Summary
Nous décrivons ici une méthode efficace pour étudier la dynamique de la clairance des cellules apoptotiques
Abstract
L'élimination correcte des cellules indésirables ou aberrante par apoptose et la phagocytose ultérieure (clairance cellulaire par apoptose) est cruciale pour le développement normal chez tous les organismes pluricellulaires. Clairance cellulaire par apoptose est un processus hautement dynamique, intimement associée à la mort cellulaire, les cellules apoptotiques unengulfed sont à peine vus in vivo dans des conditions normales. Afin de comprendre les différentes étapes de dégagement des cellules apoptotiques et de comparer les phagocytes «professionnels» - les macrophages et les cellules dendritiques de «non-professionnel» - cellules voisines tissu-résidents, l'imagerie in vivo en direct du processus est extrêmement précieux. Ici, nous décrivons un protocole pour l'étude de clairance des cellules apoptotiques dans les embryons de drosophile en direct. Pour suivre la dynamique des différentes étapes de la phagocytose que nous utilisons marqueurs spécifiques des cellules apoptotiques et les phagocytes. En outre, nous pouvons surveiller deux systèmes phagocyte en parallèle: les macrophages «professionnels» et «semi-profeglie ssional »dans le système nerveux central en développement (SNC). La méthode décrite ici utilise l'embryon de drosophile comme un excellent modèle pour l'étude en temps réel de la clairance des cellules apoptotiques.
Introduction
L'élimination correcte des cellules indésirables ou aberrante par apoptose et la phagocytose ultérieure est crucial pour le développement embryonnaire ainsi que pour l'homéostasie tissulaire chez l'adulte. Phagocytose des cellules apoptotiques ou l'autorisation cellulaire par apoptose est un processus très dynamique qui se déroule en quatre étapes: (1) le recrutement de phagocytes à la cellule apoptotique («Trouvez-moi»), (2) la reconnaissance de la cellule comme une cible pour la phagocytose ( «eat-me») et (3) l'engloutissement, suivi par (4) maturation du phagosome et de la dégradation de la particule apoptotique 1-5. Il existe deux types de phagocytes: macrophages «professionnels» et les cellules dendritiques immatures, et le «non-professionnels» les cellules voisines tissu-résidents, qui sont cruciales pour le dédouanement des cellules apoptotiques pendant métazoaires développement 6,7.
En développement chez la drosophile, l'élimination des cellules superflues par apoptose se produit dans trois mphases Ain, d'abord dans le milieu à la fin embryon, puis au milieu chrysalide, puis de nouveau au début des adultes. Au cours de l'embryogenèse particules apoptotiques sont éliminés par les phagocytes «professionnels», les macrophages et les cellules gliales par ectoderme et 8,9 «non-professionnel».
Dans nos précédents travaux, nous avons identifié un récepteur phagocytaire, Six-microns-sous (SIMU), qui est exprimé exclusivement dans les cellules phagocytaires cours de l'embryogenèse. En utilisant le promoteur simulation, nous avons généré un marqueur spécifique des populations de cellules phagocytaires (simu-cytGFP) qui nous permet de suivre les macrophages, les cellules gliales ectoderme et simultanément dans un embryon en développement Live 8. En outre, en utilisant des marqueurs spécifiques des cellules apoptotiques dans les différentes étapes de l'apoptose, nous sommes en mesure de suivre la dynamique de dégagement cellulaire par apoptose in vivo.
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Protocol
Pour suivre la dynamique de l'élimination des cellules apoptotiques in vivo deux populations de cellules doivent être étiquetés: les cellules phagocytaires et les cellules apoptotiques.
Pour marquer des populations de cellules phagocytaires nous utilisons une ligne Drosophila contenant le marqueur simu-cytGFP, qui marque les cellules phagocytaires exclusivement dans l'embryon: les macrophages, les cellules gliales et de l'ectoderme 8. On peut utiliser différents marqueurs pour les cellules phagocytaires, y compris les lignes contenant un pilote Gal4 hemocyte spécifique (CRQ-Gal4) ou des cellules gliales spécifique Gal4 conducteur (repo-Gal4) et un rapporteur fluorescent génétiquement codés sous contrôle UAS (UAS-GFP).
Pour surveiller les cellules apoptotiques au moment du dédouanement des cellules apoptotiques, nous utilisons différents apoptose / marqueurs de phagocytose. Annexine V (Molecular Probes) sert de marqueur précoce des cellules apoptotiques 10; Phiphilux (OncoImmunin) est un fluorogène substrat caspase-3, qui est utilisé comme un apopto tardsis marqueur, et Lysotracker (Molecular Probes) fonctionne comme un marqueur phagosome. Nous injectons ces réactifs en utilisant le système de micro-injection PicoPump PV 820.
1. Préparatifs
- Colle Heptane:
Déroulez ruban adhésif double face et de mettre autant que vous le pouvez dans un flacon à scintillation, remplissez avec de l'heptane, sceller la fiole avec du Parafilm et le rock pendant 24 heures. Ajouter heptane si la colle est trop épaisse. - Nous permettons aux mouches pondent sur une plaque préchauffée jus de raisin agar + levure collez pendant 2 heures, puis de transférer la plaque à 25 ° C pendant 10-12 heures (selon le stade désiré) avant la micro-injection et l'heure des enregistrements de déchéance des embryons injectés. Nous recueillons des embryons à partir des plaques d'agar maintenue à 25 ° C, fournissant ainsi des embryons de stade 15 ou 16 du développement.
- préparation de l'aiguille:
Pour préparer aiguilles pour injection, nous utilisons un «instrument Sutter 'extracteur d'aiguilles et minces filaments de verre à parois (tube capillaire FHC). La pointe du capillaire commun est rompun d'un diamètre de 0,5 à 2 um. - Lamelle avec de la colle:
En utilisant une pointe de pipette disperser une goutte de colle à l'heptane en une ligne au milieu de la lamelle. Laissez sécher pendant quelques secondes. Préparer un peu de ces lamelles.
2. Préparation embryon
- Recueillir des embryons à partir de plaques d'agar et de les transférer à un tamis cellulaire (SPL sciences de la vie) à l'aide d'un pinceau propre et l'eau courante. La crépine est maintenue sur un gobelet à recueillir les eaux usées.
- Lavez embryons dans la passoire de la cellule avec de l'eau jusqu'à ce que toute la pâte de levure est enlevée.
- Sécher l'excès d'eau en l'essuyant à l'extérieur du filtre à l'aide Kimwipes.
- Placez le tamis cellulaire dans une boîte de Petri propre et ajouter suffisamment d'eau de Javel à 50% pour couvrir les embryons dans le tamis cellulaire. Dechorionate les embryons pendant 2 min de temps en temps (2-3 fois) les remuant.
- Rincez abondamment avec de l'eau jusqu'à ce que les embryons en vrac l'odeur d'eau de Javel.
- Placez le tamis cellulaire dans un récipient propreBoîte de Pétri et couvrir les embryons avec de l'eau pour éviter le dessèchement haut.
- Avant de commencer réglage des embryons, charger 1 pl du réactif désiré en deux aiguilles (parfois une aiguille peut être bouchée). Il faut environ cinq minutes pour que le liquide atteigne la pointe de l'aiguille.
- Coupez un morceau rectangulaire d'agar jus de raisin et le placer sur une lame de microscope. Transfert d'embryons dechorionated de la boîte de Pétri à la pièce de gélose à l'aide d'un pinceau propre.
- Sous un microscope de dissection fluorescent sélectionner correctement mis en scène embryons exprimant le marqueur GFP en utilisant un pinceau humide et placez chaque embryon près du bord de la pièce d'agar-agar dans une rangée un après l'autre (figure 1A). Les embryons doivent être placés avec leur face ventrale de la phagocytose d'imagerie par les cellules gliales dans le système nerveux central (SNC).
- Mettre en place environ 10 embryons dans une rangée.
- Attacher les embryons à une lamelle recouverte au milieu d'une bande de colle heptane (figure 1B, C
- Placez la lamelle dans la chambre de déshydratation pendant environ 5 minutes (cela dépend de l'humidité de la pièce et la quantité à injecter).
- Après séchage jusqu'à couvrir les embryons avec de l'huile d'halocarbures 700 (Sigma) pour éviter une déshydratation.
- Placer la lamelle couvre-objet sur une lame de microscope, avec des embryons vers le haut. Vous pouvez mettre une goutte d'eau sur la lame pour empêcher le déplacement de la lamelle. Les embryons sont maintenant prêtes pour l'injection. emplacement d'injection est typiquement sur le côté latéral au milieu de l'embryon.
3. Injection d'embryons
- Fixer l'aiguille à un micromanipulateur.
- Pour briser la pointe de l'aiguille mis au bord de la lamelle dans le champ de vision et d'ajuster l'aiguille au même plan focal. Très déplacer soigneusement la lamelle jusqu'à ce qu'elle touche le bout de l'aiguille et la casse.
- En se concentrant sur les embryons, placez l'aiguille dans le pétrole et vous assurer d'obtenir une goutte de liquide à partir de l'aiguille. Cela signifie que la pointe de l'aiguille a étébien cassé.
- En évitant de toucher le support d'aiguille déplace l'embryon dans l'aiguille et injecter une goutte dans l'embryon. Déplacer l'embryon loin et passer à la suivante jusqu'à ce que tous les embryons sont injectés.
4. Imaging
Nous avons l'image des embryons sur un microscope confocal inversé avec un objectif 40X ou 100X. Nous recherchons un embryon bien positionné avec le CNS dans le milieu, ce qui montre l'expression de la GFP solide et un bon étiquetage des cellules apoptotiques après l'injection.
Pour le temps des enregistrements de déchéance d'embryons vivants, nous choisissons généralement 5 ou 6 tranches confocale (2 um d'épaisseur chacune). Ensuite, nous faisons une projection de 3 tranches (6 um d'épaisseur) afin d'observer des cellules entières.
Nous utilisons des marqueurs pour les cellules apoptotiques qui sont stables et ne blanchissent pas facilement. Pour éviter GFP blanchiment nous faire des enregistrements à des intervalles de 60 sec.
Dans certains cas, les embryons peuvent commencer à roulerpendant le temps d'enregistrement vidéo. Par conséquent, nous prenons un coup d'œil de temps en temps à l'enregistrement afin d'arrêter et recommencer si nécessaire.
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Representative Results
images représentatives d'un film dans lequel les cellules apoptotiques sont étiquetés avec l'annexine V et cellules gliales, ectoderme et les macrophages sont étiquetés avec simu-cytGFP sont présentés dans la figure 2. Chaque image est une projection de 3 tranches de 2 um chacun.
L'embryon de l'étape 15 est correctement positionné montrant le SNC embryonnaire dans le milieu de la glie bien étiquetés (g). Macrophages (M), qui sont pour la plupart à l'extérieur du SNC, montrent une forte expression de la GFP cytoplasmique. Cellules ectodermiques sont également marquées avec la GFP cytoplasmique (e). De nombreuses cellules positives annexine V sont visibles à l'intérieur et à l'extérieur du SNC. Pour suivre l'événement à l'embrasement n'est pas facile. Nous avons souligné un événement avec un rectangle blanc où une cellule gliale est engloutit une particule apoptotique. Notez le comportement de sondage de la cellule gliale: toucher la particule apoptotique quelques fois sans engloutissant puis aboutissant à une immersion de l'annexine V étiquetés cellulaire par apoptose (Figure 2
Marqueurs supplémentaires pour les différentes étapes apoptotiques pourraient être utilisés avec la même procédure.
Figure 1. Représentation schématique de la préparation de l'embryon pour microinjections. A. Une lame de microscope contenant un morceau de gélose sur lequel les embryons sont transférés après dechorionation. Environ 20 embryons sont placés en ligne, à proximité du bord de la pièce de la gélose, de leur côté ventral vers le haut, pour l'imagerie du SNC. B. Une lamelle contenant une bande de colle heptane dans le milieu. C. La lamelle de B avec des embryons fixée à la bande de colle heptane.
Figure 2. L'analyse dynamique de la clairance des cellules apoptotiques. D'enregistrement Time-lapses de la clairance des cellules apoptotiques dans un stade de 15 embryons. Gliales (g), les macrophages (M) et de l'ectoderme (e) sont étiquetés avec simu-cytGFP (vert). Les cellules apoptotiques sont marqués par la fluorescence Annexin V (rouge). A. cadres sélectionnés à partir d'un film représentatifs sont présentés. Une cellule gliale engloutissant une cellule apoptotique est représenté par un rectangle. B. Gros plan vue sur le rectangle marqué.
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Discussion
Clairance cellulaire par apoptose est une dernière étape critique de l'apoptose, qui est hautement dynamique. Par conséquent études en temps réel du processus sont d'une importance capitale. Nous décrivons ici un protocole qui permet la surveillance de la clairance des cellules apoptotiques dans le développement des embryons de drosophile vivre. Dans cette procédure, deux populations de cellules doivent être marqués à l'aide de marqueurs spécifiques: les cellules apoptotiques et les phagocytes. Le journaliste simu-cytGFP est adapté à la surveillance des macrophages phagocytaires, les cellules gliales et de l'ectoderme simultanément dans le même embryon, w hich permet de suivre les différentes populations de cellules phagocytaires en même temps. C'est un grand avantage pour l'étude de «professionnel» et «non-professionnels» dédouanement en même temps, en comparant les aspects spécifiques du processus tels que la vitesse, la spécificité et la capacité de dégradation. Un inconvénient de cette approche est que marqueur simu-cytGFP s'exprime très fortement dans les macrophages et beaucoup plus faible dansglie, ce qui pourrait être difficile à régler dans le même film. Cependant, on peut l'image dégagement apoptotique des cellules par les macrophages séparément de ce processus dans le SNC, en conduisant expression de la GFP avec Gal4s spécifiques (CRQ-Gal4 pour les macrophages et repo-Gal4 de cellules gliales).
Différents marqueurs de cellules apoptotiques reflétant altérations moléculaires et morphologiques spécifiques sont d'une grande valeur pour comprendre la dynamique et la réversibilité de l'apoptose et de la clairance de la cellule. En outre, les enregistrements en temps réel de dégagement des cellules apoptotiques en utilisant ces marqueurs ajouter des informations supplémentaires à propos de phénotypes mutants, qui ne pourrait être atteint en utilisant des techniques d'immunohistochimie conventionnels dans les embryons fixes.
L'étape la plus difficile du protocole décrit, lorsque l'imagerie du SNC en développement, est le positionnement extrêmement précis des embryons avant l'injection. Même un léger mouvement de la lamelle lors de la fixation du prêtembryons à la colle pourraient changer leur position, ce qui ne serait pas approprié pour l'imagerie du système nerveux central. L'embryon étape de fixation doit être fait avec le maximum d'attention.
Développement de marqueurs supplémentaires pour les étapes spécifiques de l'apoptose et la phagocytose serait extrêmement souhaitable pour la dissection plus fine possible et la manipulation de la clairance des cellules apoptotiques. Le protocole présenté ici constitue une bonne base pour le développement futur.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une réintégration Marie Curie Grant (IRG249084). Nous remercions tous les membres du laboratoire Kurant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
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