of chondroitinase reduces glycosaminoglycans in injured spinal cord and promotes corticospinal axonal regrowth after hemisection but not contusion. J. Neurotrauma. 25, 334-349 (2008).
- Khan, T., Havey, R. M., Sayers, S. T., et al. Animal models of spinal cord contusion injuries. Laboratory Animal Science. 49, 161-172 (1999).
- Kim, B. G., Kang, Y. M., Phi, J. H., et al. Implantation of polymer scaffolds seeded with neural stem cells in a canine spinal cord injury model. Cytotherapy. 12, 841-845 (2010).
- Kim, J. H., Tu, T. W., Bayly, P. V., et al. Impact speed does not determine severity of spinal cord injury in mice with fixed impact displacement. Journal of Neurotrauma. 26, 1395-1404 (2009).
- Kwon, B. K., Hillyer, J., Tetzlaff, W. Translational research in spinal cord injury: a survey of opinion from the SCI community. J. Neurotrauma. 27, 21-33 (2010).
- Kwon, B. K., Okon, E. B., Tsai, E., et al. A grading system to evaluate objectively the strength of pre-clinical data of acute neuroprotective therapies for clinical translation in spinal cord injury. J. Neurotrauma. 28, 1525-1543 (2011).
- Norenberg, M. D., Smith, J., Marcillo, A. The pathology of human spinal cord injury: defining the problems. J. Neurotrauma. 21, 429-440 (2004).
- Siegenthaler, M. M., Tu, M. K., Keirstead, H. S. The extent of myelin pathology differs following contusion and transection spinal cord injury. J. Neurotrauma. 24, 1631-1646 (2007).
- Talac, R., Friedman, J. A., Moore, M. J., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25, 1505-1510 (2004).
- Tator, C. H. Review of treatment trials in human spinal cord injury: issues, difficulties, and recommendations. Neurosurgery. 59, 957-982 (2006).
