Summary
מאמר זה מספק תיאור מפורט וחזותי של מתודולוגיה לאיסוף ומדידת מתווכים דלקתיים וnociceptive יוכימיים באתר פצע הניתוח לאחר לידה בניתוח קיסרי. מבדק אנושי זו נעשה שימוש כדי לקבוע קשר בין הפצע וריכוזים ציטוקינים בסרום ושינויים בסמים בתיווך בציטוקינים, כמוקינים ופצע neuropetides.
Abstract
אנו מתארים מתודולוגיה שבאמצעותו אנו יכולים לאסוף ולמדוד מתווכים דלקתיים וnociceptive יוכימיים באתר פצע הניתוח. איסוף סמנים ביוכימיים ספציפיים לאתר חשוב להבין את הקשר בין הרמות בסרום ופצע ניתוחי, לקבוע כל קשר בין שחרורו מתווך, כאב, שימוש במשככי כאבים ותוצאות אחרות של עניין, ולהעריך את ההשפעה של מתן תרופה מערכתית והיקפי על פצע ניתוח ביוכימיה. מתודולוגיה זו יושמה לנשי בריאות העוברות ניתוח קיסרי אלקטיבי בהרדמה בעמוד שדרה. יש לנו נמדדנו exudate פצע ומתווכי סרום באותם מרווחי זמן כציוני כאב של המטופל וצריכת משככי כאבים לתקופה של עד 48 שעות לאחר לידה בניתוח קיסרי. שימוש במתודולוגיה זו היינו מסוגל לזהות מתווכים ביוכימיים שונים, כולל גורם צמיחה עצבית (NGF), פרוסטגלנדין E2 (PG-E2) חומר P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 ו-MIP 1β. מחקרים החלימו אסיי לפצע הניתוח האנושי הזה לא מצאו מתאם בין פצע וריכוזים ציטוקינים סרום או פרופיל זמן שחרורם (J Pain 2008;. 9 (7) :650-7) 1 אנחנו גם תעדנו את התועלת של הטכניקה לזיהוי. שינויים בסמים בתיווך בתוכן ציטוקינים פצע (Anesth Analg 2010; 111:1452-9). 2
Introduction
לאחר חתך ניתוחי, תושב והעברה בתאים דלקתיים לשחרר ציטוקינים פרו ואנטי דלקתיים, prostanoids, נוירופפטידים וכמוקינים שחשובים לייזום ושמירה על כאב. 3,4 היכולת לאסוף סמנים ביוכימיים ספציפיים לאתר הוא קריטי כדי לקבוע קשר בין הרמות בסרום ופצע ניתוחי, להבין את מערכת יחסים המורכבת בין שחרור מתווך וכאב כירורגי, וכדי להיות מסוגל להעריך את ההשפעה של שני תרופות היקפיות מערכתי ועל הביוכימיה פצע ניתוח. המחקרים התמקדו במדידות מערכתיות של מתווכים ביוכימיים ולא שקלו שחרור אתר ספציפי. 5,6 מדידות סרום של ציטוקינים וכמוקינים לא יכול להיות שיקוף של אירועי פצע ניתוח מקומיים ביוכימיים ומצביעים על מענה מערכתי גלובלי לפגיעה כירורגית בלבד. מאמר זה מספק תיאור חזותי מפורט וייחודי של מתודולוגיה זו שהיה אשוחרח הפניה בשנת 2008 בכתב העת של כאב. 1 מטרת מאמר יופיטר זה היא לספק תיאור חזותי ייחודי ומשופר של השיטות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מחקר הפרוטוקול
- לקבל את אישור מועצה לביקורת מוסדי והסכמה מדעת בכתב.
- בחר אוכלוסייה כירורגית מתאימה להתנהלות מחקר. מתודולוגיה זו יושמה רק לפצעי ניתוח קיסרי אבל פצעים כירורגיים ביותר יהיו מתאימים.
- שקול קריטריוני הכללה והדרה להשתתפות המחקר שלך. חולים ונהלים עם שיעורים גבוהים של זיהום פצע ניתוח לא יכולים להיות מתאימים.
- סטנדרטיזציה וניהול הרדמה לאחר ניתוח לכל החולים כדי למנוע ערפלנים פוטנציאליים.
2. אוסף המתווך יוכימית nociceptive ודלקתי
- הכנס ב-Q PainBuster עם ON-Q SilverSoaker (I-Flow, בלייק פורסט, קליפורניה) לשכבה התת עורית ממש לפני סגירת הפצע (שכבות רקמות אחרות יכולות להיחשב). מערכת שיכוך כאב PainBuster ב-Q ברציפות מספקת המלוחה רגילה בשיעור של 2 מ"ל / שעה. המוביל יכול להיות מסרקלעצמה עם או בהשוואה לתרופות בעלי עניין כגון הרדמה מקומית ונוגדי דלקות שאינן סטרואידים.
- לשלב ברזלים סטנדרטיים משולש למערכת זו כדי לאפשר לשאיפה של exudate פצע בנקודתי זמן שצוינה. העירוי המתמשך מונע מקטטר קרישה ומשפר את האמינות של המערכת להפקת דגימות exudate. אם השאיפה של exudate קשה (כ 5% ממקרים), שקלו דוחפים בעדינות מעל הפצע, שינוי מיקומו של הנושא (למשל, יושב או שוכב חולם שטוח), שימוש בסומק מלוח מ"ל נורמלי 0.5-1 או נסיגה 1-2 סנטימטר קטטר.
- בנקודתי זמן שצוינו על ידי הפרוטוקול (למשל, 1, 4, 6, 24, ו 48 שעות לאחר ניתוח קיסרי), לשאוב ולסגת 1 מ"ל של exudate פצע. העברת exudate לתוך כוס המכילה פוליאתילן 30 μl של מעכב proteinase. יש לנו להשתמש אינהיביטור proteinase השלם (רוש Bioscience, פאלו אלטו, קליפורניה) למטרות שלנו.
- בתוך שעות 1 מתוך אוסף, לשים דוגמאות על קרח וצנטריפוגה בסל"ד 3000 למשך 10 דקות.
- הסר supernate ומקום סרום ופצע בצינור סטנדרטי microcentrifuge ולאחסן ב -20 ° C.
3. ניתוח assay
- לאחר שכל exudate המחקר ודגימות סרום נאספים ונשמרים, להפשיר ולנתח הדגימות באותו הזמן.
- אנחנו מדדנו את ציטוקינים וכמוקינים באמצעות immunoassay זמנית. הטכניקה זמנית חיסוני assay מאפשרת לנו assay analytes רב מ( 50 μl) דגימות נפח קטנות. זמנית לייצר תוצאות דומות לאלו שהושגו עם אליסה. יש לנו להשתמש במערכת 17-Bio-Plex PlexTM (BioRad, Hercules, CA) עבור הניתוח שלנו. בדיקה זו היא מסוגלת למדוד נימק גורם גידול α (TNFα), אינטרפרון α (INFα), אינטרלוקין 1β (IL-1β), אינטרלוקין 2 (IL-2), 4 אינטרלוקין (IL-4), אינטרלוקין 5 (IL-5 ), 6 אינטרלוקין (IL-6), 7 אינטרלוקין (IL-7), 8 interleukin (IL-8), אינטרלוקין (IL-10), אינטרלוקין 12 (IL-12), אינטרלוקין 13 (IL-13), אינטרלוקין 17 (IL-17), גורם granulocyte מושבת מגרה (G-CSF), גורם מעורר מושבת granulocyte-מקרופאג (GM-CSF), חלבון chemoattractant monocyte 1 (MCP-1) וחלבון דלקתי macrophage 1 (MIP-1β). גורם גדילה עצבית נמדד עם DY256 נוגדן NGF ידי הוספתו לצלחת 17-Plex עם ערכת הצימוד האמין Bio-Plex.
- כדי להבטיח ניתוח באיכות טובה, כל מדידה צריכה להיעשות בשני עותקים. עקומות סטנדרטיות עבור כל אנליטי נוצרות באמצעות analytes ההתייחסות סופק על ידי היצרן (בריכוזים של 0.20, 0.78, 3.13, 12.5, 50, 200, 800, 3200 עמ '/ מ"ל בתוספתתקן אפס למלח הרגיל). עקומות סטנדרטיות כלולות בכל ריצה וריכוזי מדגם מחושבים עם תוכנת מנהל Bio-Plex.
- החומר P ופרוסטגלנדין אי -2 נמדדו באמצעות ערכות ELISA מאוד רגישות. יש לנו להשתמש Assay עיצובים, Inc (אן ארבור, מישיגן) בניתוח זה. לבצע ניתוח בשני עותקים בהתאם למפרט של היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השימוש במתודולוגיה זו היינו מסוגל לזהות את כל המתווכים ביוכימיים המתוארים לעיל, למעט IL-5 בexudate פצע ופלזמה. 1,2 כמה ציטוקינים נוספים שלא זוהו בפלזמה (IL-4, IL-17, TNFα, INFγ , GM-CSF). כמובן הפעם 1 של ציטוקינים וכמוקינים שנמדדו במחקרים שדווחו היו עקביים, והגיע אל רמה בתוך כמה השעות הראשונות שמתקבלות עבור תקופת המעקב 24 שעות ביממה .. 1,2 עם זאת, NGF גדל בהתמדה לאורך תקופת איסוף 24 שעות, ואילו PGE2 הגיע לשיא תוך שעה 1 ולאחר מכן בהדרגה ירד. 1 תוצאות ראויות לציון מיוחד הם ירדו במידה ניכרת רמות של IL-10 ורמות גבוהות של החומר P בפצעים החדירו עם ההרדמה המקומית bupivacaine, התואם כולל פרו השפעה דלקתית של התרופה (איור 1). 2 במחקר אחר הראו כי צריכת משככי כאבים לאחר הניתוח הקיסרי דהניתוח מדים היה בקורלציה שלילית עם הפצע exudate IL-6, IL-1 β, וריכוזי ה-G-CSF (איור 2). 1
האיור 1. אינטרלויקין-10 (IL-10) והחומר P לפצוע רמות exudate רמות (pg / מ"ל) הנמדדות ב1, 3, 5, 7 ו 24 שעות לאחר משלוח ניתוח קיסרי. קבוצת סליין הנורמלית מצוינת ביהלומים אפורים, וקבוצת bupivacaine מוצגת עם ריבועים שחורים. * = שונה משמעותי בין קבוצות (P <0.005).
איור 2. מתאם בין interleukin-6 (pg / מ"ל) וצריכת מורפיום ב24 השעות הראשונות לאחר לידה בניתוח קיסרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מתודולוגיה זו שתוארה לעיל נמצאה להיות רגיש מספיק כדי לזהות מתווכים דלקתיים וnociceptive יוכימיים בexudate פצע. דגימה בנקודתי זמן שונים-גם אפשרה לנו להתבונן בשינויים של מתווכים אלה לאורך זמן. 1,2 אנחנו לא מודעים לכל בדיקה אחרת אדם כירורגית פצע שיכול סדרתי למדוד את פרופיל השחרור של מתווכים דלקתיים וnociceptive בexudate פצע ניתוח. תוצאות מהמתודולוגיה שלנו של אוסף exudate פצע מאתר החתך הניתוחי שונות ממחקרי ניצול מתנקז ממפרק הירך, 7,8 אשר טוען כי שחרור מתווך פצע תת עורי עשוי להיות שונה מחללי הגוף intraarticular או אחרים לשחרור המתווך ביוכימי. בנוסף, תוצאות שהתקבלו במנקז עשויות להיות מבולבלות על ידי איבוד דם לתוך הפצע, ולכן ייתכן שהם לא משקפים במדויק את שחרור המתווך יוכימי מקומי.
קורלציה בין הענייםפצע ורמות בסרום מדגימים את החשיבות של קביעת שחרורו באתר ספציפי כאשר לומדים פצעי ניתוח. שינויים מקומיים לא יבואו לידי ביטוי בצורה מערכתית עקב גורמים רבים, כולל ייצור הפרש מערכתי ומקומי בתגובה לטראומה ולחץ כירורגית. למרות שבחרנו למדוד בבחירה מסוימת של ציטוקינים וכמוקינים פרו ואנטי דלקתיים, כמו גם NGF, SP וPG-E2 מניתוח הקיסרי משלוח פצע exudate, 1,2 מתודולוגיה זו ניתן ליישם מודלים כירורגיים אחרים ורבים אחרים מתווכים ביוכימיים.
החדרת חומר הרדמה מקומית כירורגי פצע היא טכניקה נפוצה לשיפור כאב לאחר ניתוח. 9 החלת מתודולוגיה, הצלחנו להוכיח כי החדרת חומר הרדמה מקומית לפצעי ניתוח משפיע על הביוכימיה פצע. 2 ירידה בIL-10 ועלייה בחומר P בexudates פצע עם bupivacaine החדרה מרמזת שיבוש oו אפנון אנטי דלקתי. הרדמה מקומית המנוהלת שולי ייתכן ובכך משפיעה על תהליכים הדלקתיים, 10,11 שעלולים חלקית להסביר chondrolysis הרדמה המקומית מושרה במפרקים לאחר ניתוח 12.
מערכת שיכוך כאב PainBuster ב-Q היא מזון ותרופות אמריקאים (FDA) אשר מכשיר מאז 1998 שמשמש למשלוח של חומרי הרדמה מקומיים לאתר פצע ניתוח כדי להפחית את הכאב לאחר ניתוח. החדרת פצע מתמשכת ניצול צנתרים זה ואחרים לא קשורה לזיהום פצע מוגבר. 9,13 ב-Q PainBuster עם ON-Q SilverSoaker נועד להחדיר סמים ולא שוב ושוב לטעום exudate פצע. אמנם יש לנו לא היו זיהומים בפצע עם טכניקה זו, אנו מדגישים טכניקת aseptic תוך דגימת exudate פצע ממערכת זו. השינוי המוצע שלנו כדי להקל על דגימה צריך להיות שמור למטרות מחקר ולא לu הקליני השגרתיse. כמו כן, אנו ממליצים כי משך הצנתר נשאר באתרו יוגבל ל 48-72 שעות.
טכניקה כירורגית אסיי לאתר זה מספקת מודל טוב כדי להבין את הקשר בין מתווכים ביוכימיים דלקתיים וnociceptive בכאב שלאחר ניתוח. אנו נשתמש במתודולוגיה במחקרים עתידיים כדי לחקור השפעות של תרופות המנוהלות באופן מקומי שאינן סטרואידים אנטי דלקתיות ואופיואידים. הטכניקה יכולה גם להשאיל את עצמו לחקירות שבחנו את ריפוי פצע, זיהום צלקות ניתוחית ופצע מוגזם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודתו של ד"ר קרבאליו נתמכה על ידי מענק מחקר ממשרד המחקר על בריאות האישה והמכון הלאומי לבריאות ילד והתפתחות אדם של המכונים הלאומיים לבריאות (5K12 HD043452). דכדוך ד"ר קבל אספקת מערכת (On-Q PainBuster המנותחת כאב סעד) וקרנות (למבחנים ביוכימיים) מאני-זרימה (לייק פורסט, קליפורניה).
References
- Carvalho, B., Clark, D. J., Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. J. Pain. 9, 650-657 (2008).
- Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D. C., Angst, M. S. Continuous subcutaneous instillation of bupivacaine compared to saline reduces interleukin 10 and increases substance P in surgical wounds after cesarean delivery. Anesth. Analg. 111, 1452-1459 (2010).
- Verri, W. A., Cunha, T. M., Parada, C. A., Poole, S., Cunha, F. Q., Ferreira, S. H. Hypernociceptive role of cytokines and chemokines: targets for analgesic drug development. Pharmacol. Ther. 112, 116-138 (2006).
- Watkins, L. R., Maier, S. F. Immune regulation of central nervous system functions: from sickness responses to pathological pain. J. Intern. Med. 257, 139-155 (2005).
- Beilin, B., Bessler, H., Mayburd, E., Smirnov, G., Dekel, A., Yardeni, I., Shavit, Y. Effects of preemptive analgesia on pain and cytokine production in the postoperative period. Anesthesiology. 98, 151-155 (2003).
- Wu, C. T., Jao, S. W., Borel, C. O., Yeh, C. C., Li, C. Y., Lu, C. H., Wong, C. S. The effect of epidural clonidine on perioperative cytokine response, postoperative pain, and bowel function in patients undergoing colorectal surgery. Anesth. Analg. 99, 502-509 (2004).
- Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2006).
- Kristiansson, M., Soop, M., Sundqvist, K. G., Soop, A., Suontaka, A. M., Blomback, M. Local vs. systemic immune and haemostatic response to hip arthroplasty. Eur. J. Anaesthesiol. 15, 260-270 (1998).
- Liu, S. S., Richman, J. M., Thirlby, R. C., Wu, C. L. Efficacy of continuous wound catheters delivering local anesthetic for postoperative analgesia: a quantitative and qualitative systematic review of randomized controlled trials. J. Am. Coll. Surg. 203, 914-932 (2006).
- Eriksson, A. S., Sinclair, R., Cassuto, J., Thomsen, P. Influence of lidocaine on leukocyte function in the surgical wound. Anesthesiology. 77, 74-78 (1992).
- Clark, J. D., Shi, X., Li, X., Qiao, Y., Liang, D., Angst, M. S., Yeomans, D. C. Morphine reduces local cytokine expression and neutrophil infiltration after incision. Mol. Pain. 3, 28 (2007).
- Webb, S. T., Ghosh, S.
- Scott, N. B.
