Summary
यहाँ हम apoptotic सेल निकासी की गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक प्रभावी विधि का वर्णन
Abstract
apoptosis और बाद में phagocytosis के माध्यम से अवांछित या न्यायपालिका कोशिकाओं का उचित उन्मूलन (apoptotic सेल निकासी) सभी metazoan जीवों के सामान्य विकास के लिए महत्वपूर्ण है. Apoptotic सेल निकासी परिचित कोशिका मृत्यु के साथ जुड़े एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है, unengulfed apoptotic कोशिकाओं मुश्किल से सामान्य परिस्थितियों में vivo में देखा जाता है. Apoptotic सेल निकासी के विभिन्न चरणों को समझने के लिए और 'पेशेवर' फ़ैगोसाइट तुलना करने के लिए आदेश में - मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं 'गैर पेशेवर' - ऊतक निवासी पड़ोसी कोशिकाओं, प्रक्रिया के vivo रहते इमेजिंग में अत्यंत मूल्यवान है. यहाँ हम जीवित भ्रूण ड्रोसोफिला में apoptotic सेल निकासी के अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है. हम apoptotic कोशिकाओं और फ़ैगोसाइट के लिए विशिष्ट मार्कर का उपयोग phagocytosis में विभिन्न चरणों की गतिशीलता का पालन करने के लिए. इसके अलावा, हम समानांतर में दो भक्षककोशिकीय प्रणालियों की निगरानी कर सकते हैं: 'पेशेवर' मैक्रोफेज और 'अर्द्ध profeविकासशील केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में ssional 'glia (सीएनएस). यहाँ वर्णित विधि apoptotic सेल निकासी की वास्तविक समय अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में ड्रोसोफिला भ्रूण कार्यरत हैं.
Introduction
apoptosis और बाद में phagocytosis के माध्यम से अवांछित या न्यायपालिका कोशिकाओं का उचित उन्मूलन भ्रूण के विकास के लिए और साथ ही वयस्क में ऊतक homeostasis के लिए महत्वपूर्ण है. Apoptotic कोशिकाओं या apoptotic सेल निकासी की phagocytosis चार चरणों में आगे बढ़ती है जो एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है: apoptotic सेल को फ़ैगोसाइट की (1) भर्ती ('खोजने वाली मुझे'), phagocytosis के लिए एक लक्ष्य के रूप में सेल की (2) पहचान ( 'मुझे खाना') और (3) घिराव, apoptotic कण 1-5 (4) फेगोसोम परिपक्वता और गिरावट के द्वारा पीछा किया. 'पेशेवर' मैक्रोफेज और अपरिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं, और 'गैर पेशेवर' ऊतक निवासी पड़ोसी कोशिकाओं, metazoan विकास 6,7 दौरान apoptotic सेल निकासी के लिए जो महत्वपूर्ण हैं: फ़ैगोसाइट के दो प्रकार के होते हैं.
ड्रोसोफिला विकास, apoptosis के माध्यम से अनावश्यक कोशिकाओं के उन्मूलन तीन मीटर में होता हैदेर से भ्रूण के मध्य में, पहले तो मध्य प्यूपा में, और फिर जल्दी वयस्क में ऐन चरणों,. Embryogenesis दौरान apoptotic कणों 'पेशेवर' फ़ैगोसाइट, मैक्रोफेज, और 'गैर पेशेवर' बाहरी झिल्ली और glia 8,9 द्वारा से हटा रहे हैं.
हमारे पिछले काम में हम embryogenesis दौरान phagocytic कोशिकाओं में विशेष रूप से व्यक्त किया जाता है जो एक phagocytic रिसेप्टर, छह माइक्रोन के नीचे (SIMU) की पहचान की है. मोबाइल प्रमोटर का उपयोग हम हमें एक जीवित विकासशील भ्रूण 8 में एक साथ मैक्रोफेज, बाह्य त्वक स्तर और glia नजर रखने के लिए सक्षम बनाता है जो phagocytic सेल आबादी (मोबाइल-cytGFP) के लिए एक विशिष्ट मार्कर उत्पन्न. इसके अलावा, apoptosis के विभिन्न चरणों में apoptotic कोशिकाओं के लिए विशिष्ट मार्कर का उपयोग करके, हम इन विवो में apoptotic सेल निकासी की गतिशीलता का पालन करने में सक्षम हैं.
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Protocol
Phagocytic कोशिकाओं और apoptotic कोशिकाओं: कोशिकाओं के दो आबादी लेबल किया जाना चाहिए विवो में apoptotic सेल निकासी की गतिशीलता का पालन करने के लिए.
मैक्रोफेज, glia और बाह्य त्वक स्तर 8: हम मोबाइल-cytGFP भ्रूण में विशेष रूप से phagocytic कोशिकाओं लेबल जो मार्कर, जिसमें एक ड्रोसोफिला लाइन का उपयोग phagocytic सेल आबादी चिह्नित करने के लिए. एक एक hemocyte विशेष Gal4 ड्राइवर (crq-Gal4) युक्त लाइनों या glia विशेष Gal4 ड्राइवर (रेपो-Gal4) और यूएएस नियंत्रण (यूएएस GFP) के तहत एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर सहित phagocytic कोशिकाओं, के लिए अलग अलग मार्कर का उपयोग कर सकते हैं.
Apoptotic सेल निकासी के दौरान apoptotic कोशिकाओं पर नजर रखने के लिए हम अलग / apoptosis phagocytosis मार्कर का उपयोग करें. Annexin वी (आण्विक जांच) 10 apoptotic कोशिकाओं के लिए एक प्रारंभिक मार्कर के रूप में कार्य करता है, Phiphilux (OncoImmunin) एक बाद apopto के रूप में प्रयोग किया जाता है जो एक fluorogenic कस्पासे 3 सब्सट्रेट हैबहन मार्कर, और LysoTracker (आण्विक जांच) एक फेगोसोम मार्कर के रूप में काम करता है. हम microinjection प्रणाली PicoPump पीवी 820 का उपयोग करते हुए इन अभिकर्मकों इंजेक्षन.
1. तैयार हो रही
- हेपटैन गोंद:
दो तरफा टेप उतारना और आप एक जगमगाहट शीशी में, 24 घंटा के लिए Parafilm के साथ शीशी, और रॉक सील, हेपटैन साथ भर सकते हैं के रूप में ज्यादा के रूप में डाल दिया. गोंद भी मोटी है तो हेपटैन जोड़ें. - हम मक्खियों एक पूर्व गर्म अंगूर का रस अगर प्लेट + खमीर 2 घंटे के लिए पेस्ट पर रखना करने के लिए अनुमति देते हैं, और फिर 25 से थाली हस्तांतरण डिग्री सेल्सियस 10-12 घंटा (वांछित अवस्था पर निर्भर करता है) के लिए पहले microinjection और समय चूक रिकॉर्डिंग करने के लिए इंजेक्शन भ्रूण की. हम इस प्रकार चरण 15 या विकास के 16 से भ्रूण को उपलब्ध कराने, 25 डिग्री सेल्सियस पर रखा अगर प्लेटों से भ्रूण इकट्ठा.
- सुई तैयारी:
इंजेक्शन के लिए सुइयों को तैयार करने के लिए, हम एक 'सूटर साधन' सुई खींचने और पतली दीवारों कांच तंतु (FHC केशिका टयूबिंग) का उपयोग करें. जमा केशिका की नोक तोड़ दिया है0.5-2 मीटर के एक व्यास के लिए एन. - गोंद के साथ coverslip:
एक विंदुक टिप का उपयोग coverslip के बीच में एक लाइन में हेपटैन गोंद की एक बूंद फैलाने. यह एक कुछ सेकंड के लिए सूखा. इन coverslips के कुछ तैयार करें.
2. भ्रूण तैयारी
- अगर प्लेटों से भ्रूण लीजिए और एक साफ पेंट ब्रश और पानी चल रहा है का उपयोग कर एक सेल झरनी (एसपीएल लाइफ साइंसेज) को हस्तांतरण. झरनी बेकार पानी इकट्ठा करने के लिए एक बीकर में आयोजित किया जाता है.
- सब खमीर पेस्ट निकाल दिया जाता है जब तक पानी का उपयोग सेल झरनी में भ्रूण धो लें.
- Kimwipes उपयोग कर झरनी के बाहर पोंछते से अतिरिक्त पानी बाहर सूखी.
- एक साफ पेट्री डिश में सेल झरनी प्लेस और सेल झरनी में भ्रूण को कवर करने के लिए पर्याप्त 50% ब्लीच जोड़ें. कभी कभी 2 मिनट (2-3 बार) उन्हें क्रियाशीलता के लिए भ्रूण dechorionate.
- भ्रूण ब्लीच गंध ढीला जब तक बड़े पैमाने पर पानी से कुल्ला.
- एक स्वच्छ में सेल झरनी रखेंपेट्री सूख रोकने के लिए पानी के साथ भ्रूण पकवान और कवर.
- भ्रूण सेटिंग शुरू करने से पहले, दो सुइयों (कभी कभी एक सुई भरा जा सकता है) में वांछित अभिकर्मक के 1 μl लोड. यह सुई की नोक तक पहुँचने के लिए तरल के बारे में 5 मिनट लगते हैं.
- अंगूर का रस अगर एक आयताकार टुकड़ा काट और एक खुर्दबीन स्लाइड पर जगह है. पेट्री डिश से एक साफ पेंट ब्रश का उपयोग अगर टुकड़ा करने dechorionated भ्रूण स्थानांतरण.
- एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे ठीक से चयन एक गीला पेंट ब्रश का उपयोग GFP मार्कर व्यक्त भ्रूण का मंचन किया और करीब एक और (चित्रा 1 ए) के बाद एक पंक्ति में अगर टुकड़ा के किनारे करने के लिए प्रत्येक भ्रूण जगह. भ्रूण केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में glia द्वारा इमेजिंग phagocytosis के लिए अपने उदर पक्ष के साथ रखा जाना चाहिए.
- एक पंक्ति में लगभग 10 भ्रूण स्थापित करें.
- हेपटैन गोंद की एक स्ट्रिप (चित्रा 1 बी, सी के साथ बीच में लेपित coverslip करने के लिए भ्रूण अटैच
- लगभग 5 मिनट (इस कमरे की नमी और इंजेक्शन की मात्रा पर निर्भर करता है) के लिए निर्जलीकरण कक्ष में coverslip रखें.
- ऊपर सूखने के बाद आगे निर्जलीकरण से बचने के लिए हेलोकार्बन तेल 700 (सिग्मा) के साथ भ्रूण को कवर किया.
- ऊपर का सामना करना पड़ भ्रूण के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड पर coverslip जगह. आप coverslip के आगे बढ़ रोकने के लिए स्लाइड पर पानी की एक बूंद डाल सकता है. भ्रूण अब इंजेक्शन के लिए तैयार हैं. इंजेक्शन स्थान भ्रूण के बीच में पार्श्व पक्ष पर आम तौर पर है.
3. भ्रूण इंजेक्शन
- Micromanipulator के लिए सुई संलग्न.
- सुई टिप देखने के क्षेत्र में coverslip के किनारे डाल दिया है और एक ही फोकल हवाई जहाज़ को सुई समायोजित तोड़ने के लिए. यह सुई टिप मारता है और यह टूट जाता है जब तक बहुत ध्यान से coverslip के लिए कदम.
- भ्रूण पर केंद्रित है, तेल में सुई जगह है और आप सुई से एक तरल बूंद मिल सुनिश्चित करें. यह सुई टिप कर दिया गया है इसका मतलबअच्छी तरह से टूट गया.
- छू बिना सुई धारक सुई में भ्रूण चाल और भ्रूण में एक बूंद इंजेक्षन. दूर भ्रूण ले जाएँ और सभी भ्रूण इंजेक्ट कर रहे हैं जब तक अगले एक के लिए आगे बढ़ें.
4. इमेजिंग
एक 40X या 100X उद्देश्य के साथ एक औंधा confocal खुर्दबीन पर हम छवि भ्रूण. हम मजबूत GFP अभिव्यक्ति और इंजेक्शन के बाद apoptotic कोशिकाओं का एक अच्छा लेबलिंग से पता चलता है, जो बीच में सीएनएस के साथ एक अच्छी तरह से तैनात भ्रूण के लिए लग रही है.
जीवित भ्रूण का समय व्यतीत हो जाने के रिकॉर्डिंग के लिए हम आमतौर पर 5 या 6 कोंफोकल स्लाइस (मोटी 2 माइक्रोन प्रत्येक) का चयन करें. बाद में, हम पूरे कक्षों का निरीक्षण करने के क्रम में 3 स्लाइस (6 माइक्रोन मोटाई) के एक प्रक्षेपण बनाने.
हम स्थिर रहे हैं और आसानी से ब्लीच जो नहीं apoptotic कोशिकाओं के लिए मार्कर का उपयोग करें. हम 60 सेकंड के अंतराल में रिकॉर्डिंग कर विरंजन GFP से बचने के लिए.
कुछ मामलों में भ्रूण रोलिंग शुरू कर सकते हैंवीडियो रिकॉर्डिंग के समय के दौरान. इसलिए, हम बंद करो और यदि आवश्यक हो तो अधिक शुरू करने के क्रम में रिकॉर्डिंग में एक समय में एक बार एक बार देख ले.
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Representative Results
Apoptotic कोशिकाओं Annexin वी के साथ चिह्नित कर रहे हैं, और glia, बाह्य त्वक स्तर और मैक्रोफेज मोबाइल-cytGFP साथ चिह्नित कर रहे हैं, जिसमें से एक फिल्म प्रतिनिधि फ्रेम चित्रा 2 में दिखाया गया है. प्रत्येक फ्रेम 3 स्लाइस 2 माइक्रोन प्रत्येक के एक प्रक्षेपण है.
चरण 15 से भ्रूण को ठीक से अच्छी तरह से लेबल glia (छ) के साथ बीच में भ्रूण सीएनएस दिखा तैनात है. सीएनएस के बाहर ज्यादातर रहे हैं जो मैक्रोफेज (एम), मजबूत साइटोप्लाज्मिक GFP अभिव्यक्ति दिखा. बहिर्जनस्तरीय कोशिकाओं को भी साइटोप्लाज्मिक GFP (ई) के साथ चिह्नित कर रहे हैं. कई Annexin वी पॉजिटिव कोशिकाओं सीएनएस के अंदर और बाहर देखा जाता है. घिराव घटना का पालन करने के लिए आसान नहीं है. हम एक glial सेल एक apoptotic कण छा जाता है जहां एक सफेद आयत के साथ एक घटना पर प्रकाश डाला. Glial सेल की जांच कर व्यवहार नोट: यह छा बिना apoptotic कण एक बार कुछ छू और फिर Annexin वी के घिराव के साथ समाप्त apoptotic सेल (चित्रा 2 लेबल
अलग apoptotic चरणों के लिए अतिरिक्त मार्कर एक ही प्रक्रिया के साथ प्रयोग किया जा सकता है.
चित्रा 1. Microinjections के लिए भ्रूण तैयार करने की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. ए भ्रूण dechorionation के बाद स्थानांतरित कर रहे हैं जिस पर अगर एक टुकड़ा युक्त एक सूक्ष्म स्लाइड. 20 के बारे में भ्रूण इमेजिंग सीएनएस के लिए, उनके उदर पक्ष के साथ घनिष्ठ, अगर टुकड़ा के किनारे करने के लिए, लाइन में रखा जाता है. बी बीच में हेपटैन गोंद की एक पट्टी से युक्त एक coverslip. सी. भ्रूण के साथ बी से coverslip हेपटैन गोंद पट्टी से जुड़ी है.
चित्रा 2. Apoptotic सेल निकासी की गतिशील विश्लेषण. समय चूक रिकॉर्डिंगएक चरण 15 भ्रूण में apoptotic सेल निकासी की है. Glia (छ), मैक्रोफेज (एम) और बाहरी झिल्ली (ई) मोबाइल-cytGFP (हरा) के साथ लेबल रहे हैं. Apoptotic कोशिकाओं फ्लोरोसेंट Annexin वी (लाल) के साथ चिह्नित हैं. एक प्रतिनिधि फिल्म से ए चयनित फ्रेम दिखाए जाते हैं. एक apoptotic सेल छा एक glial सेल एक आयत से दर्शाया गया है. बी चिह्नित आयत के विचारों को बंद करें.
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Discussion
Apoptotic सेल निकासी अत्यधिक गतिशील है जो apoptosis, का एक महत्वपूर्ण अंतिम चरण में है. इसलिए प्रक्रिया की वास्तविक समय पढ़ाई अत्यंत महत्व के हैं. यहाँ हम विकासशील भ्रूण ड्रोसोफिला रहने में apoptotic सेल निकासी की निगरानी में सक्षम बनाता है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन है. Apoptotic कोशिकाओं और फ़ैगोसाइट: इस प्रक्रिया में, कोशिकाओं की दो आबादी विशिष्ट मार्कर का उपयोग कर के रूप में चिह्नित किया जाना चाहिए. मोबाइल-cytGFP संवाददाता एक ही भ्रूण में एक साथ phagocytic मैक्रोफेज, glia और बाह्य त्वक स्तर की निगरानी के लिए उपयुक्त है, डब्ल्यू hich यह संभव एक ही समय में अलग phagocytic सेल आबादी का पालन करने के लिए बनाता है. इस तरह के दर, विशिष्टता और गिरावट की क्षमता के रूप में इस प्रक्रिया के विशिष्ट पहलुओं की तुलना, समवर्ती 'पेशेवर' और 'गैर पेशेवर' मंजूरी के अध्ययन के लिए एक बड़ा लाभ है. इस दृष्टिकोण का एक नुकसान यह मोबाइल-cytGFP मार्कर मैक्रोफेज में बहुत दृढ़ता से व्यक्त किया है और में काफी कमजोर रहा हैएक ही फिल्म में समायोजित करने के लिए मुश्किल हो सकता है जो glia,. हालांकि, एक विशिष्ट Gal4s (मैक्रोफेज और glia के लिए रेपो-Gal4 लिए crq-Gal4) के साथ GFP अभिव्यक्ति ड्राइविंग द्वारा सीएनएस में इस प्रक्रिया से अलग मैक्रोफेज द्वारा छवि apoptotic सेल निकासी कर सकते हैं.
विशिष्ट आणविक और morphological परिवर्तन को दर्शाती apoptotic कोशिकाओं के लिए विभिन्न मार्करों apoptosis और सेल निकासी की गतिशीलता और उलटने को समझने के लिए महान मूल्य के हैं. इसके अलावा, इन मार्कर का उपयोग apoptotic सेल निकासी की वास्तविक समय रिकॉर्डिंग तय भ्रूण में पारंपरिक immunohistochemistry के तकनीकों का उपयोग करके हासिल नहीं किया जा सकता है जो उत्परिवर्ती phenotypes, के बारे में अतिरिक्त जानकारी जोड़ें.
वर्णित प्रोटोकॉल का सबसे कठिन कदम, जब इमेजिंग के विकास सीएनएस, इंजेक्शन से पहले भ्रूण के अत्यंत सटीक स्थिति है. तैयार की कुर्की के दौरान coverslip के यहां तक कि एक मामूली कदमगोंद के लिए भ्रूण इमेजिंग सीएनएस के लिए उचित नहीं होगा जो अपनी स्थिति को बदल सकता है. कदम संलग्न भ्रूण अधिकतम ध्यान के साथ किया जाना चाहिए.
Apoptosis और phagocytosis में विशिष्ट चरणों के लिए अतिरिक्त मार्कर का विकास बेहतर विच्छेदन और apoptotic सेल निकासी के संभावित हेरफेर के लिए अत्यंत आवश्यक होगा. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल भविष्य के विकास के लिए एक अच्छा आधार के रूप में कार्य करता है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
यह काम एक मैरी क्यूरी Reintegration अनुदान (IRG249084) द्वारा समर्थित किया गया था. हम Kurant प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
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- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
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