Elektroporatie van de hindbrain om Axonale Trajectories en Synaptic Doelen Trace in de Chick Embryo

Summary

Hoe neuronale netwerken zijn in de embryonale hersenen opgericht is een fundamentele vraag in ontwikkelingsstoornissen neurobiologie. Hier combineerden we een electroporatietechniek met nieuwe genetische hulpmiddelen, zoals Cre / Lox-plasmiden en piggyBac-gemedieerde DNA omzetting systeem in de aviaire hindbrain om dorsale interneurons labelen en volgen hun axonale projecties en synaptische doelen op verschillende ontwikkelingsstadia.

Abstract

Elektroporatie van het kuiken embryonale neurale buis heeft vele voordelen zoals het snel en efficiënt voor de expressie van vreemde genen in neuronale cellen. In dit manuscript bieden we een methode die uniek laat zien hoe DNA electroporate in de aviaire hindbrain op E2.75 om specifiek label een subset van neuronale voorlopercellen, en hoe ze hun axonale projecties en synaptische doelen volgen op veel geavanceerde stadia van ontwikkeling, tot E14.5. We hebben gebruik gemaakt van nieuwe genetische tools, waaronder specifieke enhancer elementen, Cre / Lox - gebaseerde plasmiden en de piggyBac-gemedieerde DNA omzetting systeem om GFP expressie rijden in een subtype van hindbrain cellen (de dorsale grootste subgroep van interneuronen, DA1). Axonale trajecten en doelstellingen van DA1 axonen worden gevolgd bij vroege en late embryonale stadia bij verschillende hersenstam regio. Deze strategie draagt ​​geavanceerde technieken voor targeting cellen van belang in de embryonale achterhersenen en voor tracing vorming circuit op verschillende stadia van ontwikkeling.

Introduction

De hindbrain vertegenwoordigt een belangrijke relais knooppunt van het zenuwstelsel door te communiceren tussen de centrale en perifere zenuwstelsel via stijgende en dalende neuronale netwerken. Het regelt basisfuncties zoals ademhaling, bewustzijn, gehoor, en motorische coördinatie ^1-3. Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, wordt de gewervelde hindbrain tijdelijk opgedeeld langs de anterior-posterior (AP) as in repetitieve rhombomeres, waarin verschillende neuronale celtypes worden gevormd en het genereren van meerdere hersenstamkernen centra ^4. De hindbrain is ook verdeeld langs de dorsale-ventrale (DV)-as in een basale en alar plaat, waarbij discrete neuronale voorlopercellen worden gespecificeerd en differentiëren in verschillende DV locaties ^3,5,6. Hoe de vroege AP en DV-specifieke neuronale patronen zijn voor de instelling van functionele hersenstam circuitries is grotendeels onbekend.

Om kennis te verwerven over deze fundamentelebetrokken zijn gereedschap nodig om specifieke subsets van neuronen in de vroege achterhersenen label en hun axonale trajecten en connectiviteit sporen op meer gevorderde stadia. We hebben eerder gebruikte specifieke enhancer elementen, en een Cre / loxP based voorwaardelijke expressie systeem om axonale wijze dorsale spinale interneuronen in de vroege kippenembryo ^7-9. In het huidige manuscript hebben we de hindbrain gerichte en een upgrade van de experimentele paradigma voor de etikettering late embryonale hindbrain interneuronen, axonen en hun synaptische doelstellingen, met behulp van een gemodificeerde elektroporatie strategie en de piggyBac - gemedieerde DNA-omzetting. Onze nieuwe strategie maakt het labelen van verschillende neuronale subtypes in een kant van de achterhersenen en de positie van hun axonale uitsteeksels en synaptische plaatsen in verschillende embryonale stadia, van 2 tot 12 dagen na elektroporatie. Op basis van deze methode, we bestempeld als de dorsale-grootste subgroep van hindbrain interneuronen (dA1/Atoh1 ⁺ 10.

De combinatie van kuiken elektroporatie, genetische traceren van neuronen en analyse van projectie gebieden op veel geavanceerde stadia van ontwikkeling vormt een uniek platform om de vorming van neuronale netwerken in de hersenen te bestuderen en moleculaire mechanismen die de vorming circuit regelen helderen.

Protocol

1. Hindbrain Elektroporatie

1.1 Ei behandeling

1. Plaats de eieren horizontaal in een bevochtigde incubator (37-38,5 ° C). Embryo's worden geëlektroporeerd na 65-70 uur incubatie, toen zij 16-17 (HH) fase (25-30 somieten) te bereiken.
2. Verwijder de eieren uit de broedmachine, ze in de horizontale stand.

1.2 Voorbereidingen

1. Trek de glazen capillairen (0,5 mm diameter).
2. Sluit gebogen L-vormige gold Genetrodes elektroden (3 mm diameter) met een adapter houder de pulsgenerator. Elektroporatie parameters omvatten 25 volt, 5 puls nummers, 45 msec puls lengte, 300 msec puls intervallen.
3. Bereid een mond pipet, 10 ml injectienaald, parafilm strips, een zachte borstel, scherpe dissectie schaar en 25 ml steriele PBS-oplossing. Deze hoeveelheid is gewoonlijk voldoende om een ​​eiertray (18 eieren) te behandelen.
4. Bereid voldoende mengsel van DNA-plasmiden (5 ug / ul elk) envoeg ongeveer 0,025% Fast Green kleurstof om DNA injectie te visualiseren. Meestal een volume van 4 pl voldoende voor het injecteren van een bak.

1.3 Windowing, injectie en elektroporatie

1. Reinig eierschalen met 70% ethanol.
2. Overweg met een ei op een moment om embryonale blootstelling te minimaliseren aan de lucht.
3. Maak een gat in het ei paal met de schaar uiteinden en verwijder 3-4 ml van albumine met de spuit. Verwijder niet een grotere hoeveelheid albumine, omdat het lagere levensvatbaarheid.
4. Open een kleine ovale venster (2,5 x 2 cm grootte) op het bovenste midden van de eischaal met het ontleden schaar.
5. Druppel enkele druppels PBS bovenop het embryo tot droog gedurende het gehele proces te voorkomen.
6. Plaats een kleine hoeveelheid van het DNA mengsel in de glazen capillair met een mondpipet.
7. Plaats de embryo met zijn achterste uiteinde naar u toe. Geen inkt injectie vereist in dit stadium de embryo duidelijk zichtbaar. Het vermijden inktinspuitingproces toeneemtembryonale overleving. Doordringen in de caudale hindbrain door die de capillaire bij ~ 45 °. Verwijder geen membraan van rond het embryo. Injecteren van DNA-oplossing voorzichtig in de hindbrain lumen en uitademen zonder vorming van luchtbellen. DNA oplossing verspreidt voren.
8. Onmiddellijk na DNA-injectie, plaatst u de parallelle elektroden precies op het AP en DV hindbrain positie je doel te richten. Duw de elektroden iets ventraal zonder het aanraken van het hart, als het kan levensvatbaarheid verminderen. Pulseren de electroporator. Elektroden worden bedekt met bubbels elektrische geleidbaarheid geven (Figuur 1A).
9. Verwijder voorzichtig de elektroden en druppelen paar druppels PBS om het embryo te koelen en om luchtbellen te verwijderen. Verzegelen het ei goed openen met een parafilm strip drogen om te voorkomen dat tijdens de incubatie. Wassen elektroden in PBS met de zachte borstel.
10. Plaats ei in de incubator voor de gewenste tijdsduur. Overleving van embryo's ongeveer 90% 2-3 dagen naelektroporatie, en vermindert tot 50% 12 dagen na elektroporatie.

2. Analyse van embryo's

2.1 Flat-mount voorbereiding en immunofluorescentie

1. Flat-mount voorbereiding van de achterste hersenen kan worden uitgevoerd tot E6.5 gemakkelijk axonen visualiseren onder een microscoop of een stereo-microscoop.
2. Ontleden de embryo zorgvuldig door te scheiden van de omliggende vliezen en bloedvaten. Plaats de embryo in een kleine siliconen - gecoate petrischaal met PBS. Bevestig het embryo om de schotel met wolfraam pinnen naar dorsaal. Voer een dorsale spleet in de hindbrain dak-plaat met scherpe glas haarvaten.
3. Gebruik geen scherpe pincet en micro-schaar houdt het bovenste deel van het hoofd en trek het hindbrain weefsel zeer zorgvuldig uit rostraal van caudale. Na scheiding van de hindbrain nog overblijvende ventrale weefsels in een schone bereiding bereiken.
4. Incubeer de hindbrain met 4% Paraformaldehyde (PFA) oplossing gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur (RT). Was de hindbrain met PBT (PBS/0.1% Triton X-100) aan PFA verwijderen.
5. Voor Immunofluorescentie in flat-gemonteerde hindbrains voeg 500 ul van blokkeeroplossing (5% van de geit serum in PBT en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur incuberen met 1 ^st ON antilichaam bij 4 ° C. Was met PBT (15 min x 3). Incubate met 2 ^nd antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. wassen met PBT (15 min x 3).
6. Plaats de hindbrain geconfronteerd dorsally op een glasplaatje. Voeg fluorescerende montage media op de achterste hersenen. Gebruik glazen capillairen of wolfraam naalden om de hindbrain op de dia plat.
7. Voeg wat vet op elke hoek te voorkomen knijpen van het weefsel door het dekglas. Plaats voorzichtig een dekglas op de top van de hindbrain en luchtbellen te voorkomen. Voor de naleving toe te voegen nagellak aan glaskanten dekken.

2.2 Cryo-secties en Immunofluorescentie

1. Cryo-delen van de hersenstam can worden uitgevoerd in elk stadium om axonale trajecten visualiseren. Toch, na E6.5 moet dit de aangewezen methode vanwege de moeilijkheid om axonen visualiseren in de flat-gemonteerde embryo, die te dik zijn. Bovendien demonstratie van synapsen vereist snijden van het weefsel en een hoge vergrotingsfactor zicht onder een microscoop.
2. Ontleden het embryo en verwijder alle omliggende weefsels. Spoelen met PBS. Snijd het embryo in het caudale deel van de medulla met behulp van micro-schaar en scherpe pincet. Maak een brede incisie tussen de kleine hersenen en de middenhersenen en verwijder de hele hersenstam. Het weefsel moet de medulla, pons en cerebellum bevatten.
3. Bevestig de hersenstam in 4% PFA nacht (ON) bij 4 ° C, spoelen met PBS (10 min x 3) en incubeer bij 30% saccharose ON bij 4 ° C tot zinken.
4. Integreer de hindbrain in een cryo-mal met oktober (Optimal Cutting Temperature) verbinding, en plaats deze bij -20 ° C tot bevriezing, zoals elders ¹¹ beschreven.
5. Droog de glaasjes. Voeg 100 gl blokkerende oplossing per glaasje 2 uur bij kamertemperatuur. Voeg 100 ul van antilichamen (verdund in de blockingbuffer de gewenste concentratie). Incubatietijd van 1 ^e en 2 ^e antistoffen AAN is bij 4 ° C of 2 uur bij KT, respectievelijk. Voor elke incubatietijd, voeg voorzichtig parafilm strip boven de dia voorkomen droogheid. Wassen met PBS (10 min x 3) tussen antistoffen. Indien nodig, voeg 1:1000 Dapi (4'-6-diamidino-2-fenylindool), verdund in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoelen met PBS.
6. Monteer de dia met fluorescerende montage media. Even laten drogen gedurende 1 uur vóór de analyse.

Representative Results

Dit protocol werd onlangs gebruikt om de axonale patronen en projectie plaatsen van DA1 subgroep van interneuronen te ontdekken in het kuiken hindbrain ^10. Specifiek worden deze met axons werd een enhancer element (Atoh1), dat eerder werd gekarakteriseerd als specifiek voor spinale neuronen DI1 ^8,12,13, bevestigd worden uitgedrukt in hindbrain DA1 cellen ^10. Het element werd stroomopwaarts gekloond om Cre recombinase en co-geëlektroporeerd bij E2.75 samen met een Cre-afhankelijke cytoplasmatische GFP reporter plasmide (pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-cGFP; Figuur 1BI). Hindbrains werden geanalyseerd 48 hr volgende elektroporatie door platte-mount voorbereiding en onthulde twee contra-laterale opgaande axonale projectie patronen (Figuur 2A), een landstreek is uitsluitend afkomstig is van DA1 neuronen gelegen aan rhombomeres 6-7 die langwerpig van een dorsale funiculus, terwijl de andere afkomstig uit rhombomeres 2-5 en uitgebreid in een laterale funiculus.

14,15. Een verslaggever Cre-voorwaardelijke-gemyristoyleerde-GFP (mGFP) cassette, gekloond tussen de twee PB armen (PB-CAG-LoxP-STOP-LoxP-mGFP-PB), werd geëlektroporeerd bij E2.75, samen met de Atoh1 :: Cre enhancer en transposase vector (CAG :: PBase). In deze strategie wordt de geëlektroporeerde Cre-voorwaardelijke mGFP geïntegreerd in de chick chromosomen en dus ook de STOP-cassette wordt verwijderd alleen in DA1 neuronen, waardoor langdurige expressie van GFP in DA1 cellen (Figuur 1BII; ^10). De gemyristoyleerde vorm van de GFP aanbinden aan het membraan zodat wordt gelokaliseerd langs de axonale membraan plaats van verdund in het cytoplasma. Brainstems werden verzameld bij E13.5 en geanalyseerd in sagittale secties (Figuur 2B). DA1 axons bleken te accumuleren in het cerebellum en zich naar de externe gr anular laag (EGL), die wordt gekenmerkt door Zic1 ⁺ cellen.

Synaptische doelstellingen van DA1 axonen in de kleine hersenen werden ook geanalyseerd. E2.75 embryo's werden geëlektroporeerd met synaptischeblaasjeseiwit 2 (SV2)-GFP reporter plasmide ^16,17, samen met Atoh1 :: Cre enhancer en de PB transposase (figuur 1BIII). Deze werkwijze maakt de expressie van de GFP reporter in de presynaptische vesicles DA1 axonale uiteinden. Het cerebellum was coupes E13.5 en gekleurd met de algemene presynaptische marker synaptotagmin ^18,19, en met calbindin de Purkinje laag (Figuren 3A, 3B) aanbrengt. SV2-GFP ⁺ synaptische blaasjes werden ontdekt in meerdere kleine hersenen regio's, met inbegrip van de Purkinje-laag, met vermelding van de synaptische verbindingen van DA1 hindbrain interneuronen in het cerebellum.

tp_upload/50136/50136fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50136/50136fig1.jpg "/>
Figuur 1 (A) Illustratie van de electroporatietechniek in E2.75 chick hindbrain (B) Regeling van de plasmiden gebruikt om conditioneel labelen hindbrain DA1 interneuronen, (I):.. Constructs onder de Atoh1 enhancerelement stroomopwaarts gekloond aan Cre-recombinase cDNA en een voorwaardelijke reporter plasmide, waarin een transcriptionele STOP cassette geplaatst tussen de CAGG enhancer / promoter module en het cytoplasmatische GFP-gen (cGFP). De conditionele expressie van GFP in DA1 neuronen wordt aangedreven door Atoh1 :: Cre (II):. PiggyBac de omzetting methode constitutief label hindbrain cellen. Constructen de Atoh1 :: Cre enhancer plasmide, een Cre-voorwaardelijke reporter cassette, waarbij gemyristoyleerde GFP (mGFP) wordt gekloneerd tussen twee PB armen (PB-CAG-LoxP-STOPLoxP-mGFP-PB) en een PBase transposase plasmide. Deintegratie van de reporter cassette in het genoom van DA1 neuronen wordt aangedreven door de CAG :: PBase en Atoh1 :: Cre vectoren. (III): Een soortgelijke piggyBac omzetting methode synaptische doelen van hindbrain interneuronen label. Het Cre-conditionele reporter plasmide bevat een synaptische SV2-GFP geflankeerd tussen twee PB armen (PB-LoxP-STOP-LoxP-SV2-GFP-PB). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. Axonale trajecten van DA1 interneuronen (A):. Een vlakke gemonteerde voorbereiding van E4.5 hindbrain toont twee oplopende DA1 axonen (groen, pijlen). De neurofillament marker 3A10 (rood) wordt gebruikt om rhombomere grenzen markeren. (B) Een sagittaledeel van de kleine hersenen van E13.5 embryo toont DA1 axonen (groen) zich ophopen in de kleine hersenen. De EGL cellen zijn gelabeld met Zic1 (rood). EGL, externe Granular Layer, is Schaalbalk gemarkeerd.

Figuur 3. Synaptische doelstellingen van DA1 interneuronen (A):. Een sagittale doorsnede van E13.5 cerebellum gekleurd met Calbindin (roze) naar mark Purkinje laag en DAPI (blauw) naar label kernen. (B). Een hogere vergroting weergave van het gemarkeerde gebied in A. SV2-GFP-gelabelde DA1 synapsen (groen) worden getoond in de Purkinje laag van het cerebellum (roze). De algemene pre-synaptische marker synaptotagmin (rood) is co-expressie met SV2-GFP ⁺ synapsen (geel, pijlen). CALB, Calbindin; S-Tag, synaptotagmin. Schaalbalken zijn gemarkeerd.

Discussion

In ovo elektroporatie is een haalbaar, betrouwbaar en doeltreffend instrument om celspecificatie en axonale begeleiding te onderzoeken tijdens chick ontwikkeling van het zenuwstelsel ^20. In dit protocol beschrijven we een wijze van elektroporatie in het kuiken hindbrain op E2.75 met enhancer elementen die de voorwaardelijke etikettering van specifieke interneuronen mogelijk. Deze strategie wordt gecombineerd met de piggyBac gemedieerde omzetting systeem om vreemde genen in te voegen in het kuiken genoom mogelijk te maken data volgen van axonale routes en macro synaptische plaatsen in een gevorderd stadium van de embryogenese.

Vorige methoden om label axonen / synapsen in het kuiken hindbrain inbegrepen classical retrograde of anterograde kleurstof etikettering of enten experimenten ^21-23. Deze studies hebben bijgedragen significante bevindingen op hindbrain stijgende en dalende axonen. Echter, sommige trajecten en projecties werden over het hoofd gezien door deze cellulaire benaderingen. In Addit ion, kon moleculaire identiteit van subgroepen van neuronen die geprojecteerd in de gerapporteerde funiculi niet worden onthuld. Onze gecombineerde methode van elektroporatie en aanhoudende genetische tracing biedt de unieke mogelijkheid om de ontwikkeling van geselecteerde neuronen hindbrain volgen uit de specificatie fasen axonale navigatie en projectie doelen ^10. Name, was onze aanpak eerder toegepast op de axonale banen van het ruggenmerg dorsale interneuronen voor kortere perioden ^8,9 traceren.

De genoemde gereedschap kan ook dienen om de moleculaire mechanismen die axonale uitsteeksels regelen ontdekken, genetische codes (zoals Lim homeo-domein code) werden selectief gemodificeerd in een bepaalde neuronale subgroep met de enhancer-Cre/Lox-based aanpak en het effect van axonale groei en connectiviteit werd gevolgd ^8,10. Vandaar, kan dit protocol niet alleen nuttig zijn voor de cel etikettering, maar ook voor genetische manipulaties op de gewenste cellen.

ve_content "> Een van de voordelen van elektroporatie als in ovo gentherapie methode is de snelheid van expressie, dat reeds waargenomen binnen 3 uur na elektroporatie ^24. De tijdelijke expressie van het geïntroduceerde gen verdwijnt met celdelingen op latere ontwikkeling stadia. Om deze beperking overschrijven hebben we gebruik gemaakt van de piggyBac omzetting methode voor in ovo geninsertie. Deze tool maakt het volgen van axonen en synapsen op een robuuste manier voor veel gevorderde stadia na elektroporatie, in vergelijking met eerdere methoden. Zoals we konden gemakkelijk te detecteren gelabelde neuronen tot 12 dagen na elektroporatie (E14.5), is het zeer aannemelijk deze benadering ook voor langere tijd, zoals na het uitkomen.

Een ander voordeel van het kuiken neurale buis elektroporatie relais op de eenzijdige gerichtheid van cellen in een ruimtelijke en temporele beperkte omgangsvormen. Dit maakt het opsporen axonale trajecten op both kanten van de hindbrain in een fase-by-stage basis, dat is moeilijker te volgen bij zoogdieren. Dit komt vooral omdat kiem-lijn transgenese resultaten in de etikettering van de gewenste cellen in beide neurale buis zijden, complicerende de mogelijkheid om eenzijdig projecties traceren en te scheiden tussen de oorsprong van ipsi-en contra-laterale axonen. Uiteindelijk, op basis van de hoge mate van homologie tussen muizen en kuiken hersenstam neuronen ^3,5, onze techniek een krachtig hulpmiddel om nieuwe kennis over het samenstel van kabels en van neuronen in de ontwikkelende gewervelde hindbrain.

Hoewel de voordelen van onze techniek het gebruik van enhancer elementen conditionele expressie van reportergenen rijden het kuiken neurale buis vereist zorgvuldige evaluatie van cel-specificiteit en timing van expressie van de enhancer-GFP constructen invoering van enkele enhancer elementen gevonden in ons systeem naar een niet-beperkte expressie van GFP in de hindbrain rijden, terwijl enkeleanderen leverde een niet-specifieke expressie te vroeg, maar laat, neurale buissegmenten (gegevens niet getoond). Bovendien is onze strategie niet ondersteunen momenteel een tijdelijke-specifieke expressie van het reporter-gen. Daarom kunnen we geen onderscheid maken tussen vroege of later geboren subgroepen van DA1 interneuronen, hetgeen mogelijk kan projecteren verschillende axonen te richten op verschillende cerebellaire gebieden. Genetische aanleg van extra instrumenten om tijdelijk over te schakelen aan / uit de expressie van GFP in hindbrain neuronen zal komen om nauwkeuriger de ontwikkeling van axonale trajecten en synapsen in de embryonale / volwassene hersenstam volgen. Tenslotte, een technisch nadeel van onze elektroporatie strategie is de ontoegankelijkheid van embryo deze manipulatie stadia dan E2.75-3, vanwege zijn positie in het ei, bloedvaten en omhullende vliezen. Deze beperking voorkomt dat de doelgerichtheid van onze plasmiden in extra subtypen van hindbrain neuronen die later in ontwikkeling zijn geboren.