Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Generación de ratas transgénicas por vía tópica doi: 10.3791/50146 Published: September 24, 2013

Summary

Los genes pueden ser manipulados durante el desarrollo de la corteza o el hipocampo de la rata en el útero a través de electroporación (IUE) en el E16, para permitir modificaciones rápidas y focalizadas en la conectividad neuronal para estudios posteriores de comportamiento o neuropatología en los animales adultos. Postnatal de imágenes in vivo para el control del éxito IUE se realiza mediante bioluminiscencia de la activación de luciferasa co-transfectadas.

Abstract

En electroporación in utero (IUE) es una técnica que permite la modificación genética de las células en el cerebro para investigar el desarrollo neuronal. Hasta ahora, el uso de IUE para investigar el comportamiento o la neuropatología en el cerebro adulto se ha limitado por métodos insuficientes para la vigilancia del éxito de la transfección IUE mediante técnicas no invasivas en animales postnatales.

Para el presente estudio, se utilizaron ratas E16 para la IUE. Después de la inyección intraventricular de los ácidos nucleicos en los embriones, el posicionamiento de los electrodos de pinza era crítico para la orientación o bien el desarrollo de la corteza o el hipocampo.

Ventricular co-inyección y la electroporación de un monitoreo gen de la luciferasa permitido de las células transfectadas después del nacimiento después de la inyección intraperitoneal luciferina en el anestesiados crías P7 vivo por bioluminiscencia in vivo, utilizando un dispositivo de IVIS Spectrum con el software de cuantificación 3D.

DISC1 humana de longitud completa en la corteza de rata dio lugar a hipersensibilidad anfetamina. GFP transfectadas-CO puede ser detectado en las neuronas post mortem por microscopía de fluorescencia en secciones criogénicas que indican la expresión de genes presentes en ≥ 6 meses después del nacimiento.

Llegamos a la conclusión de que imágenes de bioluminiscencia postnatal permite evaluar el éxito de las transfecciones transitorias con IUE en ratas. Las investigaciones sobre la influencia de los tópicos manipulaciones génicas durante neurodevelopment en el cerebro adulto y su conectividad se facilita en gran medida. Para muchas preguntas científicas, esta técnica puede complementar o incluso reemplazar el uso de ratas transgénicas y proporcionar una tecnología novedosa para la neurociencia conductual.

Introduction

El desarrollo de la electroporación in utero método (IUE), que permite una modulación de la expresión génica en el cerebro en desarrollo, ha sido un gran avance, ya que permitió estudiar el neurodesarrollo con relativa facilidad. 1-7 Cambios en los niveles de expresión de un gen diana en una región específica del cerebro durante el desarrollo embrionario y / o perinatal en los roedores se demostró de manera crítica la influencia proliferación neuronal, migración, arborización y conectividad. 8-10

La esquizofrenia es una enfermedad mental compleja, con síntomas agudos y crónicos que se han relacionado con alteraciones del desarrollo neurológico 11, 12 y, por tanto, muchos de los genes candidatos identificados para la esquizofrenia son investigados por posibles efectos de modulación sobre el desarrollo neurológico, como por ejemplo para la interrupción-en-la esquizofrenia -1 (DISC1) gen 13-15.

El desarrollo del cerebro es regulatcado por factores genéticos y sus interacciones con el medio ambiente que juegan un papel en la pre,-períodos de desarrollo peri y postnatal. Un factor de riesgo genético importante para diversos trastornos de comportamiento es DISC1 los 16 genes. DISC1 cables desmontables a defectos de la migración en los ratones 13, 17, y la manipulación de la expresión DISC1 en el desarrollo de la corteza por IUE se ha demostrado que el impacto comportamiento de los ratones adultos 18.

La manipulación de la expresión génica cerebro por IUE tiene varias ventajas sobre 19 la generación de líneas de animales transgénicos. En primer lugar, la expresión de genes dentro de las áreas de interés se logra en cuestión de semanas o meses en lugar de varias generaciones de cría líneas de roedores transgénicos. En segundo lugar, se evitan los mecanismos de compensación durante el desarrollo temprano que pueden blindar fenotipos en los animales de la línea germinal de ingeniería 20. En tercer lugar, a través de la orientación sólo una población celular específica o área específica del cerebro, migratio diferencias de proliferación pueden ser comparados directamente con la no-mutante o de control del lado contralateral si se eligen electroporaciones unilaterales. Por otro lado, IUE no tiene la exactitud de CRE / LOX temporización inducida-promotor impulsado de expresión y sólo una subpoblación de las células en un área determinada está dirigido conduce a una especie de mosaico de patrón de expresión génica.

Para muchas aplicaciones experimentales en roedores adultos, una transfección transitoria de un número limitado de células en una región del cerebro puede ser suficiente, o incluso deseado, de modo que la principal ventaja de la línea germinal, roedores-transgénicas estables es insignificante. De hecho, la IUE es útil para investigar si algunas células desarrolladas anormalmente puede afectar a toda una red de células o circuitos. Otra ventaja puede ser la capacidad de demostrar los efectos no-células autónomas de un gen debido a la naturaleza del mosaico de la exitosa. Por otra parte, la generación de ratas transgénicas y knockout se encuentra todavía en su infancia y el usode IUE en esta especie para el estudio de las consecuencias del desarrollo cerebral aberrantes es de gran interés.

Hasta el momento, el mayor obstáculo de la utilización de IUE para la investigación de las consecuencias de intervención en aquellos animales que a los adultos es la falta de éxito de la vigilancia de la electroporación. Hasta ahora, GFP-co-transfectadas neuronas fluorescentes en las crías de rata recién nacidos vivos no se pudo detectar con un microscopio de fluorescencia binocular adecuado o con la formación de imágenes de fluorescencia del espectro IVIS.

Para superar este obstáculo, que co-transfectadas un gen indicador de luciferasa y se realizó la bioluminiscencia de imágenes en vivo de las crías por 3 dimensiones (3D) la cuantificación de la zona del cerebro IUE.

Como un ejemplo para demostrar la aplicabilidad de este método en un ensayo funcional más adelante prueba de la manipulación genética del desarrollo neurológico, un co-inyección de plásmidos que contienen DISC1 humana, luciferasa, y GFP en el ventrículo lateral de embriones de rata en vivo, una señal de bioluminiscencia sólido derivado del metabolismo luciferina por el gen de la luciferasa co-transfectadas se detectó hasta cinco semanas después del nacimiento. 3D-mediciones de la cuantificación permitido área cerebral a electroporación mediante el cual se identificaron los cachorros con electroporación insuficiente o equivocada desde el principio, por lo tanto, lo que permite la asignación de los animales IUE (gen de interés y revueltos control) a los grupos experimentales con áreas cerebrales electroporadas emparejados de baja variabilidad . El uso de ratas adultas IUE en paradigmas de comportamiento se demostró como un ejemplo de la utilidad de este protocolo.

Protocol

Todos los experimentos con animales fueron autorizados por el responsable Landesministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW, 87-51.05.2010.A301), de conformidad con la legislación nacional y europea.

1. En el útero de electroporación

Este método ha sido descrito en detalle en JoVe para la rata por Walantus et al. 3, así como Rice et al. 4 y se resumen aquí sólo brevemente. Un tamaño de la camada de 6-8 cachorros se obtiene un buen resultado. Debe haber por lo menos dos embriones no electroporadas con el fin de aumentar la tasa de supervivencia global (ver más abajo).

  1. Preparar ADN-Mezcla que contiene 1,5 g / l de meta-plásmido (shRNA: pENTR-U6; Invitrogen, Eugene, Oregón / DISC1 sobreexpresión: pCAX 21), 0,5 g / l de luciferasa que contiene el plásmido (pCAX), 0,5 g / l de GFP que contiene el plásmido (pCAGGS 22) en 1x PBS solución teñida azul ligeroe con Fast Green Dye.
  2. Preparar agujas de inyección de capilares de vidrio con una aguja de pipeta Extractor. Y esterilizar instrumentos quirúrgicos, ya sea en autoclave o por incubación con un desinfectante a base de alcohol (Kodan Tinktur forte).
  3. Administrar una dosis pre-operatorio de la buprenorfina (0,05 mg / kg) 15 min antes de la cirugía a una rata preñada 16 días después de la fertilización (E16). Entonces anestesiar al animal en una cámara de isoflurano.
    1. Tras la anestesia, colocar la rata en una posición supina en una mesa de operación de calentado-C 37 ° con la máscara de respiración conectado al dispositivo de anestesia, mediante configuración de oxígeno a 0,4 L / min y isoflurano en 1,8%.
    2. Después de afeitarse el abdomen, desinfectar la zona afeitada tres veces con Kodan Tinktur Forte (un desinfectante a base de alcohol).
    3. Cubra la rata con paños estériles, exponiendo sólo el campo de operación afeitado.
  4. Realizar en el útero de la electroporación.
    1. Cortar el abdomen con un scissor lo largo de la línea alba (~ 2 cm).
    2. Exponer los cuernos uterinos con cuidado con unas pinzas de anillo.
    3. Tenga cuidado de mantener la pared del útero húmedo con PBS estéril calentado durante toda la cirugía.
    4. Inyectar la solución de ADN con una aguja de vidrio fina en uno del ventrículo lateral de los embriones.
    5. Coloque el electrodo 7 mm alrededor de la cabeza del embrión. Para golpear una población de células de las capas corticales superiores, realice el IUE en E16 23 y coloque el electrodo positivo en el hemisferio por encima del ventrículo inyectado con una ligera tendencia dorsal / lateral. Para dirigirse a las células del hipocampo cambian la colocación de los electrodos positivo hacia el lado opuesto de la ventrículo inyectado con lateral a ligeramente dirección dorsal (Figura 1).
    6. Lleve a cabo la electroporación por cinco pulsos 50 ms a 55 V con 950 saltos ms con una onda cuadrada electroporador pulso.
    7. Piezas de la primera embrión en el extremo vaginal de cada cuerno uterino con el fin de aumentar la Tque las posibilidades de supervivencia de todos los embriones.
    8. Ponga los cuernos del útero de nuevo en la rata madre.
    9. Stich de la pared abdominal con un material de sutura quirúrgica absorbible Vicryl.
    10. Cierre la piel con el material de sutura Vicryl o con clips de sutura.
    11. Coloque la rata madre de nuevo en la jaula y mantenerlo caliente durante 2-3 horas.
    12. Mantenga las ratas solo en su jaula en la sala de instalaciones de animales y se alimentan ad libitum. Dan a luz entre E22-24.
    13. Mantenga las crías de rata con su madre durante tres semanas y luego separarlos por sexo.

2. La bioluminiscencia de imágenes en vivo de la reacción enzimática de luciferasa

Este método se utiliza para analizar la posición de las células transfectadas en el útero. Electroporación-Co ADNc de luciferasa de luciérnaga se traduce en luciferasa activa, que, después de la metabolización de D-luciferina a oxiluciferina, emite un fotón (Figura 2 (Figura 4).

En el presente estudio, se realizó el ensayo de luciferasa de imágenes y bioluminiscencia comenzando en P7. Este punto de tiempo fue elegido para permitir la madre y los cachorros para recuperarse del estrés del nacimiento. Cuando se trabaja inicialmente con los cachorros en P0, supervivencia de las crías se vio gravemente afectada en que los cachorros fueron encontrados muertos o ingeridos por la madre.

Inicialmente, las crías de rata con electroporación con éxito son identificados por una imagen 2D-bioluminiscencia con un tiempo de exposición de tres minutos. Posteriormente, cachorros positivos se utilizan para crear imágenes en 3D con el fin de especificar la ubicación de la zona a electroporación.

  1. Diluir la sal de sodio-D luciferina en PBS a una concentración de 15 mg / ml y esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa estéril.
  2. Sopesar los cachorros.
  3. Tome el cachorro en una mano con el abdomen en la parte superior y estirar el abdomen ligeramente. Inyectar 10 l / g de peso corporal de luciferina intraperitoneal solución. Para los más viejos y más ágiles, pre-anestesiar a los cachorros con isoflurano en la cámara de inducción antes de la inyección de la luciferina.
  4. Encienda la afluencia isoflurano del Sistema Gasista Anestesia XGI-8 dentro del espectro IVIS con 3% de isoflurano.
  5. Ponga el hocico del animal en los conos de ojiva de cristal del Sistema de Anestesia.
  6. Mantenga el animal en una posición boca abajo hasta que esté en anestesia profunda (2-3 min). Entonces reducir la afluencia isoflurano al 1,5%.
  7. Elija una medición 2D-bioluminiscencia para seleccionar cachorros positivos de toda la camada. Utilice la siguiente configuración
    Pantalla 1
    Haga clic aquí para ver más grande la figura .
    1. Establezca un CHECkmark en la fotografía con binning medio y F / Stop a las 8, la cámara toma una foto desde arriba después de comenzar la medición.
    2. Establece filtro de excitación: bloque.
    3. Establece filtro de emisiones: abierto.
    4. Establecer Binning a medio.
    5. Set F / Stop en 1.
    6. Ajuste el nivel de la etapa A.
    7. Establecer luminiscencia tiempo de exposición a 180 seg.
  8. Para la creación de imágenes en 3D con el fin de cuantificar mejor el área a electroporación de los cachorros positivos, utilice la siguiente configuración DLIT de luciferasa de luciérnaga.
    Pantalla 3
    Haga clic aquí para ver más grande la figura .
    1. Establecer una marca de verificación en la fotografía, la cámara toma una foto desde arriba después de comenzar la medición.
    2. Establecer una marca de verificación en la estructura, la superficie del animal se escanea por el IVIS antes de la medición de bioluminiscencia.
    3. USE siguientes filtros de emisión y los ajustes de tiempo de exposición hasta la edad de dos semanas;
      Filtro de Emisiones 1: 590 nm, tiempo de exposición de 300 segundos
      Filtro de Emisiones 2: 600 nm, tiempo de exposición 240 sec
      Filtro de emisión 3: 620 nm, tiempo de exposición de 180 segundos
      Filtro de emisión 4: 640 nm, tiempo de exposición de 120 segundos
      Para las ratas mayores de P20
      Filtro de Emisiones 1: 600 nm, tiempo de exposición de 300 segundos
      Filtro de Emisiones 2: 620 nm, tiempo de exposición de 300 segundos
      Filtro de emisión 3: 640 nm, tiempo de exposición de 300 segundos
      Pantalla 3
      Haga clic aquí para ver más grande la figura .
      Debido a la disminución de la intensidad de la señal en los animales más viejos, el tiempo de exposición se amplía para los tres mejores filtros de emisión.
    4. Ajuste el nivel de la Etapa B
    5. Establecer Binning a medio.
    6. Set F / Stop en 1
  9. Después de la medición, mar k las ratas por un código earhole para diferenciarlos unos de otros y hacerlo coincidir con las imágenes en vivo de imágenes IVIS
  10. Al final del procedimiento de medición, apague afluencia isoflurano y mantener la rata en la placa calentada durante algunos minutos antes de volver a su jaula.

3. Análisis de la bioluminiscencia Imágenes

La generación de imágenes en 3D, películas en 3D y la cuantificación del volumen de la fuente de la señal se realiza mediante el software Living Image preinstalado en el espectro IVIS.

  1. Generación de imágenes en 3D
    1. En primer lugar, la reconstrucción de una topografía de la superficie, por lo tanto, establecer el umbral entre el 20-30%.
      Pantalla 4
      Haga clic aquí para ver más grande la figura .
      Pantalla 5
      een 6 "src =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/>
    2. Comience reconstrucción DLIT 3D con un umbral de imagen del 10% para cada longitud de onda.
      Pantalla 7
      Haga clic aquí para ver más grande la figura .
      Pantalla 8
      Haga clic aquí para ver más grande la figura .
      Pantalla 9
      Haga clic aquí para ver más grande la figura .
    3. Cree películas en 3D utilizando el botón animar dentro de la barra de herramientas 3D.
    4. Elige diferentes orientaciones de la imagen 3D, así como vistas de zoom como fotogramas clave y pulse el 'Record & #39, el botón, la grabación de la transición de una posición / orientación a otra.
      Pantalla 10
      Haga clic aquí para ver más grande la figura .

4. Las pruebas de comportamiento

Las pruebas de comportamiento se realizó con el fin de determinar si la manipulación de genes mediados por IUE en ratas podrían iniciar efectos a largo plazo que persisten en la edad adulta. En el presente caso, el efecto de los transitorios, unilateral de larga duración DISC1 humana cortical sobreexpresión después IUE fue investigado por probar la locomoción en un campo abierto (OF), con y sin una dosis baja de la anfetamina, como una prueba específica para la dopamina relacionada comportamiento 24. En un procedimiento similar realizado por Niwa et al. En ratones IUE utilizando caída DISC1, los ratones IUE pero no los controles mostraron hipersensibilidada la anfetamina 18.

Las ratas que fueron en el útero a electroporación con un vector que sobreexpresa DISC1 se llevaron a cabo en condiciones de laboratorio con 12 h de luz 07 a.m.-7 p.m. y se alimentaron ad libitum. A los 3 meses de edad, las ratas se sometieron a pruebas de comportamiento.

Para la cuantificación de la locomoción como una lectura de los efectos de la anfetamina, un campo abierto de un sistema de actividad Tru Scan situado en una cámara de sonido y de luz aislados se utilizó. Este sistema mide el tiempo de duración y distancia el animal se mueve, el tiempo y la distancia que pasó en el margen o en el centro del campo, así como la cría de comportamiento 25.

  1. En el primer día, pruebe después de la inyección de solución salina
    1. Pesar los animales.
    2. Inyectar por vía intraperitoneal 1 l / g de peso corporal de una solución salina (PBS 1x).
    3. Inmediatamente después de la inyección, el sacrificio del animal en el campo abierto y comenzar la medición del sistema TruScan. Registro durante 15 minutos unad subdividir los datos en 3 x 5 partes min.
    4. Ponga el animal de nuevo en su jaula.
  2. Segundo día, prueba en la inyección de anfetamina
    1. Pesar los animales.
    2. Inyectar por vía intraperitoneal 1 l / g de peso corporal de una solución de anfetamina 0,5 mg / ml.
    3. Inmediatamente después de la inyección de sacrificio del animal en el campo abierto y comenzar la medición del sistema TruScan. Registro durante 15 min y subdividir los datos en 3 x 5 partes min.
    4. Volver al animal a su jaula.
  3. Analizar la locomoción y el comportamiento de crianza generado por un software específico Tru Scan. Crear gráficos con GraphPad (Prism) y calcular las estadísticas por el software de SPSS Statistics.

Representative Results

La Figura 3 muestra viven mediciones de imágenes de tres crías de rata en P7 después de la inyección de 150 mg luciferina / kg de peso corporal. Las diferencias de intensidad de la señal que indica la variabilidad en la eficiencia de la IUE son visibles. Señales de bioluminiscencia Se registraron fuertes hasta P36 (Figura 4). En la Figura 5, la capacidad de definir cortical (Figuras 5A y 5C) y del hipocampo (Figuras 5B y 5D) por electroporación imágenes de bioluminiscencia se representan. Correlación de la señal de bioluminiscencia (Figura 7A) con su señal de fluorescencia después de la eliminación del cráneo (Figura 7B) y las células GFP-electroporación correspondientes en el cerebro cryosectioned (Figura 8) en P14 se representan en las Figuras 6-8. De nota, no había detección de una señal de fluorescencia en ratas vivas en cualquier punto de tiempo.

tienda de campaña "> En vivo de imágenes de bioluminiscencia permite la discriminación aproximado de diferentes áreas del cerebro a electroporación por 2D (figuras 5A y 5B) que se mejora en gran medida con el programa DLIT del software de IVIS Espectro de generación de imágenes en 3D (Figuras 5C y 5D). En los ejemplos mostrados , la electroporación de la corteza prefrontal y el hipocampo podía distinguirse. Cabe señalar que mientras que el objetivo para electroporar el hipocampo, algunas células progenitoras de la corteza acostado dorsal del hipocampo pueden también ser golpeado (Figura 7).

Las ratas de manera unilateral en el útero a electroporación con pCAX vector en el córtex y posteriormente sobreexpresan longitud DISC1 humano pleno fueron investigados por tanto espontánea como la hiperactividad inducida por anfetamina como adultos. Las ratas sometidas a electroporación con pCAX-DISC1 eran hipersensibles a una baja dosis de anfetamina. Estas ratas se movieron significativamente more después de tratamiento con anfetaminas que después de la inyección de solución salina, mientras que los animales de control no lo hizo (Figura 10).

Figura 1
Figura 1. Esquema de la posición del electrodo para A) electroporación y B corteza) electroporación hipocampo; verde = inyecta ADN-Mix en el ventrículo.

Figura 2
Figura 2. Reacción de la luciferasa.

Figura 3
Figura 3. Medición de luminiscencia de ratas P7 después de la inyección de 150 mg / kg de peso corporal luciferina; tiempo de exposición 180 seg; Una) de rata sin señal de luminiscencia; B) de rata con una señal de bioluminiscencia débil, C) de la rata con una señal de luminiscencia fuerte.

Figura 4
Figura 4. Línea de tiempo de las mediciones de bioluminiscencia consecutivos de la misma rata después de la inyección de 150 mg / kg luciferina demostrando una ventana de tiempo grande donde el éxito IUE puede ser detectado.

La figura 5
. Figura 5 Ilustración de las diferencias entre la electroporación cortical y del hipocampo en P7 A) y B) imágenes 2D;. C) y D), ver fotos en 3D, A) y C) de la corteza; B) y D) del hipocampo.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg "> Haga clic aquí para ver más grande la figura.

La figura 6
Figura 6. Ilustración de E16 electroporación del hipocampo de una cría de rata en P14 A) 2D-imagen de bioluminiscencia B) Ilustración 3D de la señal de bioluminiscencia C) diseccionó cerebro con bioluminiscencia señal D) del cerebro con GFP señal de epi-fluorescencia. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 7
Figura 7. Detalle de una imagen de fluorescencia de una sección crio 20 m de la misma P14 cerebro de rata a electroporación con GFP y luciferasa que contiene el plásmidovector, tinción de núcleos con DAPI; CA1-3 = Cornu Ammonis 1-3; DG = giro dentado, FC = Fasciolarum cinereum.

Video 1. Animación 3D de un hipocampo de rata a electroporación en P14.

Figura 8
Figura 8. Esquema de prueba de anfetaminas: la inyección de solución salina primer día antes de la prueba de 15 minutos, 24 horas más tarde la inyección de anfetaminas antes de la prueba en la cámara de campo abierto.

Figura 9
La Figura 9. Prueba de anfetaminas. Gráfico de barras que muestra la distancia recorrida (en cm) del animal registrado por un sistema TrueScan más de 15 min barras blancas = grupo de control;. Barras grises = grupo sobreexpresan DISC1; grupo control n = 10; DISC1 grupo sobreexpresión n = 11; ANOVA: * geno tratamiento p = 0,043; prueba t para el tiempo total de solución salina vs ns = anfetaminas no Pcontrol significativo = 0,172, pDISC1 = 0,001.

Discussion

Nuestro estudio demuestra que la IUE es adecuado para generar ratas adultas con neuronas que expresan un transgén en un área selectiva del cerebro y que, como resultado de esta intervención, estos animales presentan cambios en el comportamiento que indica la funcionalidad de la manipulación realizado. En este estudio, como un ejemplo, las ratas que sobreexpresan DISC1 unilateralmente en una pequeña parte de la corteza prefrontal mostraron hipersensibilidad hacia la anfetamina (Figura 9).

Selección de las ratas para el éxito de la electroporación in vivo por imágenes de bioluminiscencia fue eficaz en el control de la variabilidad inherente de la transfección de células IUE y se aplicó para generar grupos con una superficie IUE homogénea de baja variabilidad interindividual para investigaciones posteriores.

En este estudio, hemos podido seleccionar cachorros de la camada a electroporación mediante la detección de la fluorescencia inducida por GFP-co-electroporated en el animal recién nacido, incluso aunqueuf al mismo tiempo y en el mismo animal una señal de bioluminiscencia de la luciferasa igualmente co-electroporación podría ser detectado después de la inyección luciferina (Figura 6), y la neuronas que expresan GFP estaban aún presentes en el cerebro a una edad de seis meses. Llegamos a la conclusión de que, en la rata, la reacción luciferasa / luciferina es muy adecuado para diferenciar los animales con cerebros electroporadas exitosas (Figura 3).

El control cuantitativo de éxito IUE se refiere a la fuerza de la señal de bioluminiscencia que se mide por los recuentos de fotones dentro del mismo tiempo de exposición (Figura 3) y corresponde a la actividad enzimática de luciferasa co-expresado. Las señales pequeñas bioluminiscencia son detectables por 100-200 cargos de fotones, y, en un resplandor de ~ 1x10 4 fotones / s / cm 2 / mostrar estereorradián 1.000-2.000 células GFP-manchado en la histología en 6 meses de edad el cerebro de rata. La más alta disp señallayed una radiación de hasta ~ 5x10 6 fotones / s / cm 2 / estereorradián y ~ 64.000 cuentas.

En la cepa de rata Sprague Dawley utilizado, se observó un debilitamiento de la señal de bioluminiscencia longitudinalmente con aumento de la edad y la señal desapareció más allá de la edad de P35 (Figura 4). En este punto, no sabemos si alguno de lo transitorio, de expresión basado en vectores plásmido de luciferasa disminuye, o si la señal de bioluminiscencia se debilita debido al aumento de la masa cerebral, o ambos, son las causas de la desaparición de la señal. Para el ensayo funcional presente en las ratas adultas, la selección para los estudios de comportamiento se limitó a hacer sobre la base de la ubicación de la señal, pero no por la fuerza de la señal de bioluminiscencia.

A pesar de que la supervisión de bioluminiscencia cuantitativa 3D permite la diferenciación entre las diferentes zonas a electroporación (Figura 5), su exactitud se limitó para las células situadas en la moneda de diez centavos profundidadnsion del cerebro. Figura 6 muestra un ejemplo de una electroporación del hipocampo, donde la medición de bioluminiscencia en la 2D y la imagen 3D indicó un buen posicionamiento de la electroporación. En el cerebro post mortem diseccionado, se detectó una señal de GFP fluorescencia o menos a la misma posición que la señal de la bioluminiscencia, lo que indica la orientación correcta del hipocampo. Pero muestra la histología de que también las células en la corteza dorsal del hipocampo habían sido blanco (Figura 7). Esto indica que el ensayo de bioluminiscencia es una herramienta útil para detectar, cachorros IUE positivos y también para tener una idea de la zona a electroporación, pero, en última instancia, la imagen no puede sustituir a la histología post mortem para localizar exactamente las células positivamente orientadas.

Nuestra demostración indica promesa para la aplicación de la tecnología de IUE para generar sutiles manipulaciones específicas de regiones cerebrales corticales o del hipocampo para simular aberrances en Cmigración ortical u otros defectos del neurodesarrollo que pueden influir en el animal adulto. Si bien la electroporación bilateral 26 tiene la ventaja de un efecto probablemente más grande en el comportamiento, también hay más de mortalidad de los embriones. Electroporación unilateral fue elegido con el fin de comparar los dos hemisferios con uno como un control interno, así como para mostrar que incluso manipulación IUE en una pequeña región unilateral, es suficiente para cambiar el comportamiento. Los cambios inducidos por el IUE en la conectividad o la arquitectura entre las neuronas pueden así ser inducida sin provocar una lesión y el partido requiere de la región a-ser-IUE manipulada con la prueba de comportamiento apropiado depende de la pregunta científica.

Solución de problemas

Reducción del tamaño de la camada Hay varias sugerencias con respecto a aumentar la supervivencia de las crías de IUE. En primer lugar, el uso de capilares de vidrio muy finas durante la electroporación con el fin de minimizar el tejido LesioSe recomienda n. En segundo lugar, no electroporar el primer embrión al final vaginal de cada cuerno uterino: la muerte de los primogénitos de embriones aumenta las posibilidades de una interrupción de todos los otros embriones. En tercer lugar, después del nacimiento, las ratas madre a menudo matan a parte de su progenie debido al estrés perinatal. Con el fin de reducir el estrés adicional, no comenzar con la formación de imágenes en directo justo después del nacimiento, pero esperar durante siete días.

Detección de buenas prácticas agrarias en la fluorescencia de los cachorros

A la semana después de su nacimiento, no hay señal de fluorescencia, ya sea usando la fluorescencia binocular en directo imágenes microscópicas o imágenes de fluorescencia con el IVIS Spectrum (modos de epifluorescencia y transfluorescence; para la excitación GFP / Emisión: 465/520 nm y 500/540 nm). Es posible que ambos, la transmisión limitada de onda de excitación y emisión de luz corta a través del tejido, como el cráneo y el alto fondo de autofluorescencia de la piel a prevenir el uso de la fluorescencia bajo la described condiciones en la rata. Como se muestra en la Figura 6, la señal de luciferasa en el animal vivo también se puede detectar en el cerebro diseccionado (sin cráneo) y allí, también una señal de fluorescencia es detectable (Figura 6D).

Diferenciación de la bioluminiscencia en áreas del cerebro estrechamente espaciados

Incluso en la ilustración 3D la ubicación de la zona de la bioluminiscencia no se puede predecir a 100%. Especialmente las células en la parte superior o debajo de la superficie prevista también pueden utilizarse y se transfectaron de forma accidental. La posición exacta tiene que ser controlado por post mortem (fluorescencia) la histología (véase la Figura 7).

Disclosures

Los autores de este estudio no tienen interés financiero en este estudio y no han sido patrocinados por la industria para este estudio. Las tarifas de acceso abierto fueron aportados por correo publicación PerkinElmer Inc..

Acknowledgments

Los autores agradecen a Tracy Young-Pearse y Atsushi Kamiya para proporcionar plásmidos.

Este trabajo fue financiado por NEURON-ERANET DISCover a O y CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) para CK, y (DE 792/2-4) para MASS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent name
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Invitrogen 14190-250 without calcium, without magnesium
D-luciferin, sodium salt SynChem OHG, Germany BC218 CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase
Fast Green FCF Sigma Aldrich, USA F7258-25G CAS: 2353-45-9
D-Amphetamine Sigma Aldrich, USA A 5880 CAS: 51-63-8
kodan Tinktur forte Schülke Mayr GmbH, Germany 104 005
Material / product
Glass capillaries Sutter Instrument Novato, California, USA borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Tujunga, California, USA
Tweezer electrode Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7)
Surgical Scissors - sharp Fine Science Tools Heidelberg, Germany Straight, 12 cm (14002-12)
Ring Forceps Fine Science Tools Heidelberg, Germany 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan (CUY21SC)
Vicryl surgical suture material Ethicon Norderstedt, Germany 3-0; 2 Ph. Eur;
Wound Clip Applicator Fine Science Tools Heidelberg, Germany Reflex 9 mm (12032-09)
Syringe filter VWR Darmstadt, Germany 0.45 μm cellulose acetate
IVIS Spectrum Caliper Life Science / PerkinElmer Waltham, MassachusettsUSA
XGI-8 Gas Anesthesia System PerkinElmer Waltham, Massachuset tsUSA
Open-field Coulbourn Instruments Allentown, USA (40 x 40 x 39 cm)
Tru Scan activity system Coulbourn Instruments Allentown, USA
Table of recipes
Number Buffer name Content Comments
1 DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing 1.5 μg/μl pCAX humanDISC-1,
0.5 μg/μl pCAX-luciferase,
10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O
100 μl of the mixture are enough for ~5 IUE
2 DNA-Mixure for control 0,75 μg/μl control shRNA1, 0,75 μg/μl control shRNA2, 0.5 μg/μl pCAX-luciferase, 0.5 μg/μl pCAGGS-GFP 10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O 100 μl of the mixure are enough for ~5 IUE
3 Fast green Dye 10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O
4 D-luciferin solution 15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS
5 Amphetamine solution 0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
  2. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  3. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  4. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  5. Takahashi, M. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155 (2002).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  7. Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).
  8. Young-Pearse, T. L., et al. A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).
  9. Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
  10. Sapir, T., et al. Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).
  11. Weinberger, D. R. From neuropathology to neurodevelopment. Lancet. 346, 552-557 (1995).
  12. Murray, R. M., Lewis, S. W. Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder? British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).
  13. Kamiya, A., et al. A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development. Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).
  14. Miyoshi, K., et al. Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth. Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).
  15. Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136, 1017-1031 (2009).
  16. Millar, J. K., et al. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).
  17. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).
  18. Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
  19. Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors. The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. 169-179 (2012).
  20. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).
  21. Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
  22. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Development, Growth & Differentiation. 41, 335-344 (1999).
  23. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).
  24. Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia. Progress in Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).
  25. Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats. Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).
  26. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
Generación de ratas transgénicas por vía tópica<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación y<em&gt; En vivo</em&gt; Detección bioluminiscencia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).More

Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter