Summary
Qui si descrive un metodo efficace per lo studio delle dinamiche di gioco cellulare per apoptosi
Abstract
La corretta eliminazione delle cellule indesiderate o aberrante attraverso l'apoptosi e la successiva fagocitosi (clearance cellulare per apoptosi) è cruciale per lo sviluppo normale in tutti gli organismi metazoi. Gioco cellulare per apoptosi è un processo altamente dinamico intimamente associato con la morte delle cellule, le cellule apoptotiche unengulfed sono a malapena visibili in vivo in condizioni normali. Al fine di comprendere le diverse fasi del gioco cellulare per apoptosi e per confrontare fagociti 'professionali' - macrofagi e cellule dendritiche a 'non professionale' - le cellule vicine tessuto residenti, imaging in vivo vivo del processo è estremamente utile. Qui si descrive un protocollo per lo studio di liquidazione cellulare per apoptosi in vivo embrioni di Drosophila. Per seguire le dinamiche delle diverse fasi della fagocitosi che utilizziamo marcatori specifici per le cellule apoptotiche e fagociti. Inoltre, siamo in grado di monitorare i due sistemi fagocita in parallelo: macrofagi 'professionali' e 'semi-profeglia ssional 'nel sistema nervoso centrale di sviluppo (SNC). Il metodo descritto qui impiega l'embrione di Drosophila come un ottimo modello per studi in tempo reale di gioco cellulare per apoptosi.
Introduction
La corretta eliminazione delle cellule indesiderate o aberranti attraverso apoptosi e successiva fagocitosi è cruciale per lo sviluppo embrionale e per omeostasi tissutale nell'adulto. Fagocitosi delle cellule apoptotiche o di liquidazione per apoptosi è un processo altamente dinamico che si svolge in quattro fasi: (1) il reclutamento dei fagociti al cellulare per apoptosi ('find-me'), (2) il riconoscimento della cellula come un obiettivo per fagocitosi ( 'mangia-me') e (3) engulfment, seguito da (4) maturazione phagosome e la degradazione della particella apoptotico 1-5. Ci sono due tipi di fagociti: macrofagi 'professionali' e le cellule dendritiche immature e la 'non professionale' cellule vicine tessuto residenti, che sono cruciali per la liquidazione cellulare per apoptosi durante lo sviluppo dei metazoi 6,7.
Sviluppo in Drosophila, l'eliminazione delle cellule superflue attraverso apoptosi si verifica in tre mfasi Ain, prima nella metà alla fine embrione, poi a metà pupa, e di nuovo nei primi anni adulto. Durante l'embriogenesi particelle apoptotici vengono rimosse dai fagociti 'professionali', macrofagi e da ectoderma il 'non professionale' e glia 8,9.
Nel nostro precedente lavoro abbiamo identificato un recettore dei fagociti, Six-micron-under (SIMU), che si esprime esclusivamente in fagociti durante l'embriogenesi. Utilizzando il promotore simulazione abbiamo generato un marcatore specifico per le popolazioni di cellule fagocitarie (simu-cytGFP) che ci permette di monitorare i macrofagi, ectoderma e glia contemporaneamente in un live embrione in via di sviluppo 8. Inoltre, utilizzando marcatori specifici per le cellule in apoptosi in diversi stadi di apoptosi, siamo in grado di seguire le dinamiche di gioco cellulare per apoptosi in vivo.
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Protocol
Per seguire le dinamiche di gioco cellulare per apoptosi in vivo due popolazioni di cellule devono essere etichettati: fagociti e cellule apoptotiche.
Per contrassegnare le popolazioni di cellule fagocitarie che usiamo una linea Drosophila contenente il marcatore simulare cytGFP, che le etichette esclusivamente le cellule fagocitarie nell'embrione: macrofagi, cellule gliali e ectoderma 8. Si possono utilizzare diversi marcatori per i fagociti, comprese le linee che contengono un driver Gal4 hemocyte specifici (CRQ-Gal4) o glia-specifica Gal4 conducente (repo-Gal4) e un reporter fluorescente geneticamente codificato sotto controllo UAS (UAS-GFP).
Per monitorare le cellule apoptotiche durante liquidazione cellulare per apoptosi usiamo diversi apoptosi / marcatori fagocitosi. Annessina V (Molecular Probes) serve come marker precoce di cellule apoptotiche 10; Phiphilux (OncoImmunin) è un fluorogenico caspasi-3 substrato, che è utilizzato come un secondo apoptosis marcatore, e LysoTracker (Molecular Probes) funziona come un marcatore phagosome. Si inietta questi reagenti che utilizzano il sistema di microiniezione PicoPump PV 820.
1. Preparativi
- Colla eptano:
Srotolare il nastro biadesivo e mettere il più possibile in una fiala di scintillazione, riempire con eptano, chiude la fiala con parafilm, e rock per 24 ore. Aggiungi eptano se la colla è troppo spessa. - Permettiamo le mosche a deporre su un succo d'uva agar piastra preriscaldata + lievito di pasta per 2 ore, e poi trasferire la piastra a 25 ° C per 10-12 ore (a seconda del livello a scelta) prima di microiniezione e l'ora delle registrazioni lapse di embrioni iniettati. Raccogliamo embrioni da piastre di agar mantenuta a 25 ° C, fornendo così da embrioni stadio 15 o 16 di sviluppo.
- Preparazione Needle:
Per preparare gli aghi per l'iniezione, si usa un 'strumento Sutter' ago di estrattore e sottili filamenti di vetro a pareti (tubo capillare FHC). La punta del capillare in pool è rotton per un diametro di 0,5-2 micron. - Coverslip con colla:
Usando una pipetta disperdere una goccia di colla eptano in una linea nel mezzo del vetrino. Lasciare asciugare per alcuni secondi. Preparare un paio di queste lamelle.
2. Embrione Preparazione
- Raccogliere gli embrioni da piastre di agar e trasferirli in un colino cellula (SPL Life Sciences) utilizzando un pennello pulito e acqua corrente. Il filtro è rinviato un becher di raccolta delle acque reflue.
- Lavare embrioni nel setaccio cella utilizzando acqua finché tutto il lievito in pasta viene rimosso.
- Asciugare l'acqua in eccesso pulendo la parte esterna del filtro utilizzando Kimwipes.
- Posizionare il filtro cella in una scatola di Petri pulita e aggiungere abbastanza il 50% di candeggina per coprire embrioni nel colino cellula. Dechorionate gli embrioni per 2 min occasionalmente (2-3 volte) mescolando.
- Risciacquare con acqua molto fino a quando gli embrioni sciolto l'odore di candeggina.
- Posizionare il filtro cella in un ambiente pulitoCapsula di Petri e coprire gli embrioni con acqua per evitare prosciugamento.
- Prima di iniziare l'impostazione embrioni, caricare 1 ml di reagente desiderato in due aghi (a volte un ago può essere intasato). Ci vogliono circa 5 min per il liquido di raggiungere la punta dell'ago.
- Tagliare un pezzo rettangolare di succo d'uva agar e metterlo su un vetrino da microscopio. Trasferire embrioni dechorionated dalla piastra di Petri al pezzo agar utilizzando un pennello pulito.
- Sotto un microscopio a fluorescenza dissezione seleziona adeguatamente allestita embrioni che esprimono il marcatore GFP usando un pennello bagnato e posizionare ogni embrione vicino al bordo del pezzo agar in fila uno dopo l'altro (Figura 1A). Gli embrioni devono essere posizionati con il loro lato ventrale per fagocitosi imaging glia nel Sistema Nervoso Centrale (SNC).
- Istituito circa 10 embrioni in una riga.
- Fissare gli embrioni di un coprioggetto rivestito in mezzo con una striscia di colla eptano (Figura 1B, C
- Porre il vetrino nella camera di disidratazione per circa 5 minuti (questo dipende dalla umidità della stanza e la quantità da iniettare).
- Dopo l'essiccazione fino coprire gli embrioni con olio halocarbon 700 (Sigma) per evitare ulteriore disidratazione.
- Porre il vetrino su un vetrino da microscopio con gli embrioni rivolti verso l'alto. Si può mettere una goccia d'acqua sul vetrino per impedire lo spostamento del vetrino. Gli embrioni sono ora pronti per l'iniezione. Ubicazione iniezione è tipicamente sulla parte laterale nel mezzo dell'embrione.
3. Embrione di iniezione
- Applicare l'ago di un micromanipolatore.
- Per rompere la punta dell'ago poggiare il bordo del vetrino nel campo di vista e regolare l'ago stesso piano focale. Molto spostare con attenzione il vetrino fino a raggiungere la punta dell'ago e la rompe.
- Concentrandosi sugli embrioni, inserire l'ago nel petrolio e assicuratevi di avere una goccia di liquido dall'ago. Significa che l'ago è statorotto bene.
- Senza toccare il supporto dell'ago spostare l'embrione in l'ago e iniettare una goccia nel embrione. Spostare l'embrione via e procedere al successivo fino a che tutti gli embrioni vengono iniettati.
4. Imaging
Noi immagine gli embrioni su un microscopio invertito confocale con un obiettivo 40X o 100X. Cerchiamo un embrione ben posizionato con il sistema nervoso centrale in mezzo, che mostra una forte espressione GFP e una buona etichettatura delle cellule apoptotiche dopo l'iniezione.
Per le registrazioni in tempo lasso di embrioni vivi scegliamo solitamente 5 o 6 fette confocale (2 micron di spessore ciascuno). Successivamente, facciamo una proiezione di 3 fette (spessore 6 micron) per osservare cellule intere.
Usiamo marker per le cellule apoptotiche che sono stabili e non candeggiare facilmente. Per evitare di GFP sbiancamento facciamo le registrazioni ad intervalli di 60 sec.
In alcuni casi gli embrioni possono iniziare a rotazionedurante il tempo di registrazione video. Quindi, diamo uno sguardo di tanto in tanto alla registrazione al fine di fermare e ricominciare, se necessario.
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Representative Results
Fotogrammi rappresentativi di un film in cui le cellule apoptotiche sono marcate con annessina V, e glia, ectoderma e macrofagi sono etichettati con simu-cytGFP sono illustrati nella Figura 2. Ogni frame è una proiezione di 3 fette 2 micron ciascuna.
L'embrione di scena 15 è posizionato correttamente mostrando il SNC embrionali in mezzo con glia ben marcato (g). I macrofagi (m), che sono per lo più al di fuori del sistema nervoso centrale, mostrano una forte espressione GFP citoplasmatica. Cellule ectodermica sono anche etichettati con GFP citoplasmatica (e). Molti V cellule positive annessina sono viste all'interno e all'esterno del sistema nervoso centrale. Per seguire l'evento engulfment non è facile. Abbiamo evidenziato un evento con un rettangolo bianco in cui una cellula gliale sta inghiottendo una particella apoptotico. Si noti il comportamento sondaggio della cellula gliale: toccando la particella apoptotico un paio di volte senza inghiotte e poi finire con fagocitazione della annessina V etichettati cellulare per apoptosi (figura 2
Marcatori aggiuntivi per diverse fasi apoptotiche potrebbero essere utilizzati con la stessa procedura.
Figura 1. Rappresentazione schematica della preparazione embrione per microiniezioni. A. Una diapositiva microscopica che contiene un pezzo di agar su cui gli embrioni vengono trasferiti dopo dechorionation. Circa 20 embrioni sono posti in linea, in prossimità del bordo del pezzo agar, con il loro lato ventrale, per l'imaging del SNC. B. Un vetrino contenente una striscia di colla eptano nel mezzo. C. La coprioggetto da B con embrioni attaccata alla striscia di colla eptano.
Figura 2. Analisi dinamica della clearance cellulare per apoptosi. Registrazione Time-lapses della clearance cellulare per apoptosi in una fase embrionale 15. Glia (g), i macrofagi (M) ed ectoderma (e) sono etichettati con simu-cytGFP (verde). Le cellule apoptotiche sono contrassegnati con il fluorescente annessina V (rosso). A. fotogrammi selezionati da un filmato rappresentativo sono mostrati. Una cellula gliale inghiottendo un cellulare per apoptosi è rappresentato da un rettangolo. B. Primo piano vista la marcata rettangolo.
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Discussion
Gioco cellulare per apoptosi è un ultima fase critica di apoptosi, che è altamente dinamico. Pertanto studi in tempo reale del processo sono di massima importanza. Qui si descrive un protocollo che consente il monitoraggio della clearance cellulare per apoptosi nello sviluppo di embrioni di Drosophila vivere. In questa procedura, due popolazioni di cellule devono essere marcati usando specifici marcatori: cellule apoptotiche e fagociti. Il giornalista simulare cytGFP è adatto per il monitoraggio dei macrofagi fagociti, glia ed ectoderma simultaneamente nello stesso embrione, w hich permette di seguire differenti popolazioni di cellule fagocitarie allo stesso tempo. Questo è un grande vantaggio per lo studio 'professionale' e 'non professionale' gioco contemporaneamente, confrontare aspetti specifici del processo come la frequenza, la specificità e la capacità di degradazione. Uno svantaggio di questo approccio è che simulare cytGFP indicatore è espresso molto forte nei macrofagi e molto più debole inglia, che potrebbe essere difficile per regolare nello stesso film. Tuttavia, si può immagine apoptotica gioco cellulare da parte dei macrofagi separatamente da questo processo nel sistema nervoso centrale, guidando l'espressione della GFP con Gal4s specifici (CRQ-Gal4 per i macrofagi e pronti contro termine Gal4 per glia).
Diversi marcatori per cellule apoptotiche che riflettono alterazioni molecolari e morfologiche specifiche sono di grande valore per la comprensione delle dinamiche e la reversibilità di apoptosi e la clearance delle cellule. Inoltre, le registrazioni in tempo reale di gioco per apoptosi utilizzando questi marcatori aggiungono ulteriori informazioni su fenotipi mutanti, che non potrebbero essere ottenuti utilizzando tecniche di immunoistochimica convenzionali in embrioni fissi.
Il più difficile passo del protocollo descritto, quando il SNC di imaging di sviluppo, è il posizionamento estremamente preciso degli embrioni prima dell'iniezione. Anche un leggero spostamento del vetrino durante fissaggio del preparatoembrioni nella colla potrebbero cambiare la loro posizione, che non sarebbe appropriato per l'imaging del SNC. L'embrione allegando passo dovrebbe essere fatto con la massima attenzione.
Sviluppo di marcatori aggiuntivi per specifiche fasi in apoptosi e fagocitosi sarebbe estremamente auspicabile per più fine dissezione e possibili manipolazioni della clearance cellulare per apoptosi. Il protocollo qui presentato costituisce una buona base per lo sviluppo futuro.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa Marie Curie di reinserimento Grant (IRG249084). Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Kurant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
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- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
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