Summary
هنا نحن تصف طريقة فعالة لدراسة ديناميات إزالة الخلايا الميتة
Abstract
القضاء السليم للخلايا غير المرغوب فيها أو الشاذة من خلال موت الخلايا المبرمج والبلعمة لاحقة (إزالة الخلايا الميتة) أمر بالغ الأهمية من أجل التنمية طبيعي في جميع الكائنات الحية metazoan. إزالة الخلايا أفكارك هي عملية ديناميكية للغاية يرتبط ارتباطا وثيقا مع موت الخلايا؛ تعتبر الخلايا أفكارك unengulfed بالكاد في الجسم الحي في ظل ظروف طبيعية. من أجل فهم الخطوات المختلفة لإزالة الخلايا الميتة ومقارنة البالعات 'المهنية' - الضامة، والخلايا الجذعية إلى 'غير مهنية' - خلايا الأنسجة المجاورة المقيمين، في الجسم الحي التصوير المباشر لعملية قيمة للغاية. نحن هنا وصف بروتوكول لدراسة التخليص الخلية أفكارك في العيش أجنة ذبابة الفاكهة. لمتابعة ديناميات الخطوات المختلفة في البلعمة نستخدم علامات محددة للخلايا أفكارك والبالعات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا رصد نظامين بلعمية في نفس الوقت: الضامة 'المهنية' و 'نصف profeالدبقية ssional 'في الجهاز العصبي المركزي النامية (CNS). الطريقة الموضحة هنا توظف الجنين ذبابة الفاكهة نموذجا ممتازا للدراسات في الوقت الحقيقي من إزالة الخلايا الميتة.
Introduction
القضاء السليم للخلايا غير المرغوب فيها أو الشاذة من خلال موت الخلايا المبرمج والبلعمة اللاحقة أمر بالغ الأهمية لنمو الجنين وكذلك للتوازن الأنسجة في الكبار. البلعمة من الخلايا أفكارك أو إزالة الخلايا أفكارك هي عملية ديناميكية للغاية التي تسير في أربع خطوات: (1) تعيين البالعات إلى الخلية أفكارك ('العثور-ME')، (2) الاعتراف الخلية كهدف للالبلعمة ( 'أكل لي') و (3) الغمر، تليها (4) نضوج يبلوع وتدهور جسيم أفكارك 1-5. هناك نوعان من البالعات: الضامة 'المهنية' والخلايا الجذعية غير الناضجة، و 'غير مهنية' الخلايا المجاورة الأنسجة المقيمين، والتي هي حاسمة لإزالة الخلايا أفكارك أثناء تطوير metazoan 6،7.
ذبابة الفاكهة في التنمية، والقضاء على خلايا زائدة عن الحاجة من خلال موت الخلايا المبرمج يحدث في ثلاثة ممراحل عين، لأول مرة في منتصف إلى أواخر الجنين، ثم في منتصف خادرة، ومرة أخرى في الكبار في وقت مبكر. خلال مرحلة التطور الجنيني تتم إزالة الجسيمات أفكارك بواسطة البالعات 'المهنية'، الضامة، والأديم الظاهر و'غير مهنية' والدبقية 8،9.
في أعمالنا السابقة حددنا مستقبلات البلعمية، لمدة ستة ميكرون تحت (SIMU)، وهو ما يعبر عنه حصرا في الخلايا البلعمية خلال مرحلة التطور الجنيني. باستخدام المروج تليفون ولدت لدينا علامة محددة للسكان الخلية البلعمية (سيمو-cytGFP) والتي تمكننا من رصد الضامة، الأديم الظاهر والدبقية في وقت واحد في وضع الجنين ايف 8. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام علامات محددة للخلايا أفكارك في مراحل مختلفة من موت الخلايا المبرمج، ونحن قادرون على تتبع تحركات لإزالة الخلايا الميتة في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
لمتابعة ديناميات إزالة الخلايا الميتة في الجسم الحي يجب أن يكون المسمى اثنين من السكان من الخلايا: الخلايا البلعمية والخلايا أفكارك.
بمناسبة السكان الخلية البلعمية نستخدم خط ذبابة الفاكهة التي تحتوي على علامة تليفون-cytGFP، التي تصف الخلايا البلعمية حصرا في الجنين: الضامة، والخلايا الدبقية الأديم الظاهر 8. يمكن للمرء استخدام علامات مختلفة للخلايا البلعمية، بما في ذلك خطوط تحتوي على السائق GAL4 كرية دموية محددة (CRQ-GAL4) أو الدبقية محددة GAL4 السائق (الريبو-GAL4) ومراسل الفلورسنت المشفرة جينيا تحت السيطرة UAS (UAS GFP-).
لرصد الخلايا أفكارك خلال إزالة الخلايا الميتة التي نستخدمها موت الخلايا المبرمج مختلفة / علامات البلعمة. Annexin V (المسابر الجزيئية) بمثابة مؤشر مبكر لخلايا أفكارك 10؛ Phiphilux (OncoImmunin) هي الفلورة كاسباس 3 الركيزة، التي يستخدم كأساس apopto في وقت لاحقجهاز الأمن والمخابرات علامة، وLysoTracker (المسابر الجزيئية) يعمل كعلامة يبلوع. نحن حقن هذه الكواشف باستخدام نظام حقن مكروي PicoPump PV 820.
1. يستعد
- الغراء هيبتان:
انبسط الشريط مزدوجة من جانب ووضع بقدر ما يمكنك في قارورة التلألؤ، وملء مع هيبتان، ختم قارورة مع parafilm، والصخور لمدة 24 ساعة. إضافة هيبتان إذا الغراء سميكا جدا. - نسمح الذباب لتضع على عصير العنب قبل تحسنت وحة آغار + الخميرة لصق لمدة 2 ساعة، ثم نقل لوحة إلى 25 درجة مئوية لمدة 10-12 ساعة (يعتمد على المرحلة المطلوبة) قبل حقن مكروي والوقت الفاصل بين التسجيلات من الأجنة حقن. نحن جمع أجنة من لوحات أجار الحفاظ على 25 درجة مئوية، وبالتالي توفير الأجنة من مرحلة 15 أو 16 من التنمية.
- إعداد إبرة:
لإعداد إبر للحقن، ونحن نستخدم "أداة سوتر 'ساحبة إبر وخيوط زجاجية رقيقة الجدران (أنابيب شعرية FHC). واندلعت غيض من تجميع الشعريةN ليبلغ قطرها 0.5-2 ميكرون. - ساترة مع الغراء:
تلميح باستخدام ماصة تفريق قطرة من الغراء هيبتان في سطر واحد في منتصف ساترة. اتركها لتجف لبضع ثوان. إعداد عدد قليل من هذه coverslips على.
2. تحضير الجنين
- جمع الأجنة من لوحات أجار ونقلها إلى مصفاة الخلية (علوم الحياة SPL) باستخدام فرشاة الطلاء نظيفة ومياه جارية. ويقام على مصفاة كوب لجمع مياه الصرف الصحي.
- غسل الأجنة في مصفاة الخلية باستخدام المياه حتى يتم إزالة كافة عجينة الخميرة.
- تجف الماء الزائد عن طريق مسح السطح الخارجي للمصفاة باستخدام Kimwipes.
- وضع مصفاة الخلية في طبق بتري نظيفة وإضافة ما يكفي من مواد التبييض 50٪ لتغطية الأجنة في مصفاة الخلية. Dechorionate الأجنة لمدة 2 دقيقة في بعض الأحيان (2-3 مرات) التحريك لهم.
- شطف مع المياه على نطاق واسع حتى الأجنة فضفاض رائحة التبييض.
- وضع مصفاة الخلية في نظيفةطبق بتري وتغطية الأجنة مع الماء لمنع الجفاف.
- قبل البدء في إعداد الأجنة، تحميل 1 ميكرولتر من كاشف المطلوب في اثنين من الإبر (أحيانا إبرة يمكن انسداد). يستغرق حوالي 5 دقائق للسائل للوصول إلى رأس الإبرة.
- قطع قطعة مستطيلة من العنب آغار عصير ووضعها على شريحة المجهر. نقل الأجنة dechorionated من طبق بيتري إلى قطعة أجار باستخدام فرشاة الطلاء نظيفة.
- تحت المجهر تشريح فلوري حدد بشكل صحيح نظموا الأجنة معربا عن علامة GFP باستخدام فرشاة الطلاء الرطب وتضع كل جنين على مقربة من حافة قطعة أجار في صف واحد تلو الآخر (الشكل 1A). ينبغي أن توضع الأجنة مع جانبهم بطني حتى لالبلعمة التصوير بواسطة الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي (CNS).
- إعداد حوالي 10 الأجنة في صف واحد.
- نعلق الأجنة إلى ساترة المغلفة في الوسط مع شريط من الغراء هيبتان (الشكل 1B، C
- وضع ساترة في غرفة الجفاف لمدة 5 دقائق (وهذا يعتمد على نسبة الرطوبة في الغرفة والمبلغ الذي يتم حقنه).
- بعد تجفيف تغطية الأجنة مع زيت الهالوكربون 700 (سيجما) لتجنب المزيد من الجفاف.
- وضع ساترة على شريحة المجهر مع الأجنة مواجهة. قد كنت وضعت قطرة من الماء على الشريحة لمنع الانتقال من ساترة. الأجنة هي الآن جاهزة للحقن. موقع الحقن هو عادة على الجانب الوحشي في منتصف الجنين.
3. حقن الجنين
- إرفاق الإبرة إلى مياداة مجهرية.
- لكسر غيض إبرة وضعت على حافة ساترة في مجال الرؤية وضبط الإبرة إلى الطائرة الاتصال نفسه. تحرك بحذر جدا ساترة حتى يضرب رأس الإبرة ويكسر ذلك.
- مع التركيز على الأجنة، ضع الإبرة في النفط وتأكد من الحصول على قطرة السائل من إبرة. ذلك يعني تم غيض إبرةكسر جيدا.
- دون لمس حامل إبرة نقل الجنين في إبر وحقن تسقط في جنين. نقل الجنين بعيدا والمضي قدما إلى المرحلة التالية حتى يتم حقن كل الأجنة.
4. التصوير
نحن صورة الأجنة على مجهر متحد البؤر المقلوب مع الهدف 40X أو 100X. ونحن نتطلع لوضع الجنين بشكل جيد مع الجهاز العصبي المركزي في الوسط، مما يدل على التعبير GFP قوي ووضع العلامات الجيدة من الخلايا أفكارك بعد الحقن.
للمرة تسجيلات انقضاء الأجنة الحية نختار عادة 5 أو 6 شرائح متحد البؤر (2 ميكرون سميكة لكل منهما). بعد ذلك، ونحن جعل الإسقاط من 3 شرائح (6 سماكة ميكرون) من أجل مراقبة الخلايا بأكملها.
نحن نستخدم علامات لخلايا أفكارك التي هي مستقرة ولا التبييض بسهولة. لتجنب التبييض نجعل التسجيلات في فترات من 60 ثانية GFP.
في بعض الحالات قد تبدأ الأجنة المتداولخلال ذلك الوقت من تسجيل الفيديو. ولذلك، فإننا نلقي نظرة مرة واحدة في حين لاخر على تسجيل من أجل وقف والبدء من جديد إذا لزم الأمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر إطارات ممثل عن فيلم التي وصفت الخلايا أفكارك مع Annexin V، ويطلق عليها الخلايا الدبقية، الأديم الظاهر والضامة مع تليفون-cytGFP في الشكل 2. كل الإطار هو إسقاط 3 شرائح 2 ميكرومتر لكل منهما.
يتم وضع الجنين من مرحلة 15 بشكل صحيح تبين CNS الجنينية في الوسط مع الدبقية المسمى كذلك (ز). الضامة (M)، التي هي في معظمها خارج الجهاز العصبي المركزي، وتبين قوية التعبير GFP حشوية. وصفت الخلايا الأدمة أيضا مع GFP حشوية (ه). وينظر العديد من الخلايا إيجابية Annexin V داخل وخارج الجهاز العصبي المركزي. لمتابعة الحدث بابتلاعها ليست سهلة. نحن أبرز حدث واحد مع مستطيل أبيض حيث خلية الدبقية تجتاح جسيم أفكارك. ملاحظة سلوك يحقق من الخلية الدبقية: لمس الجسيمات أفكارك عدة مرات دون تجتاح ومن ثم تنتهي مع الغمر لAnnexin V المسمى الخلية أفكارك (الشكل 2
يمكن أن تستخدم علامات إضافية للمراحل أفكارك مختلفة مع نفس الإجراء.
الشكل 1. التمثيل التخطيطي للإعداد الجنين للإبر دقيقة جدا. A. شريحة مجهرية تحتوي على قطعة من آغار التي يتم نقل الأجنة بعد dechorionation. يتم وضع حوالي 20 الأجنة في خط، على مقربة من حافة قطعة أجار، مع جانبهم بطني حتى، لتصوير الجهاز العصبي المركزي. B. A ساترة تحتوي على شريط من الغراء هيبتان في الوسط. C. وساترة من B مع الأجنة تعلق على قطاع الغراء هيبتان.
الشكل 2. التحليل الديناميكي لإزالة الخلايا الميتة. تسجيل الوقت الفاصلS من إزالة الخلايا أفكارك في مرحلة الجنين 15. الدبقية (ز)، الضامة (M) والأديم الظاهر (ه) وصفت مع تليفون-cytGFP (الخضراء). وتتميز الخلايا أفكارك مع Annexin V الفلورسنت (الحمراء). A. إطارات مختارة من فيلم ممثل ترد. ويصور خلية الدبقية التي تجتاح خلية أفكارك بواسطة مستطيل. B. قرب وجهات النظر من المستطيل ملحوظ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إزالة الخلايا أفكارك هي المرحلة الأخيرة الحاسمة من موت الخلايا المبرمج، وهو ديناميكية للغاية. لذا دراسات الوقت الحقيقي من عملية ذات أهمية قصوى. نحن هنا وصف البروتوكول الذي يتيح رصد إزالة الخلايا أفكارك في العيش النامية أجنة ذبابة الفاكهة. في هذا الإجراء، يجب أن تكون وضعت اثنين من السكان من الخلايا باستخدام علامات محددة: الخلايا أفكارك والبالعات. مراسل تليفون-cytGFP هو مناسبة لرصد الضامة البلعمة، الدبقية والأديم الظاهر في وقت واحد في نفس الجنين، hich ث يجعل من الممكن لمتابعة مختلف السكان الخلية البلعمية في نفس الوقت. هذا هو ميزة كبيرة لدراسة 'المهنية' و 'غير مهنية' تطهير في وقت واحد، ومقارنة جوانب محددة من عملية مثل معدل والنوعية والقدرة التدهور. ومن عيوب هذا النهج هو أن المحاكاة-cytGFP علامة بقوة أعرب غاية في الضامة وأضعف بكثير فيالدبقية، والتي يمكن أن تكون خادعة لضبط في نفس الفيلم. ومع ذلك، يمكن للمرء صورة التخليص أفكارك الخلية بواسطة الضامة بشكل منفصل عن هذه العملية في الجهاز العصبي المركزي، من قبل القيادة التعبير GFP مع Gal4s محددة (CRQ-GAL4 لالضامة والريبو-GAL4 لالدبقية).
علامات مختلفة للخلايا أفكارك تعكس التعديلات الجزيئية والمورفولوجية محددة هي ذات قيمة كبيرة لفهم ديناميات وعكس اتجاه موت الخلايا المبرمج وإزالة الخلايا. وعلاوة على ذلك، تسجيلات الوقت الحقيقي من إزالة الخلايا الميتة باستخدام هذه العلامات إضافة معلومات إضافية حول الظواهر متحولة، الذي لا يمكن أن يتحقق عن طريق استخدام التقنيات المناعية التقليدية في الأجنة ثابتة.
الخطوة الأكثر صعوبة من البروتوكول وصفها، عندما التصوير الجهاز العصبي المركزي النامية، هو تحديد المواقع بدقة للغاية من الأجنة قبل الحقن. حتى تحرك طفيف من ساترة خلال مرفق من المعدةيمكن أن الأجنة إلى الغراء تغيير موقفهم، والتي لن يكون مناسبا لتصوير الجهاز العصبي المركزي. وينبغي أن يتم الجنين إرفاق الخطوة مع اكبر قدر من الاهتمام.
سيكون من المرغوب فيه للغاية لتشريح أدق والتلاعب ممكن من إزالة الخلايا أفكارك تطوير علامات إضافية للمراحل محددة في موت الخلايا المبرمج والبلعمة. بروتوكول المعروضة هنا هي بمثابة أساس جيد للتنمية في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل كوري إعادة الإدماج منحة ماري (IRG249084). ونحن نشكر جميع أعضاء المختبر Kurant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A.
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
