Summary
在这里，我们描述了一个有效的方法，研究凋亡细胞间隙的动态
Abstract
适当的消除不必要的或异常细胞通过细胞凋亡和随后吞噬（凋亡细胞间隙）在所有后生生物的正常发育是至关重要的。凋亡细胞的清除是一个高度动态的过程密切相关的细胞死亡;勉强看到unengulfed凋亡细胞在体内正常情况下。为了了解凋亡细胞清除的不同步骤和比较“专业”的巨噬细胞-巨噬细胞和树突状细胞的'非专业' -组织居民相邻的细胞在体内的实时成像的过程，是极其宝贵的。在这里，我们描述了一个协议，在现场的果蝇胚胎研究凋亡细胞清除。要遵循不同的步骤，在我们使用特定的标记凋亡细胞和巨噬细胞的吞噬功能的动态。此外，我们可以监视两个巨噬细胞系统并行：“专业”的巨噬细胞和半专业图片ssional在发展中的中枢神经系统（CNS）的神经胶质细胞。这里介绍的方法采用了果蝇胚胎作为一个很好的模型实时研究凋亡细胞清除。
Introduction
适当的消除不需要的或异常的细胞通过细胞凋亡及随后的吞噬作用，胚胎发育，以及在成年组织的平衡是至关重要的。细胞吞噬凋亡细胞或凋亡细胞的清除是一个高度动态的过程，这四个步骤进行：（1） 招聘吞噬细胞的细胞凋亡（'发现'），（2） 承认的细胞吞噬的目标（ '吃'）和（3）的吞噬 ，随后由（4） 吞噬体的成熟和退化的细胞凋亡粒子1-5。吞噬细胞有两种类型：“专业的”巨噬细胞和未成熟树突状细胞，和“非专业组织驻地相邻的细胞，这是至关重要的凋亡细胞的清除过程中后生动物发展6,7。
在果蝇发育，消除多余的细胞通过细胞凋亡发生在3米的主要阶段，首先在中期到晚期胚胎，然后在蛹中旬，并再次在成年早期。胚胎发育过程中细胞凋亡的颗粒被去除由专业的吞噬细胞，巨噬细胞，由“非专业外胚层和神经胶质8,9。
在我们以前的工作中，我们已经确定了，六微米下吞噬受体（捷联惯组），这是吞噬细胞在胚胎发育过程中表达。我们使用模拟子产生吞噬细胞的人群（ 模拟cytGFP的 ）使我们能够监视巨噬细胞，外胚层和神经胶质细胞，同时在现场发育中的胚胎8的特异性指标。此外，通过使用在不同阶段的细胞凋亡中细胞凋亡的特异性标志物，我们能够遵循的凋亡细胞的清除在体内的动态。
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Protocol
要按照两群细胞凋亡细胞清除体内必须标明：吞噬细胞和细胞凋亡的动态。
为了纪念我们使用了含有果蝇线的的模拟cytGFP标记，专门吞噬细胞在胚胎标签：巨噬细胞，神经胶质细胞和外胚层8吞噬细胞群。人们可以使用不同的标记为吞噬细胞，其中含有一个血球特定的Gal4的驱动程序（CRQ-GAL4）的行或神经胶质细胞特异性Gal4的驱动（ 回购Gal4的 ）和下控制无人机（UAS-GFP）的基因编码的荧光记者。
监测细胞凋亡过程中凋亡细胞的清除，我们使用不同的/吞噬凋亡标记。膜联蛋白V（Molecular Probes公司）作为细胞凋亡的早期标志10，Phiphilux（OncoImmunin）是一种可发荧光的caspase-3底物，它是用来作为一个购买凋亡SIS标记，LysoTracker的吞噬体标记（分子探针）。我们注入这些试剂使用显微注射系统PicoPump PV 820。
1。准备工作
- 庚烷胶：
展开双面胶带，把尽可能多的，你可以在闪烁瓶中，填写用庚烷为24小时，用封口膜密封的小瓶和岩石。添加庚胶水太厚。 - 我们让苍蝇趴在一个预热的葡萄汁琼脂板+酵母膏2小时，然后转板至25°C的前10-12小时（取决于所需的阶段），以显微注射法和时间的推移录音注射胚胎。我们收集胚胎从琼脂板保持在25°C，从而提供了15或16的发展阶段的胚胎。
- 针准备：
要准备注射用的针，我们用“萨特仪”针拉马和薄壁玻璃纤维丝（FHC毛细管）。汇集毛细管的尖端爆发n到一个直径为0.5-2微米。 - 盖玻片用胶水：
使用移液管尖，在同一行中的中间的盖玻片的庚烷胶一滴分散。让它干几秒钟。这些盖玻片准备几个。
2。胚胎的制备
- 琼脂平板收集胚胎，并将它们传送到细胞过滤网（SPL生命科学），用干净的画笔和自来水。该过滤器是在一个烧杯中举行，收集废水。
- 被删除，直到所有的酵母膏的细胞过滤网使用水清洗胚胎。
- 干出多余的水擦拭的外侧中的过滤器使用的Kimwipes。
- 放置在一个干净的培养皿中的细胞过滤器，并补充足够的胚胎细胞过滤50％的漂白粉。 Dechorionate胚胎2分钟，偶尔搅拌（2-3倍）。
- 广泛用清水冲洗，直到胚胎松动的漂白剂气味。
- 细胞过滤器放置到一个干净的培养皿中并覆盖胚胎与水，以防止干燥。
- 在开始之前，胚胎设置，负载1微升所需的试剂分成两针（有时可堵塞针）。需要约5分钟，使液体到达针尖。
- 切一块长方形的葡萄汁琼脂，并把它放在显微镜玻片。 dechorionated胚胎转移从培养皿的琼脂片，用干净的油漆刷。
- 荧光解剖显微镜下，选择适当的上演胚胎表达GFP标记利用湿式油漆刷，放置在一排一个接连的（ 图1A）的琼脂片的边缘附近的每个胚胎。胚胎应放在其腹侧成像吞噬功能的神经胶质细胞在中枢神经系统（CNS）。
- 设置在一排约10个胚胎。
- 将胚胎中间用一条庚胶水（ 图1B，C涂在盖玻片
- 脱水腔盖玻片放置约5分钟（这取决于房间的湿度和被注入的量）。
- 干燥后胚胎卤烃油700（Sigma公司），以避免进一步的脱水。
- 将盖玻片朝上胚胎在显微镜载玻片。在幻灯片上，以防止在盖玻片移动，你可以把一滴水。现在准备注射胚胎。典型的注射位置是在中间的横向侧的胚胎。
3。胚胎注射
- 将一个显微针。
- 为了打破针尖把盖玻片的边缘的视场和针调整到相同的焦平面。非常小心地将盖玻片，直到它击中针尖打破。
- 针对胚胎，将针放入油，并确保你得到一个液滴从针。这意味着在针尖已经打破。
- 而不触及持针进针，将胚胎注入一滴到胚胎。将胚胎，并继续到下一个，直到所有的胚胎注入。
4。成像
我们的形象倒置共聚焦显微镜与40X或100X客观的胚胎。我们期待一个很好的定位在中间，表现出强烈的绿色荧光蛋白表达和良好的标记凋亡细胞注射后胚胎的中枢神经系统。
对于活胚胎录音时间的推移，我们通常会选择5或6焦片（2微米厚）。之后，我们进行投影的3片（6微米厚），以观察整个细胞。
我们使用标记的细胞凋亡，这是稳定的，不容易漂白。为了避免GFP漂白的时间间隔为60秒的录音。
在某些情况下，胚胎开始滚动这段时间的视频录制。因此，我们来看看曾经在一段时间在录音，如果需要停止和启动。
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Representative Results
从动画中的表示帧，其中细胞凋亡被标记的膜联蛋白V，和神经胶质细胞，外胚层和巨噬细胞标记的模拟cytGFP示于图2。每个帧是3片各2μm的投影。
正确定位显示在中间的胚胎中枢神经系统标记的神经胶质细胞（G）胚胎阶段15。巨噬细胞（M），其中大多是以外的中枢神经系统，表现出强劲的细胞质GFP表达。外胚层细胞也标记细胞质GFP（E）。许多Annexin V的阳性细胞内外的中枢神经系统。要遵循吞噬事件是不容易的。我们强调一个白色矩形的胶质细胞吞噬凋亡粒子的一个事件。请注意：感人的胶质细胞的凋亡粒子几次探测行为没有吞没它，然后结束了与Annexin V的吞噬细胞凋亡标记（ 图2
使用相同的过程，可用于不同的凋亡阶段的附加标记。
图1。显微注射胚胎准备示意图。答：显微玻片含有一块琼脂胚胎后dechorionation转移。约20胚胎线放置，琼脂片的边缘附近，与他们的腹侧，成像中枢神经系统。B.包含在中间的带状的正庚烷胶甲盖玻片。C.从乙盖玻片与胚胎连接到正庚烷的胶条。
图2。时间推移录像动态分析凋亡细胞的清除。s的凋亡细胞的清除，在胚胎阶段15。神经胶质细胞（克），巨噬细胞（M）和外胚层（E）都标有模拟cytGFP（绿色）。凋亡细胞标记与荧光膜联蛋白V（红色）A.选定的有代表性的电影帧被显示。胶质细胞吞噬凋亡细胞被描绘一个矩形。B.特写的显着矩形的意见。
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Discussion
凋亡细胞的间隙是一个关键的细胞凋亡，这是高度动态的最后阶段。因此，实时研究的过程中是非常重要的。在这里，我们描述了一个协议，使凋亡细胞清除在监视居住开发果蝇胚胎。在此过程中，必须使用特定标记的凋亡细胞和吞噬细胞的标记两个细胞群体。该模拟cytGFP记者是适合于监测吞噬细胞的巨噬细胞，神经胶质细胞和外胚层，同时在相同的胚胎， 瓦特 HICH使得它可以在同一时间按照不同的吞噬细胞种群。研究“专业”和“非专业”的间隙，同时率，特异性和降解能力的过程中，如比较具体的方面，这是一个很大的优势。这种方法的缺点， 模拟cytGFP的标记是极其强烈的表达在巨噬细胞和远弱神经胶质细胞，这可能是棘手的调整，在同一部电影。然而，我们可以图像凋亡细胞由巨噬细胞间隙从这个过程中分别在中枢神经系统中，驱动GFP表达的具体Gal4s（CRQ-Gal4的巨噬细胞和回购Gal4的神经胶质细胞）的。
凋亡细胞的不同标记来反映特定的分子和形态学改变是巨大的价值，为了解细胞凋亡和细胞间隙的动态性和可逆性。而且，凋亡细胞的清除，使用这些标记的实时录制添加突变体的表型，这是不可能实现在固定胚胎通过使用常规的免疫组化实验技术有关的其他信息。
最困难的步骤中所描述的协议，成像时，中枢神经系统发育，注射前的胚胎是极其精确的定位。即使是轻微的举动在盖玻片附着的准备胶水的胚胎可能会改变自己的立场，这将不适合成像的中枢神经系统。胚胎附着步骤应该做的最大的关注。
发展特定阶段的额外标记在细胞凋亡和细胞吞噬凋亡细胞的清除更精细的解剖和可能的操纵是非常可取的。这里介绍的协议作为未来的发展奠定了良好基础。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
支持这项工作是由居里夫人重返格兰特（IRG249084）。感谢所有成员的Kurant实验室。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
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