Summary
Hier beschreiben wir eine effektive Methode zur Untersuchung der Dynamik apoptotischen Clearance
Abstract
Die ordnungsgemäße Beseitigung von unerwünschten oder anomalen Zellen durch Apoptose und anschließende Phagozytose (apoptotischen Clearance) ist entscheidend für die normale Entwicklung in allen vielzelligen Organismen. Apoptotische Clearance ist ein sehr dynamischer Prozess eng mit Zelltod assoziiert; unengulfed apoptotischen Zellen sind kaum in vivo unter normalen Bedingungen gesehen. Um die verschiedenen Schritte des apoptotischen Spiel zu verstehen und "professionelle" Phagozyten vergleichen - Makrophagen und dendritischen Zellen zu "nicht-professionellen" - Gewebe-resident benachbarten Zellen, in vivo Echtzeit-Bildgebung des Prozesses ist äußerst wertvoll. Hier beschreiben wir ein Protokoll für das Studium apoptotischen Spiel in Live-Drosophila Embryonen. Um die Dynamik der verschiedenen Schritte der Phagozytose verwenden wir spezifische Marker für apoptotische Zellen und Fresszellen folgen. Darüber hinaus können wir überwachen zwei phagocyte Systeme parallel: "professionelle" Makrophagen und "semi-Professional 'Glia in der Entwicklung des zentralen Nervensystems (ZNS). Die hier beschriebene Methode nutzt die Drosophila-Embryo als hervorragendes Modell für Echtzeit Untersuchungen des apoptotischen Clearance.
Introduction
Die ordnungsgemäße Beseitigung von unerwünschten oder anomalen Zellen durch Apoptose und anschließende Phagozytose ist von entscheidender Bedeutung für die embryonale Entwicklung sowie Gewebshomöostase beim Erwachsenen. Phagozytose von apoptotischen Zellen Apoptose oder Clearance ist ein sehr dynamischer Prozess, der in vier Stufen verläuft: (1) Rekrutierung von Phagozyten der apoptotischen Zelle ("Find-me"), (2) die Anerkennung der Zelle als Ziel für die Phagozytose ( "eat-me ') und (3) engulfment, gefolgt von (4) Phagosomenreifung und Abbau der apoptotischen Teilchen 1-5. Es gibt zwei Arten von Fresszellen: "professionelle" Makrophagen und unreifen dendritischen Zellen, und die "nicht-professionellen" Gewebe-resident benachbarten Zellen, die entscheidend für apoptotischen Clearance bei Metazoen Entwicklung 6,7 sind.
In Drosophila Entwicklung erfolgt die Eliminierung von überflüssigen Zellen durch Apoptose in drei main Phasen, zuerst in der Mitte bis Ende der Embryo, dann in der Mitte der Puppe, und wieder im frühen Erwachsenenalter. Während der Embryogenese apoptotischer Partikel werden durch "professionelle" Phagozyten, Makrophagen und durch die "nicht-professionellen" Ektoderm und Glia 8,9 entfernt.
In unserer bisherigen Arbeit haben wir einen phagocytic Rezeptor, Six-Mikron-under (SIMU), die ausschließlich in Fresszellen ausgedrückt während der Embryogenese identifiziert. Mit der Simulations-Promotor erzielten wir ein spezifischer Marker für phagocytic Zellpopulationen (Simu-cytGFP), die uns zu Makrophagen, Ektoderm und Glia gleichzeitig überwachen in einer Live-entwickelnden Embryo 8 ermöglicht. Zusätzlich kann durch Verwendung spezifischer Marker für apoptotische Zellen in verschiedenen Stadien der Apoptose, sind wir in der Lage, um die Dynamik des apoptotischen Clearance in vivo zu folgen.
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Protocol
Fresszellen und apoptotischen Zellen: Um die Dynamik des apoptotischen Clearance in vivo zwei Populationen von Zellen markiert werden folgen müssen.
Makrophagen, Glia und Ektoderm 8: phagocytic Zellpopulationen verwenden wir eine Drosophila Zeile mit der Simu-cytGFP Marker, die ausschließlich Fresszellen Etiketten im Embryo zu markieren. Man kann verschiedene Marker für Fresszellen, einschließlich Linien, die eine hemocyte-spezifische Gal4 Treiber (crq-Gal4) oder Glia-spezifische Gal4 Treiber (Repo-Gal4) und einem genetisch kodierten fluoreszierenden Reporter unter UAS-Kontrolle (UAS-GFP) verwenden.
Um apoptotischen Zellen während apoptotischen Clearance Monitor verwenden wir verschiedene Apoptose / Phagozytose Marker. Annexin V (Molecular Probes) dient als ein früher Marker für apoptotische Zellen 10; Phiphilux (OncoImmunin) eine fluorogene Caspase-3-Substrat, die als später Apoptose verwendet wirdsis Marker und LysoTracker (Molecular Probes) arbeitet als phagosome Marker. Wir injizieren diese Reagenzien mit dem Mikroinjektionssystem PicoPump PV 820.
1. Getting Ready
- Heptane Kleber:
Rollen Sie doppelseitiges Klebeband und legen Sie so viel Sie können in einem Szintillationsfläschchen, mit Heptan füllen, verschließen Sie das Fläschchen mit Parafilm und Rock für 24 Stunden. In Heptan, wenn der Kleber ist zu dick. - Wir lassen die Fliegen auf einer vorgewärmten Traubensaft Agarplatte + Hefe für 2 Std. fügen lag, und übertragen Sie dann die Platte auf 25 ° C für 10-12 Stunden (abhängig von der gewünschten Stufe) vor der Mikroinjektion und Zeitrafferaufnahmen der injizierten Embryonen. Wir sammeln Embryonen von den Agar-Platten bei 25 ° C gehalten, wodurch Embryonen aus der Stufe 15 bzw. 16 der Entwicklung.
- Needle Zubereitung:
Um Nadeln zur Injektion, verwenden wir eine "Sutter Instrument 'Nadel Abzieher und dünnwandigen Glasfilamenten (FHC Kapillar-Rohr). Die Spitze der Kapillare gebündelt ist pleiten zu einem Durchmesser von 0,5-2 um. - Deckglas mit Leim:
Mit einer Pipettenspitze dispergieren einen Tropfen der Heptan Klebstoff in einer Linie in der Mitte des Deckglases. Lassen Sie es für ein paar Sekunden trocknen. Bereiten Sie ein paar von diesen Deckgläser.
2. Embryo Vorbereitung
- Sammeln Embryonen aus Agar-Platten und übertragen sie auf eine Zelle Sieb (SPL Life Sciences) mit einem sauberen Pinsel und fließendes Wasser. Das Sieb wird über ein Becherglas gehalten, um Abwasser zu sammeln.
- Waschen Embryonen in der Zelle Sieb mit Wasser, bis alle die Hefe Paste entfernt wird.
- Trocknen Sie das überschüssige Wasser durch Wischen Sie die Außenseite des Filters mit Kimwipes.
- Legen Sie die Zellsieb in einem sauberen Petrischale und fügen Sie genug 50% Bleichmittel auf Embryonen in der Zelle Sieb abdecken. Dechorionate die Embryonen für 2 min gelegentlich (2-3 mal) Rühren sie.
- Ausgiebig mit Wasser spülen, bis Embryonen lose das Bleichmittel Geruch.
- Legen Sie die Zelle Sieb in eine sauberePetrischale und decken die Embryonen mit Wasser zu verhindern Austrocknen.
- Bevor Embryonen Einstellung, laden 1 ul der gewünschten Reagenz in zwei Nadeln (manchmal eine Nadel kann verstopft sein). Es dauert ca. 5 Minuten für die Flüssigkeit, um die Spitze der Nadel zu erreichen.
- Schneiden Sie ein rechteckiges Stück Traubensaft Agar und legen Sie sie auf einem Objektträger. Übertragen dechorionated Embryonen aus der Petrischale auf dem Agar Stück mit einem sauberen Pinsel.
- Unter einem fluoreszierenden Dissektionsmikroskop richtig wählen inszeniert Embryonen Expression des GFP-Marker mit einem nassen Pinsel und legen jedem Embryo nahe an den Rand des Agar Stück in einer Reihe nacheinander (Abbildung 1A). Die Embryonen sollten mit ihrer Bauchseite nach oben eingelegt werden zur Bildgebung Phagozytose durch Gliazellen im zentralen Nervensystem (ZNS).
- Richten Sie etwa 10 Embryonen in einer Zeile.
- Befestigen der Embryonen auf einem Deckglas in der Mitte mit einem Streifen der Klebstoff Heptan (1B, C beschichtet
- Legen Sie das Deckglas in der Dehydratisierung Kammer für ca. 5 min (dies hängt von der Luftfeuchtigkeit des Raumes und der Menge, die injiziert werden).
- Nach dem Trocknen vertuschen die Embryonen mit Halocarbonöl 700 (Sigma) zur Vermeidung weiterer Austrocknung.
- Zeigen das Deckglas auf einem Objektträger mit den Embryonen nach oben. Sie können einen Tropfen Wasser auf der Folie zu verhindern Bewegung des Deckglas gelegt. Embryos sind nun bereit für die Injektion. Injektionsstelle ist typischerweise auf der lateralen Seite in der Mitte des Embryos.
3. Embryo Injection
- Bringen Sie die Nadel in einem Mikromanipulators.
- Um brechen die Nadelspitze setzen den Rand des Deckglases in das Blickfeld und stellen Sie die Nadel auf die gleiche Bildebene. Sehr vorsichtig bewegen das Deckglas, bis er die Nadelspitze trifft und bricht sie.
- Die Konzentration auf die Embryonen, legen Sie die Nadel in die Öl-und sicherzustellen, dass Sie eine flüssige Tropfen aus der Nadel. Es bedeutet, dass die Nadelspitze hatgebrochen gut.
- Ohne Berührung der Nadelhalter bewegen den Embryo in die Nadel und injizieren einen Tropfen in den Embryo. Bewegen Sie den Embryo entfernt und fahren mit dem nächsten, bis alle Embryonen injiziert werden.
4. Imaging
Wir Bild die Embryonen auf einem invertierten konfokalen Mikroskop mit einem 40x oder 100x Objektiv. Wir suchen nach einem schön positioniert Embryo mit dem ZNS in der Mitte, die eine starke GFP-Expression und eine gute Kennzeichnung von apoptotischen Zellen nach der Injektion zeigt.
Für Zeitrafferaufnahmen von lebenden Embryonen wählen wir normalerweise 5 oder 6 konfokalen Scheiben (2 um dicke jeweils). Danach machen wir einen Vorsprung von 3 Scheiben (6 um Dicke), um ganze Zellen zu beobachten.
Wir verwenden Marker für apoptotische Zellen, die stabil sind und nicht bleichen leicht. Um GFP Bleichen machen wir Aufnahmen in Intervallen von 60 sec zu vermeiden.
In einigen Fällen Embryonen können rollenwährend der Zeit der Videoaufnahme. Daher werfen wir einen Blick einmal in eine Weile bei der Aufnahme, um zu stoppen und neu zu starten, wenn nötig.
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Representative Results
Repräsentative Bilder von einem Film, in dem apoptotischen Zellen mit Annexin V markiert sind, und Glia, Ektoderm und Makrophagen sind mit Simu-cytGFP beschriftet sind in Abbildung 2 dargestellt. Jeder Rahmen ist eine Projektion der 3 Scheiben 2 um jeweils.
Der Embryo der Stufe 15 richtig positioniert ist, die die embryonale CNS in der Mitte mit gut markierten Gliazellen (g). Makrophagen (m), die meist außerhalb des ZNS, zeigen starke zytoplasmatische GFP-Expression. Ectodermal Zellen sind auch mit zytoplasmatische GFP (e) bezeichnet. Viele Annexin V positive Zellen innerhalb und außerhalb des ZNS gesehen. Um die engulfment Veranstaltung folgen ist nicht einfach. Wir konnten zeigen, ein Ereignis mit einem weißen Rechteck, wo ein Gliazellen verschlingt eine apoptotische Partikel. Beachten Sie die Sondierung Verhalten der Gliazellen: Durch Berühren des apoptotischen Partikel ein paar Mal ohne verschlingt und dann am Ende mit engulfment der Annexin V markiert apoptotische Zelle (Abbildung 2
Zusätzliche Markierungen für unterschiedliche apoptotische Stufen könnte mit dem gleichen Verfahren verwendet werden.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Embryo Vorbereitung für microinjections. A. einen Objektträger mit einem Stück auf dem Agar Embryonen nach dechorionation übertragen werden. Über 20 Embryonen in Linie angeordnet ist, nahe an den Rand des Agars Stück mit ihrer Bauchseite bis zur Abbildung des ZNS. B. Deckglas mit einem Streifen aus Heptan Kleber in der Mitte. C. Das Deckglas von B mit Embryonen an dem Heptan Klebestreifen.
Abbildung 2. Dynamische Analyse von apoptotischen Clearance. Zeitraffer-Aufnahmes von apoptotischen Spiel in einem Stadium 15 Embryos. Glia (g), Makrophagen (m) und Ektoderm (e) mit Simu-cytGFP (grün) markiert. Apoptotischen Zellen mit dem fluoreszierenden Annexin V (rot) markiert. A. ausgewählter Bilder aus einer repräsentativen Film gezeigt. Ein Gliazellen verschlingt eine apoptotische Zelle wird durch ein Rechteck dargestellt. B. Close up Blick auf den markierten Rechteck.
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Discussion
Apoptotische Clearance ist ein kritischer letzten Stadium der Apoptose, die sehr dynamisch ist. Daher Echtzeit Studien des Verfahrens sind von größter Bedeutung. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Überwachung des apoptotischen Clearance ermöglicht in lebenden Drosophila Embryonen entwickeln. In diesem Verfahren sind zwei Populationen von Zellen mit spezifischen Markern markiert werden: apoptotischen Zellen und Phagozyten. Die Simulation cytGFP Reporter eignet sich zur Überwachung phagocytic Makrophagen, Glia und Ektoderm gleichzeitig in der gleichen Embryo, macht w ird es möglich, verschiedene phagocytic Zellpopulationen in der gleichen Zeit folgen. Dies ist ein großer Vorteil für das Studium "professionell" und "nicht-professionellen" Clearance gleichzeitig, Vergleich spezifische Aspekte des Prozesses, wie Rate, Spezifität und Abbau Fähigkeit. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist, dass Simulation cytGFP Marker extrem stark in Makrophagen exprimiert und viel schwächer inGliazellen, die schwierig sein, in den gleichen Film einstellen könnte. Allerdings kann man Bild apoptotischen Clearance durch Makrophagen unabhängig von diesem Prozess im ZNS, indem die GFP-Expression mit spezifischen Gal4s (crq-Gal4 für Makrophagen und Repo-Gal4 für Glia).
Unterschiedliche Marker für apoptotische Zellen reflektieren spezifische molekulare und morphologische Veränderungen sind von großem Wert für das Verständnis der Dynamik und Reversibilität der Apoptose und Zell-Clearance. Darüber hinaus fügen Echtzeit Aufnahmen des apoptotischen Abstand Verwendung dieser Marker zusätzliche Informationen über Phänotypen, die nicht durch die Verwendung herkömmlicher Techniken in Immunhistochemie fixierte Embryonen erreicht werden konnte.
Der schwierigste Schritt des beschriebenen Protokoll, wenn die Abbildung der Entwicklung von CNS, ist die extrem präzise Positionierung der Embryonen vor der Injektion. Selbst eine geringfügige Bewegung des Deckglases während der Befestigung des vorbereitetenEmbryonen auf den Leim könnte ihre Position ändern, und das wäre nicht angemessen für die Bildgebung des ZNS. Der Embryo Anbringen Schritt sollte mit maximaler Aufmerksamkeit erfolgen.
Entwicklung zusätzlicher Marker für spezifische Stadien der Apoptose und Phagozytose wäre äußerst wünschenswert, für feinere Sezieren und mögliche Manipulation des apoptotischen Clearance. Die hier vorgestellte Protokoll dient als gute Basis für die künftige Entwicklung.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Marie Curie Reintegration Grant (IRG249084) unterstützt. Wir danken allen Mitgliedern der Kurant Labor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
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