Summary
Her beskriver vi en effektiv metode til at studere dynamikken i apoptotisk celle clearance
Abstract
Den rette fjernelse af uønskede eller afvigende celler gennem apoptose og efterfølgende fagocytose (apoptotic celle clearance) er afgørende for en normal udvikling i alle metazoiske organismer. Apoptotisk celle clearance er en meget dynamisk proces intimt forbundet med celledød, unengulfed apoptotiske celler er næsten ikke ses in vivo under normale forhold. For at forstå de forskellige trin i apoptotic celle clearance og sammenligne 'professionelle' fagocytter - makrofager og dendritiske celler til "ikke-professionelle" - tissue-hjemmehørende omkringliggende celler, in vivo billeddannelse af processen er yderst værdifuld. Her beskriver vi en protokol for at studere apoptotic celle clearance i levende Drosophila embryoner. At følge dynamikken i forskellige trin i fagocytose vi bruger specifikke markører for apoptotiske celler og fagocytter. Derudover kan vi overvåge to fagocyt systemer i parallel: 'professionelle' makrofager og 'semi-professional 'glia i udviklingslandene centralnervesystemet (CNS). Den her beskrevne metode anvender Drosophila embryo som en fremragende model for tidstro studier af apoptotic celle clearance.
Introduction
Den rette fjernelse af uønskede eller afvigende celler gennem apoptose og efterfølgende fagocytose er afgørende for embryonale udvikling samt vævshomeostase i den voksne. Fagocytose af apoptotiske celler eller apoptotisk celle clearance er en meget dynamisk proces, der forløber i fire trin: (1) ansættelse af fagocytter til apoptotiske celle ('find-mig "), (2) anerkendelse af cellen som et mål for fagocytose ( 'spise mig "), og (3) engulfment, efterfulgt af (4) fagosomet modning og nedbrydning af apoptotiske partikel 1-5. Der er to typer af fagocytter: 'professionelle' makrofager og umodne dendritiske celler, og "ikke-professionelle" tissue-hjemmehørende omkringliggende celler, som er afgørende for apoptotic celle clearance under metazoan udvikling 6,7.
I Drosophila udvikling, sker fjernelsen af overflødige celler gennem apoptose i tre main faser, først i midten til slutningen af embryo, og derefter i midten puppe, og igen i den tidlige voksen. Under embryogenese apoptotiske partikler fjernes ved 'professionelle' fagocytter, makrofager, og af den "ikke-professionelle" ectoderm og glia 8,9.
I vores tidligere arbejde har vi identificeret en fagocytisk receptor, Six-mikron-under (SIMU), som udelukkende udtrykkes i fagocyterende celler under embryogenese. Brug af simu promotor vi genereret en specifik markør for fagocytiske cellepopulationer (simulere cytGFP), som gør os i stand til at overvåge makrofager, ectoderm og glia samtidig i en live embryo under udvikling 8.. Derudover, ved anvendelse af specifikke markører for apoptotiske celler i forskellige stadier af apoptose vi er i stand til at følge dynamikken i apoptotisk celle clearance in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
At følge dynamikken i apoptotic celle clearance in vivo to populationer af celler skal mærkes: fagocytceller og apoptotiske celler.
For at markere fagocytiske cellepopulationer vi bruger en Drosophila linje, der indeholder simulere cytGFP markør, hvilke etiketter udelukkende fagocytceller i embryo: makrofager, glia og ectoderm 8.. Man kan bruge forskellige markører for fagocytceller, herunder linjer, der indeholder en hemocyte-specifik Gal4 driver (CRQ-Gal4) eller glia-specifikke Gal4 driver (repo-Gal4) samt en genetisk kodet fluorescerende reporter under UAS kontrol (UAS-GFP).
At overvåge apoptotiske celler under apoptotiske celle clearance vi bruger forskellige apoptose / fagocytose markører. Annexin V (Molecular Probes) tjener som en tidlig markør for apoptotiske celler 10, Phiphilux (OncoImmunin) er en fluorogen caspase-3 substrat, der anvendes som et senere apoptosis markør og LysoTracker (Molecular Probes) fungerer som en fagosomet markør. Vi injicere disse reagenser ved hjælp af mikroinjektion systemet PicoPump PV 820.
1.. Klargøring
- Heptan lim:
Rul dobbeltklæbende tape og sætte så meget som du kan i et scintillationsglas, fylde med heptan, forsegle hætteglas med Parafilm, og rock i 24 timer. Tilføj heptan hvis limen er for tyk. - Vi tillader fluerne til at lægge på en forvarmet druesaft agarplade + gær pasta i 2 timer, og derefter overføre pladen til 25 ° C i 10-12 time (afhænger af den ønskede etape) før mikroinjektion og tid lapse optagelser af injicerede embryoner. Vi indsamler embryoner fra agarpladerne holdes ved 25 ° C, hvilket giver embryoner fra trin 15 eller 16 i udvikling.
- Needle forberedelse:
At forberede nåle til injektion, bruger vi en "Sutter instrument 'nål aftrækker og tyndvæggede glasfilamenter (FHC Kapillær slanger). Spidsen af den poolede kapillarrør brødn til en diameter på 0,5-2 um. - Dækglas med lim:
Ved hjælp af en pipettespids sprede en dråbe af heptan lim på én linie i midten af dækglasset. Lad det tørre i et par sekunder. Forbered et par af disse dækglas.
2.. Embryo Forberedelse
- Saml embryoner fra agarplader og overføre dem til en celle si (SPL Life Sciences) ved hjælp af en ren pensel og rindende vand. Sien holdes over et bæger til at indsamle spildevand.
- Vask embryoner i cellefilter anvendelse af vand, indtil al gæren pasta fjernes.
- Udtørre overskydende vand ved at tørre ydersiden af sien ved hjælp Kimwipes.
- Anbring cellefilter i en ren petriskål og tilføje nok 50% blegemiddel til at dække embryoner i cellefilter. Dechorionate embryoner i 2 min lejlighedsvis (2-3 gange) under omrøring dem.
- Skyl med vand udstrakt indtil embryoer løs blegemiddel lugt.
- Placer cellefilter i et rentPetriskål og dække embryoner med vand for at forhindre udtørring.
- Før du starter embryoner indstilling, indlæse 1 ml af den ønskede reagens i to nåle (undertiden en nål kan være tilstoppet). Det tager omkring 5 min for væsken at nå spidsen af nålen.
- Skær et rektangulært stykke af druesaft agar og placere den på et objektglas. Overfør dechorionated embryoner fra petriskålen til agar stykke ved hjælp af en ren pensel.
- Under et fluorescerende dissektion mikroskop vælge korrekt iscenesat embryoner udtrykker GFP markør med en våd pensel og placere hvert embryo tæt på kanten af agar brik i træk efter hinanden (figur 1A). Disse embryoner skal placeres med deres ventrale side op for imaging fagocytose af glia i det centrale nervesystem (CNS).
- Opsætning omkring 10 fostre i én række.
- Fastgør embryoner til et dækglas coatet i midten med en stribe af heptan lim (figur 1B, C
- Placer dækglasset i dehydrering kammer til omkring 5 min (dette afhænger af luftfugtigheden i rummet, og det beløb, der skal injiceres).
- Efter tørring op dække embryoner med halogencarbon olie 700 (Sigma) for at undgå yderligere dehydrering.
- Anbring dækglasset på et objektglas med embryonerne opad. Du kan sætte en dråbe vand på objektglasset for at forhindre flytning af dækglasset. Embryoner er nu klar til injektion. Injektion placering er typisk på den laterale side i midten af embryonet.
3.. Embryo Injection
- Fastgør nålen til en mikromanipulator.
- At bryde nålespidsen sætte kanten af dækglasset i synsfeltet og justere nålen til den samme brændplan. Meget omhyggeligt flytte dækglasset, indtil den rammer nålespidsen og bryder den.
- Fokus på embryoner, skal du placere nålen ind i olie og sørg for at få en flydende dråbe fra nålen. Det betyder, at nålens spids har væretbrudt godt.
- Uden at røre nåleholderen flytte foster til nålen og indsprøjte en dråbe i embryoet. Flyt embryo væk og gå videre til den næste, indtil alle embryonerne injiceres.
4.. Imaging
Vi billede embryoner på et inverteret konfokal mikroskop med en 40X eller 100X mål. Vi venter en pænt placeret foster med CNS i midten, som viser stærke GFP udtryk og en god mærkning af apoptotiske celler efter injektion.
For tidsudløbsdata optagelser af levende fostre, vi normalt vælge 5 eller 6 konfokal skiver (2 um tykke hver). Bagefter, vi laver en fremskrivning af 3 skiver (6 um tykkelse) for at observere hele celler.
Vi bruger markører for apoptotiske celler, der er stabile og ikke blegemiddel nemt. For at undgå GFP blegning vi foretage optagelser med intervaller på 60 sek.
I nogle tilfælde embryoner kan begynde at rullei den tid af videooptagelse. Derfor tager vi et kig en gang imellem ved optagelsen for at stoppe og starte forfra, hvis nødvendigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative billeder fra en film i hvilken apoptotiske celler er mærket med Annexin V, og glia, ektoderm og makrofager er mærket med simule-cytGFP er vist i figur 2.. Hver ramme er en fremskrivning af 3 skiver 2 um hver.
Den embryo af etape 15 er rigtigt placeret viser embryonale CNS i midten med godt mærket glia (g). Makrofager (m), som for det meste udenfor CNS, udviser stærk cytoplasmatisk GFP-ekspression. Ectodermal celler er også mærket med cytoplasmatisk GFP (e). Mange Annexin V positive celler ses i og uden for CNS. At følge engulfment begivenhed er ikke let. Vi fremhævede en begivenhed med en hvid firkant, hvor en glialcelle er oversvømmer et apoptotisk partikel. Bemærk sondering adfærd gliacelle: røre den apoptotiske partikel et par gange uden oversvømmer det og derefter ender med engulfment af Annexin V mærkede apoptotiske celle (figur 2
Yderligere markører for forskellige apoptotiske stadier kan anvendes med den samme fremgangsmåde.
Figur 1. Skematisk fremstilling af embryo forberedelse til microinjections. A. En mikroskopisk slide indeholdende et stykke agar hvorpå embryonerne overføres efter dechorionation. Omkring 20 embryoer anbragt på linje, tæt på kanten af agar stykke med deres ventrale side op, til billeddannelse CNS. B. En dækglasset indeholdende en strimmel af heptan lim i midten. C. dækglas fra B med embryoner fastgjort til heptan lim strimler.
Figur 2. Dynamisk analyse af apoptotic celle clearance. Time-lapse optagelses apoptotic celle clearance i en fase 15 foster. Glia (g), makrofager (m) og ectoderm (e) er mærket med simule-cytGFP (grøn). Apoptotiske celler er markeret med fluorescerende Annexin V (rød). A. Udvalgte billeder fra et repræsentativt film vises. En gliacelle oversvømmer et apoptotisk celle er vist ved et rektangel. B. Nærbillede udsigt over den markerede firkant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apoptotisk celle clearance er en kritisk sidste stadie af apoptose, som er meget dynamisk. Derfor realtid undersøgelser af processen er af allerstørste betydning. Her beskriver vi en protokol, der muliggør overvågning af apoptotic celle clearance i levende udviklingslandene Drosophila embryoner. I denne procedure, skal to populationer af celler mærkes med specifikke markører: apoptotiske celler og fagocytter. Den simu-cytGFP reporter er egnet til overvågning fagocytiske makrofager, glia og ectoderm samtidig i den samme embryo, w hich gør det muligt at følge forskellige fagocytiske cellepopulationer samtidigt. Dette er en stor fordel for at studere "professionelle" og "ikke-professionelle" clearance samtidigt sammenligne konkrete aspekter af processen, såsom hastighed, specificitet og nedbrydning evne. En ulempe ved denne fremgangsmåde er, at simulere cytGFP markør udtrykkes særdeles stærkt i makrofager og meget svagereglia, som kunne være vanskelig at justere på den samme film. Men man kan billede apoptotic celle clearance af makrofager separat fra denne proces i CNS, ved at køre GFP udtryk med specifikke Gal4s (CRQ-Gal4 for makrofager og repo-Gal4 for glia).
Forskellige markører for apoptotiske celler afspejler specifikke molekylære og morfologiske ændringer er af stor værdi for forståelsen af dynamikken og reversibilitet apoptose og celle clearance. Desuden realtid optagelser af apoptotic celle clearance ved hjælp af disse markører tilføje yderligere oplysninger om mutant fænotyper, som ikke kunne være opnået ved anvendelse af konventionelle immunhistokemi teknikker i faste embryoner.
Den sværeste trin af den beskrevne protokol, når imaging udviklingslandene CNS, er det ekstremt præcis positionering af embryonerne før injektion. Selv en lille spil dækglasset under fastgørelse af den forbehandledeembryoner til limen kunne ændre deres holdning, hvilket ikke ville være passende for billeddannelse CNS. Den embryo fastgørelse skridt bør ske med maksimal opmærksomhed.
Udvikling af yderligere markører for bestemte stadier i apoptose og fagocytose ville være yderst ønskeligt finere dissektion og mulig manipulation af apoptotic celle clearance. Protokollen præsenteres her tjener som et godt grundlag for den fremtidige udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et Marie Curie reintegrationsstipendium (IRG249084). Vi takker alle medlemmer af Kurant laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A.
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
