Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

التجريبية النقل المكورات الرئوية الإنسان

doi: 10.3791/50115 Published: February 15, 2013

Summary

التجريبية النقل المكورات الرئوية الإنسان تقدم نموذجا الطبيعية النقل ونموذج محتمل لاستخدامها في تطوير اللقاحات. هذه التقنية هي قيمة بعد معقدة وتنطوي على مخاطر السريرية من خلال تقديم الممرض إلى الإنسان. قمنا بتطوير بروتوكول مفصلة.

Abstract

التجريبية النقل المكورات الرئوية الإنسان (EHPC) مهم علميا لنقل البلعوم من المكورات على حد سواء هو المصدر الرئيسي للنقل والشرط المسبق للمرض الغازية. وهناك نموذج النقل تسمح بتحديد دقيق لليرتبط المناعية للحماية، وأثر تحصين النقل وتأثير ضغط المضيف على الممرض في محراب البلعوم. مزيد من أساليب الكشف النقل مفيدة في الدراسات الوبائية، بما في ذلك دراسات اللقاح، يمكن مقارنة.

هدف

ونحن نهدف إلى تطوير منصة EHPC هذا هو وسيلة آمنة ومفيدة للتكرار التي يمكن أن تستخدم لتحديد أسفل اللقاحات المرشحة المكورات الرئوية الرواية مع منع النقل كبديل للحصانة اللقاح التي يسببها. فإنه سيتم العمل على اختبار اللقاحات المرشحة وصفا لآليات التي تقوم عليها EHPC وحماية اللقاح من carriaجنرال الكتريك 1. لقاحات المكورات الرئوية الحالية ضد حماية الأطفال من الأمراض الغازية على الرغم من أن هناك حاجة ماسة لقاحات جديدة باسم لقاح الحالي لا يمنح الحماية الأمثل ضد غير bacteraemic الالتهاب الرئوي وكان هناك دليل على استبدال النمط المصلي مع المنظمات غير قاح الأنماط المصلية 2-4.

طريقة

نحن مع تطعيم S. علقت الرئوية في 100 ميكرولتر من المياه المالحة. سلامة هو عامل رئيسي في تطوير نموذج EHPC ويتحقق من خلال فحص مكثفة ورصد المتطوعين. لجنة السلامة التي تتكون من الأطباء والعلماء التي هي مستقلة عن الدراسة تقدم تعليقات موضوعية على أساس أسبوعي.

واللقاح الجرثومي هو موحدة ويتطلب أن يتم تلقيح أية منتجات حيوانية إلى المتطوعين (ذات أصل نباتي وسائل الإعلام والمالحة). الجرعات المطلوبة لاستعمار (10 4 -10 5) هي أقل بكثير ثان تلك المستخدمة في النماذج الحيوانية (10 7) 5. الكشف عن المكورات الرئوية النقل تتعزز وحدة عالية (مثالي> 10 مل) غسل الأنف وهذا هو المخاط نسبيا الحرة. وهذا البروتوكول تعامل مع أهم أجزاء من بروتوكول بدوره. هذه هي (أ) اختيار المتطوعين، (ب) إعداد اللقاح المكورات الرئوية، التلقيح (ج) و (د) متابعة و (ه) الكشف عن النقل.

النتائج

كان لدينا بروتوكول الحالية آمنة في أكثر من 100 متطوع في مجموعة من الجرعات باستخدام النمطين المصليين البكتيرية المختلفة 6. دراسة الجرعة تتراوح باستخدام S. حاليا الرئوية 6B و23F تجرى لتحديد الجرعة المثلى للنقل التلقيح 50٪. وهناك معدل توقع 50٪ من النقل تسمح للنموذج EHPC أن يكون حساسية عالية للنجاعة اللقاح مع أعداد دراسة صغيرة.

Protocol

1. التطوع اختيار وفحص

  1. ويتم تجنيد متطوعين أصحاء من خلال الإعلانات والملصقات على موقع جامعة وفقا لأبحاث والأخلاق التوجيه NHS اللجنة.
  2. معايير الاشتمال للمشاركة هي:
    1. البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 18-60 سنة.
    2. يتحدث الإنجليزية بطلاقة وقادرة على التواصل بسهولة من قبل كل من الهاتف المحمول والرسائل النصية.
  3. معايير الاستبعاد للمشاركة هي:
    1. اتصال وثيق مع الأفراد المعرضين لمخاطر (الأطفال والبالغين كبت المناعة،، كبار السن المزمنة اعتلال الصحة).
    2. تاريخ التدخين المدخن الحالي أو كبيرة (> 10 عاما حزمة).
    3. الربو أو غيرها من أمراض الجهاز التنفسي.
    4. الحمل.
    5. الحساسية للبنسلين أو أموكسيسيلين.
    6. الحالية بالتورط في آخر التجارب السريرية إلا إذا الرصد أو في غير التدخلية المرحلة.
    7. غير قادر على إعطاء موافقة مستنيرة تماما.
  4. زيارة الفحص الأولي، ما يقرب من أسبوع واحد قبل التلقيح، يتضمن تركيزا التاريخ السريرية والفحص السريري المستهدفة.
  5. إذا تم العثور على خلل غير المعترف بها سابقا، سيتم استبعاد المتطوعين من الدراسة وسوف يتم ترتيب التحقيق الملائمة من خلال الرعاية الصحية الأولية.
  6. خلال الفحص الأولي زيارة تعداد الدم الكامل يتم الحصول للتأكد من أن عدد خلايا بيضاء ضمن المعدل الطبيعي قبل الزيارة التلقيح. يتم تنفيذ A غسل الأنف لاستبعاد ناقلات المكورات الرئوية الطبيعية (انظر 6.1).
  7. قبل التلقيح، يتم تعليم المتطوعين على المخاطر التي تنطوي عليها المشاركة في الدراسة ويتم توفيرها مع حالات الطوارئ النشرة المريض، ميزان الحرارة الرقمي، أرقام الهاتف في حالات الطوارئ ودورة 3 ايام من أموكسيسيلين.

2. إعداد الأرصدة التلقيح

  1. ويجب أن يتم إعداد الأسهم التلقيح في بيئة نظيفة. يجب أن يستخدم إلا في ماصات استخدامد لإعداد اللقاح. ينبغي لجميع الزجاج والبلاستيك وير تكون معقمة. من المستحسن أن تكون مستعدة الأسهم التلقيح في غرفة مخصصة، وذلك باستخدام fumehood مخصصة وحاضنة.
  2. يتم تلقيح سلالات المكورات الرئوية في الصعود إلى لوحة أجار الدم. يتم تحضين لوحات في C ° 37 في 5٪ CO 2 ليلة وضحاها. في اليوم التالي تم كشط جميع البكتيريا من الدم وأجار لوحة تلقيح في نظام الأوراق المالية الحفاظ حبة. وتستخدم هذه الاسهم حبة لإعداد الأسهم التلقيح. اختبار الأسهم حبة للتلوث والتوحيد مستعمرة قبل إعداد الأسهم التلقيح.
  3. لإعداد الأسهم التلقيح، تلقيح لوحة أجار الدم مع اثنين من الخرز من المخزون المطلوب المكورات الرئوية حبة المصلي، streaking لتغطية لوحة بأكمله. احتضان لوحات في C ° 37 في 5٪ 2 CO بين عشية وضحاها. وجميع حضانات مزيد من استخدام هذه نفس الظروف. احتضان أيضا وسائل الإعلام Vegitone بين عشية وضحاها لضمان العقم.
  4. مسحة صباح اليوم التالينصف لوحة، مع الحرص على عدم إزالة أي أجار الدم، وإضافة إلى 12 مل من مرق Vegitone قبل تحسنت. تكرار استخدام النصف الآخر من اللوحة. مغادرة اثنين 12 مل قارورة في C ° 37 لمدة 2 ساعة أو حتى تغيير في العكارة يصبح واضحا، أيهما يأتي أولا.
  5. إضافة 12 حتي 40 مل مل من مرق Vegitone قبل تحسنت وتخلط جيدا. تكرار للقارورة أخرى مل 12. هذا هو الوقت = 0 نقطة. إزالة 100 ميكرولتر لقراءة الكثافة الضوئية (OD) في 600 نانومتر. إزالة 20 ميكرولتر لتقدير حجم البكتيريا عن طريق تشكيل وحدة مستعمرة (CFU) العد باستخدام اختلاف الأسلوب من مايلز وميسرا (M & M) 7. احتضان كل قارورة.
    1. لM & M، تقسيم لوحة أجار الدم إلى ستة أقسام. اضافة 180 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة إلى ستة آبار لوحة 96 أيضا (U-الأسفل). إضافة 20 ميكرولتر من مرق إلى الأعلى وكذلك المزيج. تخفيف متسلسل العينة 1:10 ست مرات وتجاهل 20 ميكرولتر من البئر السادس. بعد ثلاثة ميكرولتر 10 قطرات من البئر الأعلى في القسم الأول منأغار دموي لوحة. تكرار لآبار الخمس الأخرى. ضمان لوحة جافة قبل مقلوب عليه وحضنت.
    2. في اليوم التالي حساب عدد المستعمرات واضحة في كل قسم والتخفيف قياسية. باستخدام المقطع التخفيف مع عدد يتراوح بين 30 و 300، تقسيم عدد من المستعمرات مرئية من قبل ثلاثة للحصول على المتوسط.
    3. مضاعفة متوسط ​​عدد المستعمرات من قبل عامل تخفيف ومن ثم القسمة على 10 (مبلغ انخفاض بنسبة 10 ميكرولتر). هذا يعطي CFU / ميكرولتر.
    4. مضاعفة هذا الرقم 1،000 إلى الحصول على CFU / مل.
  6. أداء OD 600 قراءات وتقدير من البكتيريا التي كتبها M & M أسلوب كل ساعة حتى يتم التوصل في وقت مبكر منتصف سجل مرحلة، وهي من OD 0.25.
  7. مرة واحدة يتم الوصول إلى هذا OD، إضافة تعقيم الجلسرين 10٪ إلى قنينة واحدة وإعداد مليلتر مأخوذة 1. مأخوذة المحل في -80 درجة مئوية.
  8. الأسهم لأكثر تركيزا، أجهزة الطرد المركزي القارورة الأخرى في 3345 x ج لمدة 15 دقيقة وإزالة طاف. إعادة تعليق بيليه في 22،5 مل من Vegitonوإضافة البريد المتوسطة الجلسرين 10٪. التحضير 1 مليلتر مأخوذة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  9. ترك الأسهم في C ° -80 مدة لا تقل عن 48 ساعة قبل ذوبان وقياس.
  10. قياس الأسهم المجمدة البكتيرية من خلال طريقة M & M. اختبار أنابيب الأسهم الثلاثة على حدة لضمان التكاثر. استخدام القيمة التي تم الحصول عليها لتخفيف الأوراق المالية لتركيز اللقاح المطلوب في المياه المالحة، كما هو موضح أدناه.
  11. لالتلقيح، يتم حساب كمية المكورات الرئوية في اللقاح قبل وبعد التلقيح. ويستخدم هذا القياس الكمي من البكتيريا من خلال طريقة M & M لتحديد متوسط ​​عدد المكورات الرئوية في اللقاح الذي يمثل الوقت المستغرق لإكمال الإجراء بأكمله.
    1. إعداد اللقاح، تمييع للتركيز المطلوب، وأداء الكمي من خلال طريقة M & M لفرز "ما قبل التلقيح".
    2. في منشأتنا البحوث السريرية فإنه يأخذ فريق 30 دقيقة لاستكمال إجراءات التلقيح بأكمله. PNسوف المعلقات eumococcal في المياه المالحة عادة ما تظهر على عدد انخفض في هذه الفترة الزمنية. إلى حساب لهذا، دعونا نحن الاعتصام اللقاح المخفف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ثم قم بإجراء "ما بعد التلقيح" الكمي من البكتيريا من خلال طريقة M & M.
    3. اتخاذ متوسط ​​قبل وبعد لتحديد تركيز النهائي تلقيح. ضبط "الجلوس" وفقا لبروتوكول الوقت الخاص بك ولكن نأخذ السريرية الفاصل الزمني قدر الإمكان.
  12. وينبغي أن ترسل جميع الأسهم الجديدة إلى المختبر المرجعي لتأكيد نقاء الأسهم والهوية.

3. إعداد اللقاح

  1. وينبغي إعداد اللقاح تبدأ قبل 30 دقيقة من الموعد المقرر المتطوعين التلقيح.
  2. تأخذ واحدة من أنابيب الأسهم التي سبق للخروج من الفريزر -80 ° C، فإنه ذوبان الجليد وتدور في أنبوب ميكروسنتريفوج في 17000 x ج لمدة 3 دقائق.
  3. لوحات أجار الدم الحار في الحاضنة 37 درجة مئوية. إعدادلوحة 96 جيدا لطريقة القياس الكمي البكتيرية بواسطة M & M وإعداد أنابيب التخفيف وفقا للجرعة المطلوبة.
  4. إزالة طاف مرق من أنبوب بالطرد المركزي و resuspend بيليه في 1 مل من محلول ملحي. هذه الخطوة يزيل مرق من اللقاح.
  5. كرر الخطوة الطرد المركزي.
  6. إزالة طاف المالحة و resuspend بيليه في 1 مل من محلول ملحي.
  7. أداء مجموعة تخفيف لتركيز اللقاح المطلوب وتحديد بواسطة M & M الأسلوب.
  8. اتخاذ اللقاح لتعيين المتطوعين وبعد بتلقيح المتطوعين، كرر الكمي في المختبر. تسمية أنبوب مع التاريخ وجرعة اللقاح وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  9. لضمان الاتساق من التلقيح التلقيح ل، فمن المهم استخدام ماصات نفس والتفاني معدات المختبرات في كل مرة.

4. تلقيح

  1. يجب أن يجلسوا المتطوعين في وضع مريح شبه راقد.
  2. طرد ببطء اللقاح على الغشاء المخاطي للأنف باستخدام حركة دائرية.
  3. من الأهمية بمكان أن لا يأتي غيض ماصة على اتصال مع الغشاء المخاطي للأنف وتعطل في سلامة البشرة قد يؤدي إلى دخول البكتيريا إلى مجرى الدم.
  4. فمن الحيوي أيضا أن لا يتم وضع اللقاح بعيدا جدا إلى الوراء أو أنه سيتم تشغيل أسفل الحلق، بل يجب أن تتواجد داخل تجويف الأنف.
  5. تكرار لالمنخر الآخر.
  6. يكون المتطوع تبقى في موقف شبه راقد لمدة 10 دقيقة دون استنشاق أو التمخط. هذا يتيح وقتا للبكتيريا لتفريق عبر الغشاء المخاطي.

5. رصد

  1. يتم مراقبة المتطوعين يوميا بعد التلقيح. هذا يتضمن رسالة نصية بعث بها يوميا المتطوعين للمحققين قبل 2 بعد الظهر.
  2. إذا كان النص الأولق لم تتلق بنسبة 2 مساء. يمكن الاتصال المتطوع لضمان له / لها الرفاه. إذا هو / هي لا يستجيب، سيتم الاتصال التالي من ذوي القربى المخصصة لضمان المتطوع الرفاه.
  3. ويطلب من المتطوعين للإبلاغ عن أي أعراض الجهاز التنفسي العلوي في كل موعد. وسوف يطلب من الكادر الطبي التطوعي لوصف له / لها أعراض وستتابع أي شكاوى.
  4. المضادات الحيوية تعطى للمتطوعين هي فقط التي يجب اتخاذها تحت ثلاثة ظروف، وفي حال أن تكون على ما يرام ويتم طلب لنقلهم من قبل فريق البحث، اذا كانت تحمل المكورات الرئوية في نهاية الدراسة، أو إذا كانت على ما يرام وغير قادر على الاتصال فريق البحث. وتشجع المتطوع للحفاظ على هذا حزمة الطوارئ معهم في جميع الأوقات أثناء الدراسة وطلب الاتصال فريق البحث على أساس يومي ل7 ايام القادمة.
  5. فريقنا هو متوفر 24/7 مع ممرضة الاتصال أثناء ساعات العمل المتاحة وطبيبين من حوURS. يتم التعامل مع جميع الاستفسارات عن طريق مكالمة هاتفية و / أو مراجعة فورية. المواد التموينية متوافرة للقبول الفوري والمباشر إلى جناح الأمراض المعدية، إذا لزم الأمر.

6. اغسل الأنف (NW) الإجراءات

  1. يتم تنفيذ يغسل الأنف (NW) في زيارة الفحص الأولي، وكذلك 48 ساعة و 7 و 14 يوما بعد التلقيح. أخذ الطريقة المستخدمة من NW Naclerio وآخرون 8 من متطوعي المستعمر بشكل طبيعي من قبل S. ويستثنى من التلقيح الرئوية والمتابعة.
  2. يجلس بشكل مريح والمتطوع إمالة الرأس للخلف 30 درجة من رأسي.
  3. يطلب من المتطوعين لتأخذ نفسا عميقا في وقلوبها، بينما دفع لغتهم حتى والخلف ضد سقف الفم. بينما في هذا الموقف، يطلب من المتطوعين للإشارة إلى أنهم مستعدون.
  4. يتم إدراج حقنة مليئة المالحة 20 مل الى الفضاء في الأنف الأمامية ويطرد 5 مل من محلول ملحي. وvolunteeR يميل إلى الأمام ثم يطرد فورا والسوائل عن طريق الزفير بسرعة من خلال أنوفهم في وعاء احباط.
  5. كرر هذا الإجراء أكثر من 3 مرات حتى تم غسلها مرتين كل منخر واستخدمت كامل 20 مل.
  6. تجمع جميع العينات معا في أنبوب الطرد المركزي وإرسالها إلى المختبر في درجة حرارة الغرفة للمعالجة.

7. اغسل الأنف التحميل

  1. أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في ز X 3345.
  2. إزالة طاف وتخزين ك 1 مليلتر مأخوذة في أنابيب إيبندورف العلامات في -80 ° C.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من 9 إلى STGG المتوسطة وبيليه ومزيج دقيق. تأكد من أن يتم تحديد الحجم الكلي في الأنبوب عند هذه النقطة. وسوف تستخدم هذه في حساب التخفيف من CFU عربة NW إيجابية.
  4. لوحة بنسبة 20 ميكرولتر من STGG يحتوي على بيليه معلق على لوحة أجار الدم التي تحتوي على جنتاميسين وخط لوحة بأكمله.
    1. إذا كان هو NW بعد التلقيح، إزالة 10 ميكرولتر من STGG يحتوي على بيليه معلق واستخدام القياس الكمي للبكتيريا التي كتبها M & M الأسلوب.
  5. إضافة آخر ميكرولتر 800 من STGG إلى أنبوب NW ومزيج دقيق.
  6. لوحة سعة 25 ميكرولتر من الدم على صفيحة أغار و 25 ميكرولتر على الشوكولاته لوحة أجار، streaking لوحة بأكمله.
  7. تقسيم المبلغ المتبقي البكتيريا العالقة في STGG المتوسطة في 2 cryovials وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  8. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل في 5٪ CO 2.
  9. دراسة لوحات في اليوم التالي لالمكورة الرئوية وغيرها من مسببات الأمراض التنفسية المحتملة.
  10. يتم تحديد المكورات الرئوية على لوحات من التشكل مستعمرة. المستعمرات ألفا الانحلالي مع مورفولوجيا رسام هي شبه مثقف على أجار الدم مع قرص optochin وحضنت بين عشية وضحاها.
  11. هي ملطخة المستعمرات غرام المكورات الرئوية المفترض أن تكون حساسة لتأكيد optochin مكورات مزدوجة إيجابية الجرام وserotyped باستخدام المصل شتاتنز معهد PNEUmotest-اللثي عدة.

Representative Results

لدينا خبرة بتلقيح 159 شخصا، منها 35 قامت المكورات الرئوية. كان أقل جرعة حققنا النقل مع استخدام النمط المصلي 6B 11100 CFU/100 ميكرولتر في المنخر، وكان أعلى جرعة 313،000 CFU/100 ميكرولتر في المنخر. كان أقل جرعة حققنا النقل مع استخدام النمط المصلي 23F 9000 CFU/100 ميكرولتر في المنخر، وكان أعلى جرعة 84500 CFU/100 ميكرولتر في المنخر.

أسلوبنا في تقييم النقل هو غسل الأنف، لأن اختيار دراسة حديثة أظهرت أن 10 91٪ من المتطوعين وجدت غسل الأنف لتكون أكثر راحة من مسحة البلعوم، وغسل الأنف وكان أيضا أكثر عرضة للكشف عن مسببات الأمراض باستخدام ثقافة الميكروبيولوجية. يمكن استرداد النباتات الجرثومية على لوحات أجار الدم تلقيح مع NW يكون متغير ويصعب قراءتها. يتم استخدام الجنتاميسين على لوحة أجار الدم لتحديد أول من المكورة الرئوية. وتستخدم لوحة أجار أجار الشوكولاته والدم وحة ثانية لكشف مسار الجهاز التنفسي الأخرى المحتملةogens التي قد تساعد أو تعوق الاستعمار المكورات الرئوية. ويرد مثال على لوحة أجار الدم تلقيح مع NW التي هي سهلة لقراءة الشكل 1A في؛ يظهر لوحة تحتوي على أنواع عديدة من الصعب من النباتات في الشكل 1B.

في كل المتطوعين وطلب تعيين لوصف أي أعراض الجهاز التنفسي العلوي، إذا كان موجودا، وسلط الضوء مقارنات بين شركات الطيران وشركات النقل غير. الشعب تلقيح 145 مؤخرا مع المكورة الرئوية، اشتكى 28 من أعراض (الجدول 1). وكان ثمانية من هذه الناقلات والعشرين لم تكن. وأكثر الأعراض شيوعا الأعراض غير النوعية الأنف (الجدول 1). من الحالات التي تم الإبلاغ عن وجود الأعراض الشاملة، بما في ذلك الحمى و / أو الشعور بالضيق، وأظهرت أيا من التحقيقات التي دليلا على مرض المكورات الرئوية وأعراض تتفق مع التهاب فيروسي المتزامنة إلا في حالة واحدة من التهاب اللوزتين. اثنين ايجابيات المكورات الرئويةوعولج بالمضادات الحيوية المتطوعين ه. اشتكى أحد التهاب الحلق وآلام الأذن، وبعد لقاء مع الطبيب دراسة، وأبلغت إلى تناول المضادات الحيوية كإجراء وقائي. تم تشخيص المتطوعة الأخرى سريريا مع التهاب اللوزتين. كان جميع المتطوعين حل سريع لهذه الأعراض.

الشكل 1
الشكل 1. أجار الدم وحة تلقيح مع NW. لوحات أجار الدم تلقيح مع NW يمكن أن يكون من الصعب قراءتها. 1A مثال على لوحة التي هي سهلة لقراءة مع المكورات الرئوية واضحة للعيان. 1B هو لوحة مع الكثير من شارك في استعمار النباتات مما يجعله أكثر يصعب اكتشاف إذا المكورات الرئوية موجودا.

الأعراض النقل (ن = 32) لا النقل (ن = 112)
جميعالأعراض 24٪ 18٪
النظامية حمى
* الشعور بالضيق
محلي آذان
أنف 0 10٪
حنجرة 12٪

الجدول 1. ذكرت توصيف المتطوعين الأعراض التالية S. 6B الرئوية التلقيح. تم استعراض جميع الشكاوى المقدمة من لجنة السلامة الخارجية، وبعد تحقيقات كاملة، ونسبت أي أعراض للمرض المكورات الرئوية. وأكثر الأعراض شيوعا التهاب الحلق، محشوة الأنف ومرض شبيه بالإنفلونزا.

Discussion

منصة EHPC لديها عدد من الاستخدامات المحتملة بما في ذلك استخدام كنموذج لقاح المخاطية وكبديل لحماية اختبار اللقاحات البروتين الرواية. هذه الطريقة تعتمد على تقنية التلقيح متسقة وعالية الجودة NW.

يمكن استنساخ يكون مشكلة مع اللقاح. ونظرا لطبيعة متغير مأخوذة البكتيرية المجمدة، يمكن أن يكون من الصعب تكرار الجرعة المطلوبة. ويعتبر بمقدار النصف أو مضاعفة الجرعة المطلوبة داخل النطاق. من الأهمية بمكان أن يتم تحديد مقدار البكتيرية مباشرة قبل التلقيح والتالية، وذلك لتحديد بدقة الكمي لعدد من البكتيريا CFU. لهذا السبب قد يكون من المفيد أن التعيينات في وقت واحد حتى يحدث المتطوعين التي تحتاج الى أن تكون مستعدة واحد فقط اللقاح والطلاء الكمي القيام به قبل وبعد التلقيح يحدث ما لا يزيد عن 30 دقيقة بعيدا.

طريقة NW يتطلب COOPEوالتموينية من المتطوعين وألا يكون الأسلوب الأمثل في الأطفال. إذا كان العائد أقل من 5 مل، ويمكن تكرار هذا الإجراء باستخدام ما يصل إلى 20 مل إضافية. قد يرتدي طقم أسنان تقليل العائد NW. إذا كان لديها منعت المتطوعين / الأنف المزدحمة والمالحة ينفد الأمامية بعد الإدراج، ونفخ الأنف، إدراج الحقنة أبعد قليلا إلى الوراء، وميل رأسه للخلف أكثر إذا لزم الأمر.

وNW هو الاسلوب الذي يحصل على نحو أفضل مع الممارسة. وعادة ما يكون حجم بعض فقدت بذلك الهدف هو لعودة ما لا يقل عن 10 مل. إذا كان يمكن تذوق المتطوعين المالحة خلال NW ثم لم يتم الاتصال بين البلعوم الأنفي الخلفي والبلعوم مغلقة بشكل كاف لسان المتطوع. إذا المتطوع يبتلع معظم المالحة، وشرح الإجراء مرة أخرى، مع التركيز على دفع اللسان ضد سقف الفم. ثم كرر الإجراء لزيادة حجم إرجاعها.

إذا كان يحتوي على NW substantالاتحاد العالمي للتعليم كمية من المخاط، فمن الأفضل لإزالته قبل الطرد المركزي. دوامة العينة وذلك لتخفيف أي شيء يمكن أن يكون منضما إلى المخاط ثم قم بإزالة أكبر قدر من القطع الكبيرة ممكن أثناء إزالة الملوحة وأقل قدر ممكن.

تم إكمال عملية دراسة سابقة EHPC في الولايات المتحدة بأمان وليس لديه أحداث سلبية 11. لضمان سلامة استمرار النظام الأساسي EHPC، أنشأنا بروتوكول الطوارئ التي تقوم حول الوصول على مدار 24 ساعة لفريق البحث. يتم إعطاء المتطوعين تفاصيل الاتصال، والسماح لهم بالوصول إلى فريق البحث 24 ساعة في اليوم. يتم توفير أي رعاية الطبية اللازمة في مستشفى الجامعة الملكية ليفربول. كتدبير آخر للحماية، لجنة السلامة التي تتكون من الأطباء والعلماء من خارج مجموعة البحث يتلقى تقريرا أسبوعيا السلامة. التقرير يحتوي على جرعة البكتيريا تلقى كل متطوع وسواء تم الإبلاغ عن أي أعراض أو مرض. هذا التقرير يسمح للسلامة الأن دراسة ه نقد خارجيا دون تحيز. لجنة السلامة وتتوفر أيضا 24 ساعة في اليوم في حال من غير المحتمل حدوث طارئ.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس (جراند جائزة التحدي لاستكشاف SBG)، والمعاهد الوطنية للبحوث الصحية (NIHR)، مركز أبحاث الطب الحيوي في مجال أمراض الميكروبية، والشامل NIHR شبكة البحوث المحلية. نعترف NWDA لدعم البنية التحتية. نشكر الأستاذ J. N ايزر، جامعة ولاية بنسلفانيا والأستاذ P هيرمانز، جامعة نيميجن لعزلات المكورات الرئوية. بفضل لجنة السلامة EHPC على دعمهم وتقديم المشورة، لدينا جميع المتطوعين لمشاركتهم وماتيو Bangert لأخذ الصور.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycerol Fisher G/0650/08
0.9% Sodium Chloride B. Braun 3627667
Skim milk powder Fluka 70166
Tryptone soya broth Becton Dickinson 211768
Glucose BDH 284504S
Columbia Agar with chocolated horse blood Oxoid PB0124
Pneumotest-latex kit Statens Serum Institut 51823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research. Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).
  2. Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine. Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).
  3. Tocheva, A. S., et al. Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children. Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).
  4. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, (10), 1962-1973 (2011).
  5. Wu, H. Y., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  6. Wright, A. K. A., Ferreira, D. M., Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Armitage, K., Jambo, K. C., Bate, E., Batrawy, S. E. l, Collins, A., Gordon, S. B. Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage. PloS Pathogens. 8, (4), e1002622 (2012).
  7. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. The Journal of Hygiene. 38, 732-749 (1938).
  8. Naclerio, R. M., et al. Mediator release after nasal airway challenge with allergen. Am. Rev. Respir. Dis. 128, 597-602 (1983).
  9. O'Brien, K. L., Nohynek, H. Report from a WHO working group: standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae. Pediatr. Infect. Dis J. 22, 133-140 (2003).
  10. Gritzfeld, J. F., Roberts, P., Roche, L., Batrawy, S. E. l, Gordon, S. B. Comparison between nasopharyngeal swab and nasal wash, using culture and PCR, in the detection of potential respiratory pathogens. BMC Research Notes. 4, 122 (2011).
  11. McCool, T. L., Cate, T. R., Moy, G., Weiser, J. N. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
التجريبية النقل المكورات الرئوية الإنسان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Collins, A. M., Pennington, S. H., Wright, A. K. A., Kadioglu, A., Ferreira, D. M., Gordon, S. B. Experimental Human Pneumococcal Carriage. J. Vis. Exp. (72), e50115, doi:10.3791/50115 (2013).More

Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Collins, A. M., Pennington, S. H., Wright, A. K. A., Kadioglu, A., Ferreira, D. M., Gordon, S. B. Experimental Human Pneumococcal Carriage. J. Vis. Exp. (72), e50115, doi:10.3791/50115 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter