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Neuroscience

चिकी भ्रूण में axonal trajectories और Synaptic के लक्ष्य का पता लगाने के लिए hindbrain के electroporation

Published: May 29, 2013 doi: 10.3791/50136
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Koret School of Veterinary Medicine, The Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Medical Neurobiology, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

विकास तंत्रिका जीव विज्ञान में एक बुनियादी सवाल कैसे neuronal नेटवर्क भ्रूण मस्तिष्क में स्थापित कर रहे है. यहां हम ऐसे Cre / Lox-plasmids और पृष्ठीय interneurons लेबल और विभिन्न विकास के चरणों में अपने axonal अनुमानों और synaptic लक्ष्य को ट्रैक करने के लिए एवियन hindbrain में PiggyBac की मध्यस्थता डीएनए स्थानांतरण प्रणाली के रूप में उपन्यास आनुवंशिक उपकरणों के साथ एक electroporation तकनीक संयुक्त.

Abstract

लड़की भ्रूण न्यूरल ट्यूब के electroporation ऐसे neuronal कोशिकाओं में विदेशी जीनों की अभिव्यक्ति के लिए त्वरित और कुशल होने के रूप में कई फायदे हैं. इस पांडुलिपि में हम एक विशेष रूप से तंत्रिका progenitors के एक सबसेट लेबल करने के क्रम में E2.75 में एवियन पश्चमस्तिष्क में डीएनए electroporate को कैसे विशिष्ट दर्शाता है कि विधि, और कैसे विकास के अधिक उन्नत चरणों में अपने axonal अनुमानों और synaptic लक्ष्य का पालन करने के लिए प्रदान ऊपर E14.5 लिए. आधारित plasmids और पश्चमस्तिष्क कोशिकाओं (interneurons, डीए 1 के पृष्ठीय सबसे उपसमूह) के एक उप प्रकार में GFP अभिव्यक्ति ड्राइव PiggyBac की मध्यस्थता डीएनए स्थानांतरण प्रणाली - हम विशिष्ट बढ़ाने तत्वों, Cre / Lox सहित उपन्यास आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग किया है. Axonal trajectories और डीए 1 एक्सोन का लक्ष्य विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में जल्दी और देर से भ्रूण चरणों में पीछा कर रहे हैं. इस रणनीति भ्रूण hindbrain में ब्याज की कोशिकाओं को निशाना बनाने के लिए और टीआरए के लिए उन्नत तकनीक का योगदान देता हैविकास के कई चरणों में सर्किट गठन cing.

Introduction

पश्चमस्तिष्क आरोही और neuronal नेटवर्क उतरते के माध्यम से मध्य और परिधीय तंत्रिका प्रणाली के बीच संवाद स्थापित करने से तंत्रिका तंत्र की एक प्रमुख रिले केंद्र का प्रतिनिधित्व करता है. यह श्वसन, चेतना, श्रवण, और मोटर समन्वय 1-3 सहित बुनियादी कार्यों को नियंत्रित करता है. जल्दी भ्रूण के विकास के दौरान, हड्डीवाला पश्चमस्तिष्क क्षणिक अलग neuronal सेल प्रकार का गठन किया और कई brainstem नाभिक केंद्रों 4 उत्पन्न कर रहे हैं, जिसमें दोहराव rhombomeres, में अपने पूर्वकाल पीछे (एपी) अक्ष के साथ विभाजित है. पश्चमस्तिष्क भी ​​असतत neuronal progenitors निर्दिष्ट हो जाते हैं और अलग डीवी स्थानों में 3,5,6 अंतर है, जिस पर एक बेसल और बगली थाली, में अपने पृष्ठीय उदर (डीवी) अक्ष के साथ विभाजित है. जल्दी एपी और डीवी-विशिष्ट neuronal पैटर्न कार्यात्मक ब्रेनस्टेम circuitries की स्थापना के शासी कैसे हैं काफी हद तक अज्ञात है.

इस मौलिक पर ज्ञान प्राप्त करने के लिएसवाल, उपकरण जल्दी hindbrain में न्यूरॉन्स की विशिष्ट सबसेट लेबल करने के लिए और अधिक उन्नत चरणों में अपने axonal trajectories और कनेक्टिविटी का पता लगाने के क्रम में आवश्यक हैं. हम पहले से विशिष्ट बढ़ाने तत्वों का उपयोग किया, और जल्दी लड़की भ्रूण 7-9 में पृष्ठीय रीढ़ interneurons की axonal प्रक्षेपवक्र पर नज़र रखने के लिए एक Cre / LoxP आधारित सशर्त अभिव्यक्ति प्रणाली है. वर्तमान पांडुलिपि में हम पश्चमस्तिष्क निशाना बनाया और एक संशोधित इलेक्ट्रोपोरेशन रणनीति और PiggyBac का उपयोग कर, देर भ्रूण hindbrain interneurons, axons और उनके अन्तर्ग्रथनी लक्ष्य लेबलिंग के लिए प्रयोगात्मक प्रतिमान उन्नत किया है - मध्यस्थता डीएनए स्थानांतरण. हमारी नई रणनीति 2 करने के लिए 12 दिनों से hindbrain और उनके axonal अनुमानों और विभिन्न भ्रूण चरणों में synaptic स्थलों की ट्रैकिंग के एक पक्ष में अलग neuronal उपप्रकार की टैगिंग, electroporation के निम्नलिखित की अनुमति देता है. इस पद्धति के आधार पर हमने पश्चमस्तिष्क interneurons के पृष्ठीय सबसे उपसमूह (dA1/Atoh1 + लेबल 10 की कई परतों में फार्म synapses के लिए पाए गए.

लड़की electroporation के संयोजन, आनुवंशिक न्यूरॉन्स और विकास के अधिक उन्नत चरणों में प्रक्षेपण साइटों के विश्लेषण की ट्रेसिंग मस्तिष्क में neuronal नेटवर्क के गठन का अध्ययन करने के लिए और सर्किट के गठन को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करता है.

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Protocol

1. Hindbrain Electroporation

1.1 अंडा हैंडलिंग

  1. एक humidified इनक्यूबेटर (37-38.5 डिग्री सेल्सियस) में क्षैतिज अंडे रखें. भ्रूण वे 16-17 (एच एच) मंच (25-30 somites) तक पहुँचने, ऊष्मायन के 65-70 घंटे के बाद electroporated कर रहे हैं.
  2. इनक्यूबेटर से अंडे निकालें, वे क्षैतिज स्थिति में रहते हैं.

1.2 तैयारी

  1. कांच capillaries (0.5 मिमी व्यास) खींचो.
  2. पल्स जनरेटर के लिए एक एडाप्टर धारक के साथ तुला एल के आकार का सोने Genetrodes इलेक्ट्रोड (3 मिमी व्यास) कनेक्ट. Electroporation मापदंडों 25 वोल्ट, 5 नाड़ी संख्या, 45 मिसे नाड़ी लंबाई, 300 मिसे नाड़ी अंतराल में शामिल हैं.
  3. एक मुँह पिपेट, 10 मिलीलीटर सिरिंज सुई, parafilm के स्ट्रिप्स, एक नरम ब्रश, तेज विदारक कैंची और 25 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस समाधान तैयार है. यह राशि आम तौर पर एक अंडा ट्रे (18 अंडे) को संभालने के लिए पर्याप्त है.
  4. डीएनए plasmids के एक पर्याप्त मिश्रण (5 ग्राम / μl प्रत्येक) तैयार करें औरडीएनए इंजेक्शन कल्पना करने के लिए 0.025% फास्ट ग्रीन डाई के बारे में जोड़ें. आमतौर पर 4 μl की एक मात्रा एक ट्रे के इंजेक्शन के लिए पर्याप्त है.

1.3 Windowing, इंजेक्शन और electroporation

  1. 70% इथेनॉल के साथ अंडे के गोले साफ करें.
  2. हवा के लिए भ्रूण समय जोखिम कम करने के लिए एक समय में एक अंडे की संभाल लेना.
  3. कैंची के साथ समाप्त होता अंडा पोल में एक छेद बनाओ और सिरिंज के साथ albumin की 3-4 मिलीलीटर हटा दें. यह व्यवहार्यता को कम कर देता है के रूप में एल्बुमिन की एक बड़ी राशि न निकालें.
  4. विदारक कैंची का उपयोग अंडे का खोल के ऊपरी केंद्र पर एक छोटा सा अंडाकार खिड़की (2.5 एक्स 2 सेमी आकार) खोलें.
  5. पूरी प्रक्रिया के दौरान सूखापन को रोकने के लिए भ्रूण के शीर्ष पर पीबीएस की कुछ बूंदें टपक.
  6. गिलास में डीएनए मिश्रण की एक छोटी राशि का लोड एक मुँह पिपेट का उपयोग केशिका.
  7. आप की ओर अपने पीछे अंत के साथ भ्रूण रखें. भ्रूण स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है के रूप में कोई स्याही इंजेक्शन इस स्तर पर आवश्यक है. स्याही इंजेक्शन बढ़ता बचनाभ्रूण अस्तित्व. ~ 45 डिग्री पर केश पकड़ कर दुम पश्चमस्तिष्क घुसना. भ्रूण के चारों ओर से किसी भी झिल्ली न निकालें. हवाई बुलबुले बनाने के बिना पश्चमस्तिष्क लुमेन और साँस छोड़ते में ध्यान से डीएनए समाधान इंजेक्षन. डीएनए समाधान पूर्व से फैलता है.
  8. तुरंत डीएनए इंजेक्शन के बाद, सटीक एपी और आप को लक्षित करने के उद्देश्य डीवी पश्चमस्तिष्क स्थिति में समानांतर इलेक्ट्रोड जगह. यह व्यवहार्यता को कम कर सकते हैं के रूप में, दिल को छू बिना थोड़ा औदरीयता इलेक्ट्रोड पुश. Electroporator नाड़ी. इलेक्ट्रोड (चित्रा 1 ए) विद्युत चालकता इंगित करने के लिए बुलबुले के साथ कवर किया जाना चाहिए.
  9. ध्यान से इलेक्ट्रोड हटाने और भ्रूण शांत करने के लिए और बुलबुले को दूर करने के लिए पीबीएस की कुछ बूंदें टपक. ऊष्मायन के दौरान सुखाने को रोकने के लिए एक parafilm पट्टी साथ ठीक से खोलने अंडा सील. नरम ब्रश के साथ पीबीएस में इलेक्ट्रोड धो लें.
  10. समय के वांछित लंबाई के लिए इनक्यूबेटर में अंडे रखें. भ्रूण के अस्तित्व के 2-3 दिनों के बाद लगभग 90% हैइलेक्ट्रोपोरेशन, और 50% electroporation के बाद 12 दिनों तक कम कर देता है.

2. भ्रूण का विश्लेषण

2.1 फ्लैट माउंट तैयारी और immunofluorescence

  1. पश्चमस्तिष्क के फ्लैट माउंट तैयारी आसानी से एक खुर्दबीन या एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत एक्सोन कल्पना करने E6.5 अप करने के लिए किया जा सकता है.
  2. झिल्ली और रक्त वाहिकाओं से अलग से ध्यान से भ्रूण काटना. पीबीएस युक्त लेपित पेट्री डिश - एक छोटे सिलिकॉन में भ्रूण रखें. पीछे की ओर का सामना करना पड़ टंगस्टन पिन के साथ डिश के लिए भ्रूण देते हैं. पश्चमस्तिष्क तेज कांच capillaries का उपयोग कर छत की थाली में एक पृष्ठीय भट्ठा प्रदर्शन करना.
  3. तेज चिमटी और सूक्ष्म कैंची का प्रयोग सिर के ऊपरी भाग पकड़ और विजय - स्तम्भ से दुम को बहुत ध्यान से पश्चमस्तिष्क ऊतक खींच. पश्चमस्तिष्क की जुदाई के बाद एक स्वच्छ तैयारी तक पहुंचने के लिए शेष उदर ऊतकों को हटा दें.
  4. 4 के साथ पश्चमस्तिष्क सेतेकमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान (आरटी). पीएफए ​​दूर करने के लिए पीबीटी (PBS/0.1% ट्राइटन X-100) के साथ पश्चमस्तिष्क धो लें.
  5. फ्लैट घुड़सवार hindbrains में इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए अवरुद्ध समाधान के 500 μl (4 पर 1 सेंट एंटीबॉडी ° पीबीटी साथ सी. धो (15 मिनट एक्स 3) के साथ आरटी सेते से कम 2 घंटे के लिए पीबीटी और सेते में बकरी सीरम के 5% जोड़ें. सेते आरटी पर 2 घंटे के लिए 2 एन डी एंटीबॉडी के साथ. पीबीटी (15 मिनट एक्स 3) के साथ धोएं.
  6. एक गिलास स्लाइड पर पीछे की ओर का सामना करना पड़ पश्चमस्तिष्क रखें. पश्चमस्तिष्क पर फ्लोरोसेंट बढ़ते मीडिया जोड़ें. स्लाइड पर पश्चमस्तिष्क समतल करने के लिए कांच capillaries या टंगस्टन सुई का प्रयोग करें.
  7. कवर पर्ची से ऊतक के निचोड़ को रोकने के लिए प्रत्येक कोने में तेल की एक छोटी राशि जोड़ें. पश्चमस्तिष्क के शीर्ष पर एक कवर पर्ची ध्यान जगह है और हवाई बुलबुले से बचें. पालन ​​करने के लिए कांच के किनारों को कवर करने के लिए नेल पॉलिश जोड़ें.

2.2 क्रायो वर्गों और इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. ब्रेनस्टेम सीए की क्रायो वर्गोंएन axonal trajectories कल्पना करने के लिए किसी भी स्तर पर प्रदर्शन किया. फिर भी, E6.5 के बाद यह भी मोटी हो जाती है जो फ्लैट घुड़सवार भ्रूण में axons कल्पना करने में कठिनाई के कारण पसंदीदा तरीका होना चाहिए. इसके अलावा, synapses के प्रदर्शन ऊतक और एक खुर्दबीन के नीचे एक उच्च बढ़ाई देखने के सेक्शनिंग की आवश्यकता है.
  2. भ्रूण काटना और सभी आसपास के ऊतकों को हटा दें. पीबीएस के साथ कुल्ला. सूक्ष्म कैंची और तेज चिमटी का उपयोग मज्जा की दुम भाग में भ्रूण काटें. सेरिबैलम और मध्यमस्तिष्क के बीच एक व्यापक चीरा और पूरे मस्तिष्क को हटा दें. ऊतक मज्जा, पोंस और सेरिबैलम शामिल करना चाहिए.
  3. पीबीएस (10 मिनट एक्स 3) के साथ कुल्ला, 4 में रात भर के लिए 4% पीएफए ​​(पर) डिग्री सेल्सियस में brainstem फिक्स, और पर 4 डिग्री सेल्सियस डूबने तक के लिए 30% sucrose के साथ सेते हैं.
  4. अक्टूबर (इष्टतम काटना तापमान) परिसर के साथ एक क्रायो मोल्ड में पश्चमस्तिष्क शामिल करें, और ठंड के रूप में कहीं 11 वर्णित तक -20 डिग्री सेल्सियस पर यह जगह.
  5. स्लाइड सूखी. आरटी पर 2 घंटे के लिए प्रत्येक स्लाइड पर 100 μl अवरुद्ध समाधान जोड़ें. एंटीबॉडी के 100 μl (वांछित एकाग्रता के लिए अवरुद्ध समाधान में पतला) जोड़ें. 1 सेंट और 2 एन डी के लिए एंटीबॉडी ऊष्मायन अवधि 4 पर है क्रमशः आरटी पर डिग्री सेल्सियस या 2 घंटा,. प्रत्येक ऊष्मायन समय के लिए, धीरे सूखापन को रोकने के लिए स्लाइड के शीर्ष पर parafilm पट्टी जोड़ें. एंटीबॉडी के बीच पीबीएस (10 मिनट एक्स 3) के साथ धोएं. यदि आवश्यक हो, आरटी पर 20 मिनट के लिए पीबीएस में पतला 1:1,000 DAPI (4'-6 diamidino-2-phenylindole), जोड़ें. पीबीएस के साथ कुल्ला.
  6. फ्लोरोसेंट बढ़ते मीडिया के साथ स्लाइड माउंट. विश्लेषण से पहले 1 घंटे के लिए सूखी चलो.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल हाल ही में लड़की पश्चमस्तिष्क 10 में interneurons के डीए 1 उपसमूह की axonal पैटर्न और प्रक्षेपण साइटों को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. विशेष रूप से इन axons लेबल करने के लिए, पहले से रीढ़ की dI1 न्यूरॉन्स 8,12,13 के लिए विशिष्ट के रूप में बताया गया है कि एक बढ़ाने तत्व (Atoh1), पश्चमस्तिष्क DA1 कोशिकाओं 10 में व्यक्त होने की पुष्टि की गई थी. तत्व Cre recombinase और प्लाज्मिड एक Cre निर्भर साइटोप्लाज्मिक GFP संवाददाता (, चित्रा 1BI pCAGG-LoxP बंद करो की LoxP-cGFP) के साथ E2.75 पर सह electroporated के लिए नदी के ऊपर क्लोन किया गया था. Hindbrains फ्लैट माउंट तैयारी द्वारा 48 घंटा निम्नलिखित electroporation के विश्लेषण और दो ​​विपरीत पार्श्व आरोही axonal प्रक्षेपण पैटर्न (2A चित्रा) से पता चला रहे थे, एक पथ के लिए विशेष रूप से एक पृष्ठीय रज्जु अथवा रज्जु के सामन रचना में लम्बी कि 6-7 rhombomeres पर स्थित DA1 न्यूरॉन्स से निकाला गया था, जबकि अन्य rhombomeres 2-5 और एक पार्श्व रज्जु अथवा रज्जु के सामन रचना में विस्तार से जन्म लिया है.

14,15 लागू किया गया था. दो पंजाब हथियार (पीबी सीएजी LoxP बंद LoxP-mGFP-पंजाब) के बीच क्लोन एक संवाददाता Cre पर सशर्त-myristoylated-GFP (mGFP) कैसेट, Atoh1 साथ E2.75 पर electroporated था :: Cre बढ़ाने और Transposase वेक्टर (सीएजी :: PBase). इस रणनीति में, electroporated Cre पर सशर्त mGFP लड़की गुणसूत्रों में एकीकृत है और फलस्वरूप रोक कैसेट DA1 कोशिकाओं (चित्रा 1BII, 10) में GFP के लंबे समय तक अभिव्यक्ति सक्षम करने के लिए, केवल DA1 न्यूरॉन्स में निकाल दिया जाता है. बल्कि यह कोशिका द्रव्य में पतला किया जा रहा से axonal झिल्ली के साथ स्थानीय है कि इस तरह की झिल्ली को GFP tethers यह की myristoylated फार्म. Brainstems E13.5 पर एकत्र की है और बाण के समान वर्गों (चित्रा 2 बी) में विश्लेषण किया गया. डीए 1 एक्सोन सेरिबैलम में जमा करने के लिए और बाहरी जीआर के विस्तार की दिशा पाए गए Zic1 + कोशिकाओं द्वारा चिह्नित है जो anular परत (EGL),.

सेरिबैलम में DA1 axons की synaptic लक्ष्य भी विश्लेषण किया गया. E2.75 भ्रूण synaptic पुटिका प्रोटीन 2 (SV2) GFP Atoh1 :: Cre बढ़ाने और पंजाब Transposase (चित्रा 1BIII) के साथ प्लाज्मिड संवाददाता 16,17, साथ electroporated थे. इस विधि DA1 axonal टर्मिनी की presynaptic vesicles में GFP संवाददाता की अभिव्यक्ति के लिए सक्षम बनाता है. सेरिबैलम E13.5 में sectioned था और सामान्य पूर्व synaptic मार्कर synaptotagmin 18,19, साथ ही साथ Purkinje परत (आंकड़े 3 ए, 3 बी) लेबल कि calbindin के साथ दाग. SV2-+ GFP synaptic vesicles सेरिबैलम में DA1 पश्चमस्तिष्क interneurons के synaptic कनेक्शन का संकेत है, Purkinje परत सहित कई अनुमस्तिष्क क्षेत्रों में पाया गया.

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चित्रा 1 (ए) E2.75 लड़की hindbrain में electroporation तकनीक का चित्रण (बी) सशर्त पश्चमस्तिष्क DA1 interneurons लेबल किया plasmids के योजना, (मैं):.. Constructs Cre पर recombinase सीडीएनए के लिए नदी के ऊपर क्लोन Atoh1 बढ़ाने तत्व शामिल और एक ट्रांसक्रिप्शनल रोक कैसेट CAGG बढ़ाने / प्रमोटर मॉड्यूल और cytoplasmic GFP जीन (cGFP) के बीच में डाला जाता है, जिसमें प्लाज्मिड एक सशर्त संवाददाता,. . DA1 न्यूरॉन्स में GFP की सशर्त अभिव्यक्ति द्वारा Atoh1 :: Cre (द्वितीय) प्रेरित है: अनिवार्यता से पश्चमस्तिष्क कोशिकाओं लेबल PiggyBac स्थानांतरण विधि. निर्माणों प्लाज्मिड Atoh1 :: Cre बढ़ाने, एक Cre पर सशर्त संवाददाता कैसेट, myristoylated GFP (mGFP) दो पंजाब हथियार (पीबी सीएजी LoxP-STOPLoxP-mGFP-पंजाब) के बीच क्लोन है जो में, और एक Pbase Transposase प्लाज्मिड शामिल हैं.डीए 1 न्यूरॉन्स के जीनोम में संवाददाता कैसेट का एकीकरण कैग :: PBase और Atoh1 :: Cre वैक्टर द्वारा संचालित है. (Iii): पश्चमस्तिष्क interneurons की synaptic लक्ष्य लेबल करने के लिए एक समान PiggyBac स्थानांतरण विधि. प्लाज्मिड Cre पर सशर्त संवाददाता दो पंजाब हथियार (पीबी LoxP बंद LoxP-SV2 GFP-पंजाब) के बीच घिरे एक synaptic SV2-GFP के शामिल है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. डीए 1 interneurons के axonal trajectories के (ए):. E4.5 पश्चमस्तिष्क के एक फ्लैट पर चढ़कर तैयारी दो आरोही DA1 axonal इलाकों (हरे, तीर) को दर्शाता है. neurofillament मार्कर 3A10 (लाल) rhombomere सीमाओं को चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (बी) एक बाण के समानE13.5 भ्रूण की सेरिबैलम की धारा सेरिबैलम में जमा डीए 1 एक्सोन (हरा) को दर्शाता है. EGL कोशिकाओं Zic1 (लाल) के साथ लेबल रहे हैं. EGL, विदेश बारीक परत, स्केल बार चिह्नित किया है.

चित्रा 3
चित्रा 3. डीए 1 interneurons के synaptic लक्ष्य (ए):. लेबल नाभिक को निशान Purkinje परत और DAPI को Calbindin साथ E13.5 सेरिबैलम दाग की एक बाण के समान अनुभाग (गुलाबी) (नीला). (बी). ए SV2-GFP में चिह्नित क्षेत्र के एक उच्च बढ़ाई दृश्य DA1 synapses (हरा) सेरिबैलम के Purkinje परत (गुलाबी) में दिखाया गया है लेबल. सामान्य पूर्व synaptic मार्कर synaptotagmin (लाल) SV2-+ GFP synapses (पीला, तीर) के साथ सह व्यक्त किया है. Calb, Calbindin, एस टैग, synaptotagmin. स्केल सलाखों के रूप में चिह्नित कर रहे हैं.

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Discussion

ओवो electroporation में लड़की के तंत्रिका तंत्र के विकास 20 के दौरान सेल विनिर्देश और axonal मार्गदर्शन की जांच के लिए एक व्यवहार्य, विश्वसनीय और प्रभावी उपकरण है. इस प्रोटोकॉल में हम विशिष्ट interneurons के सशर्त लेबलिंग जो सक्षम बढ़ाने तत्वों का उपयोग E2.75 पर लड़की hindbrain में electroporation की एक विधा का वर्णन है. इस रणनीति embryogenesis के उन्नत चरणों में axonal मार्गों, अनुमानों और synaptic साइटों पर नज़र रखने में सक्षम बनाता है जो लड़की के जीनोम में विदेशी जीन डालने के लिए PiggyBac की मध्यस्थता स्थानांतरण प्रणाली के साथ जोड़ा जाता है.

लड़की hindbrain में लेबल एक्सोन / synapses के लिए पिछला तरीकों लेबलिंग या प्रयोगों 21-23 ग्राफ्टिंग शास्त्रीय प्रतिगामी या अग्रगामी डाई शामिल थे. ये अध्ययन पश्चमस्तिष्क आरोही और axonal इलाकों उतरते पर महत्वपूर्ण निष्कर्ष योगदान दिया. हालांकि, कुछ trajectories और अनुमानों इन सेलुलर दृष्टिकोण से अनदेखी कर रहे थे. Addit में आयन की सूचना दी funiculi में अनुमान है कि न्यूरॉन्स की उपसमूहों की आणविक पहचान का खुलासा नहीं किया जा सका. हमारा संयुक्त electroporation की विधि और आनुवंशिक त्रुटि निरंतर axonal नेविगेशन और प्रक्षेपण लक्ष्य 10 के लिए उनके विनिर्देश चरणों से चयनित पश्चमस्तिष्क न्यूरॉन्स के विकास का पालन करने की अद्वितीय क्षमता प्रदान करता है. विशेष रूप से, हमारे दृष्टिकोण पहले से समय 8,9 की छोटी अवधि के लिए रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय interneurons की axonal trajectories का पता लगाने के लिए आवेदन किया था.

वर्णित उपकरण भी axonal अनुमानों कि सरकार आणविक तंत्र को उजागर करने के लिए सेवा कर सकते हैं, जेनेटिक कोड (जैसे लिम होम्यो डोमेन कोड के रूप में) चुनिंदा axonal विकास की enhancer-Cre/Lox-based दृष्टिकोण और प्रभाव का उपयोग कर एक निश्चित न्यूरोनल उपसमूह में संशोधित किया गया है और कनेक्टिविटी 8,10 पीछा किया गया था. इसलिए, इस प्रोटोकॉल सेल लेबलिंग के लिए, लेकिन यह भी वांछित कोशिकाओं पर आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए न केवल उपयोगी हो सकता है.

ve_content "ओवो जीन वितरण पद्धति में एक के रूप में electroporation के लाभ के> एक electroporation के 24 निम्नलिखित 3 घंटे के भीतर पहले से ही मनाया जाता है जो अभिव्यक्ति की तेज़ी है. हालांकि, बाद में विकास में कोशिका विभाजन के साथ भाग शुरू की जीन fades की क्षणिक अभिव्यक्ति चरणों. इस सीमा को ओवरराइड करने के लिए हम ओवो जीन प्रविष्टि के लिए PiggyBac स्थानांतरण विधि का इस्तेमाल किया. इस उपकरण के पिछले विधियों की तुलना में, electroporation के बाद ज्यादा उन्नत चरणों के लिए एक मजबूत ढंग से axons और synapses के ट्रैकिंग सक्षम बनाता है. हम आसानी से पता लगा सकता है इलेक्ट्रोपोरेशन (E14.5) के बाद 12 दिनों के लिए न्यूरॉन्स ऊपर लेबल, यह भी अंडे सेने के बाद सहित समय की लंबी अवधि के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए अत्यधिक प्रशंसनीय है.

एक स्थानिक और लौकिक प्रतिबंधित शिष्टाचार में कोशिकाओं की एकतरफा लक्ष्यीकरण पर लड़की न्यूरल ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन रिले का एक अन्य लाभ. इस ख पर axonal प्रक्षेप पथ अनुरेखण की अनुमति देता हैएक चरण दर चरण आधार में पश्चमस्तिष्क के पक्ष के अन्य संगठनों, जो स्तनधारियों में पालन करने के लिए कठिन है. यह ज्यादातर एकतरफा अनुमानों का पता लगाने के लिए और ipsi और विपरीत पार्श्व axonal इलाकों की उत्पत्ति के बीच अलग करने की क्षमता उलझी, दोनों न्यूरल ट्यूब पक्षों में वांछित कोशिकाओं की लेबलिंग में क्योंकि रोगाणु लाइन transgenesis परिणाम है. अंत में, चूहों और लड़की brainstem न्यूरॉन्स 3,5 के बीच समरूपता के उच्च स्तर के आधार पर, हमारी तकनीक तारों और विकासशील कशेरुकी hindbrain में न्यूरॉन्स की विधानसभा पर नए ज्ञान हासिल करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.

हमारे तकनीक के फायदे में देरी, बढ़ाने तत्वों का उपयोग न्यूरल ट्यूब सेल विशिष्टता और बढ़ाने-GFP के निर्माणों की अभिव्यक्ति के समय के लिए सावधानी से मूल्यांकन की आवश्यकता है चूजा में रिपोर्टर जीन की सशर्त अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए, कुछ बढ़ाने तत्वों की शुरूआत में पाए गए हमारा सिस्टम कुछ जबकि, hindbrain में GFP के एक गैर प्रतिबंधित अभिव्यक्ति ड्राइवदूसरों के एक गैर विशिष्ट जल्दी में अभिव्यक्ति नहीं, बल्कि देर से, न्यूरल ट्यूब चरणों (नहीं दिखाया डेटा) झुकेंगे. इसके अलावा, हमारी रणनीति वर्तमान में रिपोर्टर जीन की एक अस्थायी विशिष्ट अभिव्यक्ति का समर्थन नहीं करता. इसलिए, हम संभवतः अलग अनुमस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए अलग axonal इलाकों परियोजना सकता है जो DA1 interneurons की जल्दी या बाद में जन्मे उपसमूहों के बीच भेद नहीं कर सकते. अस्थायी पर / बंद पश्चमस्तिष्क न्यूरॉन्स में GFP की अभिव्यक्ति स्विच करने के लिए अतिरिक्त उपकरण की जेनेटिक निर्माण और अधिक ठीक भ्रूण / वयस्क मस्तिष्क में axonal trajectories और synapses के विकास का पालन करने के लिए लाभप्रद होगा. अंत में, हमारे इलेक्ट्रोपोरेशन रणनीति का एक तकनीकी खामी अंडा, रक्त वाहिकाओं और घेर झिल्ली में अपनी स्थिति के कारण E2.75 -3 परे चरणों में यह हेरफेर करने के लिए भ्रूण की पहुंच है. इस सीमा के बाद विकास में पैदा होते हैं जो hindbrain के न्यूरॉन्स की अतिरिक्त उपप्रकारों में हमारे plasmids के लक्ष्यीकरण से बचाता है.

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Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes BTX, Harvard Apparatus 45-0162
pulse generator, ECM 830 BTX, Harvard Apparatus 45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound Tissue-Tek Sakura 4583 O.C.T. Compound
Nail Polish From Any Commercial Supplier

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References

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चिकी भ्रूण में axonal trajectories और Synaptic के लक्ष्य का पता लगाने के लिए hindbrain के electroporation
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Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A.,… More

Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (75), e50136, doi:10.3791/50136 (2013).

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