Summary
כאן אנו מתארים שיטה יעילה ללימוד דינמיקה של פינוי תאים אפופטוטיים
Abstract
החיסול התקין של תאים לא רצויים או חריגים באמצעות אפופטוזיס וphagocytosis שלאחר מכן (אישור תאים אפופטוטיים) הוא חיוני להתפתחות תקינה בכל היצורים מטזואניים. אישור תאים אפופטוטיים הוא תהליך דינמי מאוד קשר אינטימי עם מוות של תאים, תאים אפופטוטיים unengulfed נראים בקושי in vivo בתנאים רגילים. על מנת להבין את השלבים של אישור תאים אפופטוטיים השונים ולהשוות phagocytes "מקצועי" - מקרופגים ותאים דנדריטיים ל" הלא מקצועי "- תאים שכנים רקמת התושב, בהדמיה לחיות vivo של התהליך הוא יקר מאוד. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללימוד אישור תאים אפופטוטיים בעוברים תסיסנית חיים. כדי לעקוב אחר הדינמיקה של שלבים שונים בphagocytosis אנו משתמשים סמנים ספציפיים לתאים וphagocytes אפופטוטיים. בנוסף, אנו יכולים לעקוב אחר שתי מערכות תא בלען במקביל: מקרופאגים 'מקצועיים' ו 'חצי profeגליה 'ssional במערכת העצבים המרכזית בפיתוח (CNS). השיטה המתוארת כאן מעסיקה את עובר דרוזופילה כמודל מצוין ללימודים בזמן אמת של פינוי תאים אפופטוטיים.
Introduction
החיסול התקין של תאים לא רצויים או חריגים באמצעות אפופטוזיס וphagocytosis הבא הוא קריטי להתפתחות עוברית, כמו גם לאיזון רקמות במבוגר. Phagocytosis של תאים אפופטוטיים או סילוק תאים אפופטוטיים הוא תהליך דינמי מאוד אשר ממשיך בארבעה שלבים: (1) גיוס של phagocytes לתאים אפופטוטיים ("למצוא אותי"), (2) הכרה בתא כיעד לphagocytosis ( 'אוכל אותי') ו (3) היבלעות, ואחריו (4) הבשלת phagosome והשפלה של החלקיקים אפופטוטיים 1-5. ישנם שני סוגים של phagocytes: מקרופגים "מקצועיים" ותאים דנדריטיים, ולא בשלה "הלא מקצועי" תאים שכנים רקמת תושבים, שהם חיוניים לשחרור מתאים אפופטוטיים במהלך מטזואניים פיתוח 6,7.
בפיתוח דרוזופילה, חיסול התאים מיותרים באמצעות אפופטוזיס מתרחש בשלושה מ 'שלבים ראשון בעין, באמצע לעובר מאוחר, ואז באמצע שנתי הגולם, ושוב בבוגרים המוקדמים. במהלך embryogenesis חלקיקים אפופטוטיים יוסרו על ידי phagocytes "מקצועי", מקרופאגים, ועל ידי האאקטודרם וגליה 8,9 "לא מקצועיים".
בעבודה הקודמת שלנו שזיהינו קולט phagocytic, שישה מיקרונים-תחת (Simu), אשר בא לידי ביטוי אך ורק בתאים phagocytic במהלך embryogenesis. באמצעות אמרגן Simu נוצר סמן ספציפי לאוכלוסיות תאי phagocytic (Simu-cytGFP) אשר מאפשרת לנו לעקוב אחר מקרופאגים, האאקטודרם וגליה במקביל בעובר חי 8 בפיתוח. בנוסף לכך, על ידי שימוש בסמנים ספציפיים לתאים אפופטוטיים בשלבים של אפופטוזיס שונים, אנו מסוגלים לעקוב אחר הדינמיקה של פינוי תאים אפופטוטיים in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כדי לעקוב אחר הדינמיקה של אישור אפופטוטיים תא in vivo שתי אוכלוסיות של תאים חייבים להיות מתויגים: תאי phagocytic ותאים אפופטוטיים.
כדי לסמן אוכלוסיות תאי phagocytic אנו משתמשים שורת דרוזופילה המכילים את הסמן Simu-cytGFP, אשר תוויות תאים באופן בלעדי phagocytic בעובר: מקרופאגים, גליה והאאקטודרם 8. אפשר להשתמש בסמנים שונים לתאי phagocytic, כולל שורות המכילות נהג Gal4 hemocyte ספציפי (CRQ-Gal4) או גליה ספציפי Gal4 נהג (repo-Gal4) וכתב ניאון מקודד גנטי תחת שליטת כטב"מ (כטב"מ-GFP).
כדי לפקח על תאים אפופטוטיים במהלך פינוי תאים אפופטוטיים אנו משתמשים אפופטוזיס שונה / סמני פאגוציטוזיס. Annexin V (בדיקות מולקולריות) משמש כסמן מוקדם לתאים אפופטוטיים 10; Phiphilux (OncoImmunin) הוא caspase-3 מצע fluorogenic, המשמש כapopto מאוחר יותראחותי סמן, וLysotracker (בדיקות מולקולריות) עובד כסמן phagosome. אנו מזריקים חומרים כימיים אלה באמצעות מערכת microinjection PicoPump PV 820.
1. מתכונן
- דבק heptane:
לפרוש קלטת דו צדדית ולשים עד כמה שאתה יכול בבקבוקון נצנץ, למלא עם heptane, לאטום את הבקבוקון עם Parafilm, וסלע במשך 24 שעות. הוסף heptane אם הדבק עבה מדי. - אנו מאפשרים את הזבובים להניח על צלחת מחוממת מראש מיץ ענבים אגר + שמרים להדביק לשעה 2, ולאחר מכן להעביר את הצלחת עד 25 מעלות צלזיוס במשך 10-12 שעות (תלוי בשלב הרצוי) לפני ההקלטות לשגות microinjection וזמן של עוברים מוזרקים. אנו אוספים עוברים מהצלחות אגר נשמרו על 25 מעלות צלזיוס, ובכך לספק עובר מן השלב 15 או 16 של פיתוח.
- הכנת מחט:
כדי להכין את המחטים להזרקה, אנו משתמשים בחולץ המחט 'מכשיר סאטר' וסיבי זכוכית חומה דקים (צינור נימי FHC). הטיפ של נימים ונקווה שברהn לקוטר של 0.5-2 מיקרומטר. - Coverslip עם דבק:
באמצעות קצה פיפטה לפזר טיפת דבק heptane בשורה אחת באמצע של coverslip. לתת לו להתייבש במשך כמה שניות. הכן כמה coverslips אלה.
2. הכנת עובר
- איסוף עובר מצלחות אגר ולהעבירם למסננת תא (מדעי החיים SPL) באמצעות מברשת צבע נקי ומים זורמים. המסננת מתקיימת מעל כוס כדי לאסוף מים לבזבז.
- שטוף עובר במסננת התא באמצעות מים עד שכל עיסת השמרים מוסרת.
- לייבש את עודפי מים על ידי ניגוב מחוץ למסננת באמצעות Kimwipes.
- מניחים את מסננת התא בצלחת פטרי נקי ולהוסיף מספיק אקונומיקה 50% כדי לכסות את העוברים במסננת התא. Dechorionate את העוברים במשך 2 דקות מדי פעם (2-3 פעמים) ערבובם.
- לשטוף עם מים בהרחבה עד שעוברים רופפים ריח אקונומיקה.
- מניחים את מסננת התא לנקיצלחת פטרי ולכסות את העוברים עם מים כדי למנוע התייבשות.
- לפני שמתחיל הגדרת עוברים, טען μl 1 של המגיב הרצוי לשתי מחטים (לפעמים יכולה להיות סתומה מחט). זה לוקח בערך 5 דקות לנוזל להגיע לקצה המחט.
- לחתוך חתיכה מלבנית של אגר מיץ ענבים ולמקם אותו בשקופית מיקרוסקופ. העברה עובר dechorionated מצלחת פטרי לפיסה אגר באמצעות מברשת צבע נקי.
- תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתיחה בחר כראוי מבוימת עוברים המבטאים את סמן GFP באמצעות מברשת צבע רטובה ומניח את כל עובר בסמוך לקצה של החתיכה אגר בשורה אחד אחרי השני (איור 1 א). העוברים צריכים להיות ממוקמים עם צד גחונם לphagocytosis הדמיה על ידי גליה במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- הקים כ -10 עוברים בשורה אחת.
- לצרף את העוברים לcoverslip מצופה באמצע עם רצועת דבק heptane (איור 1 ב, ג
- מקם את coverslip בתא ההתייבשות לכ -5 דקות (זה תלוי בלחות של החדר ואת הסכום להיות מוזרקים).
- לאחר ייבוש עד לכסות את העוברים עם שמן halocarbon 700 (Sigma), כדי למנוע התייבשות נוספת.
- מקם את coverslip בשקופית מיקרוסקופ עם העוברים פונים כלפי מעלה. אתה יכול לשים טיפת מים על השקופיות כדי למנוע ההעברה של coverslip. הם עוברים עכשיו הוא מוכן להזרקה. מיקום הזרקה הוא בדרך כלל בצד לרוחב באמצעו של העובר.
3. הזרקת עובר
- חבר את המחט לmicromanipulator.
- כדי לשבור את קצה המחט לשים את קצה coverslip בשדה הראייה ולהתאים את המחט לאותו מישור המוקד. מאוד להעביר בזהירות את coverslip עד שהוא פוגע בקצה המחט ושובר אותו.
- התמקדות בעוברים, למקם את המחט לתוך השמן ולוודא שאתה מקבל טיפת נוזל מהמחט. זה אומר שקצה המחט כברנשבר גם.
- בלי לגעת בבעל המחט להזיז את העובר לתוך המחט ולהזריק טיפה לעובר. להזיז את העובר משם ולהמשיך לשלב הבא עד שכל העוברים מוזרקים.
4. הדמיה
אנחנו תמונה את העוברים במיקרוסקופ confocal הפוך עם מטרת 40X או 100X. אנחנו מחפשים עובר ממוקם יפה עם מערכת העצבים המרכזית באמצע, מה שמראה ביטוי של GFP חזק ותיוג טוב של תאים אפופטוטיים לאחר הזרקה.
להקלטות זמן לשגות של עוברי חיות אנחנו בדרך כלל לבחור 5 או 6 פרוסות confocal (2 מיקרומטר עבה כל אחד). לאחר מכן, אנו עושים השלכה של 3 פרוסות (עובי מיקרומטר 6) על מנת לבחון תאים שלמים.
אנו משתמשים בסמנים לתאים אפופטוטיים שהם יציבים ולא להלבין בקלות. כדי להימנע מהלבנת GFP לבצע הקלטות במרווחים של 60 שניות.
במקרים מסוימים עובר עשוי להתחיל להתגלגלבזמן הקלטת וידאו. לכן, אנחנו נסתכל פעם בכמה זמן בהקלטה על מנת לעצור ולהתחיל מחדש במידת צורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מסגרות נציג מסרט שבו תאים אפופטוטיים מסומנים עם Annexin V, וגליה, האאקטודרם ומקרופאגים מסומנים עם Simu-cytGFP מוצגות באיור 2. כל מסגרת היא השלכה של 3 פרוסות 2 מיקרומטר כל אחד.
העובר של שלב 15 ממוקם כראוי מראה את מערכת עצבים העובריים באמצע עם גליה שכותרתו היטב (ז). המקרופאגים (מ '), שהם בעיקר מחוץ למערכת העצבים המרכזית, מראים ביטוי של GFP cytoplasmic חזק. תאי ectodermal גם מסומנים עם GFP cytoplasmic (ה). רבים תאים חיוביים Annexin V נתפסים בתוך ומחוץ למערכת העצבים המרכזיים. לעקוב אחרי אירוע ההיבלעות היא לא קל. אנחנו הדגישו אירוע אחד עם מלבן לבן שבו תא גלייה הוא יבלע חלקיקים אפופטוטיים. שימו לב להתנהגות החיטוט של תא גליה: לגעת בחלקיקים אפופטוטיים כמה פעמים בלי שתבלע אותו ולאחר מכן עד הסוף עם היבלעות של V Annexin שכותרתו תאים אפופטוטיים (איור 2
סמנים נוספים לשלבי אפופטוטיים שונים יכולים לשמש באותה הפרוצדורה.
איור 1. ייצוג סכמטי של הכנת עובר לmicroinjections. א שקופיות מיקרוסקופיות המכילות פיסת אגר שבעוברים מועברים לאחר dechorionation. כ -20 עוברים ממוקמים בקו אחד, בסמוך לקצה של החתיכה אגר, עם צד גחונם למעלה, להדמיה של מערכת העצבים המרכזית. ב coverslip המכילה רצועת דבק heptane באמצע. ג coverslip מ-B עם עוברים מצורף לרצועת דבק heptane.
איור 2. ניתוח דינמי של אישור תאים אפופטוטיים. הקלטת זמן לשגותים של אישור תאים אפופטוטיים בעובר בשלב 15. גליה (G), מקרופאגים (מ ') והאאקטודרם (ה) מסומנים עם Simu-cytGFP (ירוק). תאים אפופטוטיים מסומנים בAnnexin V הניאון (אדום). מסגרות נבחרות א 'מסרט נציג מוצגים. תא גלייה יבלע תאים אפופטוטיים מתואר על ידי מלבן. ב 'סגור את נופים של המלבן המסומן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אישור תאים אפופטוטיים הוא שלב אחרון קריטי של אפופטוזיס, שהוא מאוד דינמי. לכן לימודים בזמן אמת של התהליך הם בעלי חשיבות עליונה. כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר ניטור של אישור תאים אפופטוטיים בחיים עובר תסיסנית מתפתחים. בהליך זה, שתי אוכלוסיות של תאים חייבים להיות מסומנות באמצעות סמנים ספציפיים: תאים וphagocytes אפופטוטיים. כתב Simu-cytGFP מתאים לניטור מקרופאגים phagocytic, גליה והאאקטודרם בו זמנית באותו העובר, W hich מאפשר לעקוב אחר אוכלוסיות תאי phagocytic שונות באותו הזמן. זהו יתרון גדול ללימוד 'מקצועי' ו 'לא מקצועי' אישור במקביל, משווה היבטים ספציפיים של התהליך, כגון קצב, סגוליות ויכולת השפלה. חסרון של גישה זו הוא שסמן Simu-cytGFP בא לידי ביטוי מאוד חזק במקרופאגים וחלשים בהרבה בגליה, שעלולה להיות מסובכת לכוונון באותו הסרט. עם זאת, אפשר אישור תמונת אפופטוטיים תא על ידי מקרופאגים בנפרד מתהליך זה של מערכת העצבים המרכזית, על ידי הנהיגה הביטוי של GFP עם Gal4s הספציפי (CRQ-Gal4 למקרופאגים וריפו-Gal4 לגליה).
סמנים שונים לתאים אפופטוטיים המשקפים שינויים מולקולריים ומורפולוגי ספציפיים הם בעלי ערך רב להבנת הדינמיקה וההפיכות של אפופטוזיס ואישור תא. יתר על כן, הקלטות בזמן אמת של פינוי תאים אפופטוטיים באמצעות סמנים אלה להוסיף מידע נוסף על פנוטיפים שעברו מוטציה, אשר לא יכול להיות מושגת על ידי שימוש בטכניקות אימונוהיסטוכימיה קונבנציונליות בעוברים קבועים.
הצעד הקשה ביותר של הפרוטוקול המתואר, כאשר ההדמיה של מערכת העצבים המרכזית מתפתחים, הוא המיצוב המדויק מאוד של העוברים לפני ההזרקה. אפילו מהלך קל של coverslip במהלך ההתקשרות של מוכןעוברים לדבק יכולים לשנות את עמדתם, שלא תהיה מתאימה להדמיה של מערכת העצבים המרכזית. העובר מצרף צעד צריך להיעשות עם תשומת הלב מרבית.
פיתוח של סמנים נוספים לשלבים מסוימים באפופטוזיס וphagocytosis יהיה רצוי מאוד לנתיחה עדינה ומניפולציה אפשרית של אישור תאים אפופטוטיים. הפרוטוקול המובא כאן משמש כבסיס טוב לפיתוח עתידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מארי קירי Reintegration גרנט (IRG249084). אנו מודים לכל חברי המעבדה Kurant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A.
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
