Summary
여기에서 우리는 사멸 세포 간극의 역학을 공부하는 효과적인 방법을 설명
Abstract
세포 사멸 및 후속 식균 작용을 통해 원치 않는 또는 비정상적인 세포의 적절한 제거는 (사멸 세포 간극) 모든 후생 생물의 정상적인 발달을 위해 중요합니다. 사멸 세포 간극은 밀접하게 세포의 죽음과 관련된 매우 역동적 인 과정이다 unengulfed 사멸 세포는 거의 정상적인 조건 하에서 생체 내에서 볼 수 있습니다. 사멸 세포 간극의 여러 단계를 이해하고 '전문'식세포와 비교하기 위해 -에 대 식세포와 수지상 세포를 '비 전문'- 조직 상주 이웃 세포 프로세스의 생체 라이브 이미징은 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 라이브 Drosophila의 배아에서 세포 사멸 세포 간극 공부를위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 사멸 세포와 대 식세포에 대한 특정 마커를 사용 식균 작용에서 여러 단계의 역학을 따르십시오. 또한, 우리는 병렬로 두 개의 식세포 시스템을 모니터링 할 수 있습니다 : '전문'대 식세포와 '반 profe개발 중추 신경계 ssional '아교 (CNS). 여기에 설명 된 방법은 사멸 세포 간극의 실시간 연구를위한 훌륭한 모델로 Drosophila의 배아를 사용합니다.
Introduction
세포 사멸 및 후속 식균 작용을 통해 원치 않는 또는 비정상적인 세포의 적절한 제거는 배아 발달뿐만 아니라 성인에서 조직의 항상성을 위해 중요합니다. 사멸 세포 또는 사멸 세포 간극의 식균 작용은 네 단계로 진행 매우 역동적 인 과정이다 : 사멸 세포에 대한 식세포 (1) 모집 ( '찾기 - 나'), 식균 작용의 대상으로 셀 (2) 인식 ( '- 저를 먹고')와 (3) engulfment, 세포 사멸 입자 1-5 (4) phagosome에 성숙과 분해에 의해 따랐다. '전문'대식 세포와 미성숙 수지상 세포, 그리고 '비 직업적인'조직 상주 이웃 세포 후생 개발 6,7시 사멸 세포 통관을 위해 매우 중요하다 할 : 식세포의 두 가지 유형이 있습니다.
초파리 개발, 세포 사멸을 통해 불필요한 세포의 제거는 삼m에서 발생늦게 배아 중반 처음으로, 그 중간 번데기, 그리고 다시 성인 초기의 아인 단계. 배아 동안 세포 사멸 입자는 '전문'식세포, 대 식세포, 그리고 '비 직업적인'외배엽과 glia의 8,9에 의해 제거된다.
우리의 이전 연구에서 우리는 배아 동안 포식 세포에서 독점적으로 표현되는 식세포 수용체의 6 미크론 언더을 (SIMU) 발견했습니다. 모사 프로모터를 사용하여 우리는 우리가 살아있는 배아 8에서 동시에 대 식세포, 외배엽과 아교를 모니터링 할 수 탐식 세포 집단 (시뮬레이션 할 cytGFP)에 대한 특정 마커를 생성합니다. 또한, 세포 사멸의 여러 단계에서 사멸 세포에 대한 특정 마커를 사용하여, 우리는 생체 내에서 사멸 세포 간극의 역학을 따라 할 수 있습니다.
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Protocol
포식 세포 사멸 세포 : 세포의 두 집단을 표시해야합니다 생체 내에서 사멸 세포 간극의 역학을 따르십시오.
대식 세포, 아교 세포 및 외배엽 8 : 우리가 시뮬레이션 할 cytGFP의 배아에서 독점적 식세포 레이블을 마커를 포함하는 초파리 줄을 사용 탐식 세포 인구를 표시합니다. 하나는 혈구 특정 GAL4 드라이버 (CRQ-GAL4)를 포함하는 선 또는 glia의 특정 GAL4 드라이버 (REPO-GAL4)와 UAS 제어 (UAS - GFP)에 따라 유전자 인코딩 형광 리포터 등 식세포에 대해 서로 다른 마커를 사용할 수 있습니다.
사멸 세포 통관시 사멸 세포를 모니터링하려면 우리는 다른 세포 사멸 / 식균 작용 마커를 사용합니다. 아 넥신 V (분자 프로브) 10 사멸 세포에 대한 초기 마커 역할, Phiphilux (OncoImmunin)는 나중에 apopto로 사용되는 형광 카스파 제 3 기판이며,SIS 마커 및 LysoTracker (분자 프로브) phagosome에 마커로 작동합니다. 우리는 microinjection의 시스템 PicoPump PV 820를 사용하여 이러한 시약을 주입.
1. 준비
- 헵탄 접착제 :
양면 테이프를 펴고 당신이 섬광 유리 병에 24 시간 동안 파라 필름과 유리 병, 그리고 바위를 밀봉 헵탄으로 채울 수만큼 넣어. 접착제가 너무 두꺼운 경우 헵탄 추가 할 수 있습니다. - 우리는 파리가 미리 예열 포도 주스 한천 플레이트 + 효모 2 시간 동안 풀에 누워 수 있도록하고 25 접시를 전송 ° C ~ 12 시간 (원하는 단계에 따라 달라집니다)에 대한 이전의 미세 주입 및 시간 경과 기록에 주입 배아의. 따라서 우리는 단계 15 개발 16에서 배아를 제공, 25 ° C로 유지 한천 플레이트에서 배아를 수집합니다.
- 바늘 준비 :
주사 바늘을 준비하기 위해, 우리는 '셔터 악기'바늘 풀러 얇은 벽으로 둘러싸인 유리 필라멘트 (FHC 모세관 튜브)를 사용합니다. 풀링 된 모세관의 끝은 파산0.5-2 ㎛의 직경 N. - 접착제 coverslip을 :
피펫 팁을 사용하여 coverslip에 중간에 한 줄의 헵탄 접착제 한 방울을 분산. 그것은 몇 초 동안 건조하자. 이 coverslips는 몇 가지를 준비합니다.
2. 배아 준비
- 한천 플레이트에서 배아를 수집하고 깨끗한 페인트 브러시와 흐르는 물을 사용하여 셀 스트레이너 (SPL 생명 과학)로 전송. 여과기는 폐수를 수집하는 비커에 개최됩니다.
- 모든 효모 붙여 넣기가 제거 될 때까지 물을 사용하여 셀 스트레이너의 배아를 씻으십시오.
- 킴 와이프를 사용하여 여과기의 외부를 닦아 과잉의 물을 말린다.
- 깨끗한 페트리 접시의 셀 스트레이너를 놓고 셀 스트레이너의 배아를 커버하기에 충분한 50 %의 표백제를 추가합니다. 가끔 2 분 (2-3 회)을 교반 배아를 Dechorionate.
- 배아 표백제 냄새 느슨한까지 광범위하게 물로 씻어.
- 청소에 셀 스트레이너를 배치페트리는 최대 건조를 방지하기 위해 물을 배아를 접시 커버.
- 배아 설정을 시작하기 전에, 두 바늘 (때로는 바늘이 막힌 할 수 있습니다)에 필요한 시약 1 μL를로드합니다. 그것은 바늘의 끝을 도달하는 액체 약 5 분 소요됩니다.
- 포도 주스 한천의 사각형 조각을 잘라 현미경 슬라이드에 배치합니다. 페트리 접시에서 깨끗한 페인트 브러쉬를 사용하여 한천 조각에 dechorionated 배아를 전송합니다.
- 형광 해부 현미경으로 제대로 선택 젖은 페인트 브러시를 사용하여 GFP 마커를 표현 배아를 개최하고 닫기를 다른 (그림 1A)의 행 하나 한천 조각의 가장자리에 각 배아를 놓습니다. 배아는 중추 신경계 (CNS)에 아교로 영상 식균 작용에 대한 자신의 복부 측면과 함께 배치해야합니다.
- 한 행에 10 배아를 설정합니다.
- 헵탄 접착제 스트립 (그림 1B, C와 중간에 코팅 coverslip에로 배아를 연결
- 약 5 분 (이 공간의 습도와 주입되는 양에 따라 다름)의 탈수 챔버에 coverslip을 배치합니다.
- 최대 건조 후 더 탈수를 방지하기 위해 할로 카본 오일 700 (시그마)와 배아를 커버한다.
- 위로 향하게 배아 현미경 슬라이드에 coverslip을 배치합니다. 당신은 coverslip에의 이동 방지하기 위해 슬라이드에 물 한 방울을 넣을 수 있습니다. 배아는 이제 주사에 대 한 준비입니다. 주입 위치는 배아의 중간 측면 사이드에 일반적으로있다.
3. 배아 주입
- micromanipulator에 바늘을 연결합니다.
- 바늘 끝이 시야에 커버 슬립의 가장자리를 넣고 같은 초점면에 바늘을 조정 중단합니다. 그것은 바늘 끝을 명중하고 중단 할 때까지 매우 신중하게 coverslip을 이동합니다.
- 배아에 초점을 맞추고, 기름에 바늘을 배치하고 바늘에서 액체 방울을 확인하십시오. 그것은 바늘 끝이 된 것을 의미잘 부러.
- 건드리지 않고 바늘 홀더 바늘로 배아를 이동하고 배아에 방울을 주입. 멀리 배아를 이동하고 모든 배아가 주입 될 때까지 다음 단계로 진행합니다.
4. 영상
40X 나 100X 목적으로 거꾸로 공 촛점 현미경에 우리는 이미지 배아를. 우리는 강한 GFP 발현과 주입 후 세포 사멸 세포의 좋은 표시를 보여줍니다 중간에있는 CNS와 잘 배치 배아를 찾습니다.
살아있는 배아의 시간 경과 기록을 위해 우리는 일반적으로 5, 6 공 촛점 조각 (두께 2 μm의 각)을 선택합니다. 그 후, 우리는 전체 세포를 관찰하기 위해 3 조각 (6 μm의 두께)의 투영을합니다.
우리는 안정적이며 쉽게 표백하지 사멸 세포에 대한 마커를 사용합니다. 우리는 60 초 간격으로 기록을 표백 GFP를 방지합니다.
어떤 경우에는 배아 롤링 시작할 수 있습니다비디오 녹화의 시간 동안. 그러므로, 우리는 중지하고 필요한 경우 다시 시작하기 위해 녹음에서 가끔보세요.
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Representative Results
사멸 세포 넥신 V로 표시되며, 아교, 외배엽 및 대 식세포를 시뮬레이션 할 cytGFP으로 표시되는 동영상에서 대표 프레임은 그림 2에 표시됩니다. 각 프레임은 3 조각 2 μm의 각의 투영이다.
단계 15 배아가 제대로 잘 표시 아교 (G)와 함께 중간에 배아 CNS를 보여주는 배치됩니다. CNS 밖에 대부분이다 식세포 (남성), 강한 세포질 GFP 발현을 보여줍니다. 외배엽 세포는 세포질 GFP (E)로 표시되어 있습니다. 많은 넥신 V 양성 세포는 중추 신경계 내부와 외부에서 볼 수 있습니다. engulfment 이벤트를 따라하는 것은 쉬운 일이 아닙니다. 우리는 아교 세포 사멸 입자를 침몰되는 흰색 사각형 하나의 이벤트를 강조했다. 아교 세포의 프로빙 문제 참고 :이 침몰하지 않고 세포 사멸 입자를 몇 번 터치하고 다음 넥신 V의 engulfment과 결말은 사멸 세포 (그림 2 표시
다른 세포 사멸 단계에 대한 추가 마커가 동일한 절차를 사용할 수 있습니다.
그림 1. microinjections에 대한 배아 준비의 개략도. A. 배아 dechorionation 후 전송되는 한천 조각을 포함하는 현미경 슬라이드. 20 배아는 영상 CNS를 위해를 자신의 복부 측면과 함께, 가까운 한천 조각의 가장자리에, 선에 배치됩니다. B.는 중간에 헵탄 접착제의 스트립을 포함 coverslip을. C.는 배아와 B에서 coverslip을 헵탄 접착제 스트립에 연결합니다.
그림 2. 사멸 세포 간극의 동적 해석. 시간 경과 기록단계 15 배아에서 세포 사멸 세포 간극의의. 아교 (G), 대 식세포 (m)와 외배엽은 (E) 시뮬레이션 할 cytGFP (녹색)으로 표시되어 있습니다. 사멸 세포는 형광 넥신 V (빨간색)으로 표시됩니다. 대표적인 영화에서 A. 선택한 프레임이 표시됩니다. 사멸 세포를 침몰 아교 세포는 사각형으로 그려져있다. B.가 표시된 사각형의 뷰를 닫습니다.
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Discussion
사멸 세포 간극은 매우 동적이며 세포 사멸의 중요한 마지막 단계입니다. 따라서 프로세스의 실시간 연구는 매우 중요합니다. 여기에 우리가 개발 Drosophila의 배아 집에서 사멸 세포 간극의 모니터링을 가능하게하는 프로토콜을 설명합니다. 사멸 세포 탐식이 절차에서는 세포의 두 집단은 특정 마커를 사용하여 표시해야합니다. 시뮬 cytGFP 기자가 같은 배아에서 동시에 식세포 대 식세포, 아교 및 외배엽 모니터링을 위해 적당하다, w의 hich은 가능한 같은 시간에 다른 포식 세포 인구를 따라 할 수 있습니다. 이 같은 속도, 특이성 및 분해 기능 등 프로세스의 특정 측면을 비교, 동시에 '전문'과 '비 직업적인'정리 공부를위한 큰 장점이다. 이 방법의 단점은 시뮬레이션 할 cytGFP 마커가 대 식세포에 매우 강력하게 표현 훨씬 약한 것입니다같은 영화에서 조정하는 까다로운 일이 될 수 교세포. 그러나 한 특정 Gal4s (대 식세포와 아교 세포에 대한 REPO-GAL4에 대한 CRQ-GAL4)와 GFP 발현을 운전하여 CNS에서이 과정을 별도로 식세포에 의한 이미지 사멸 세포 간극은 할 수 있습니다.
특정 분자 형태 변경을 반영 사멸 세포에 대해 서로 다른 마커는 세포 사멸과 세포 간극의 역학과 가역성을 이해하기위한 훌륭한 가치입니다. 또한, 이러한 마커를 사용하여 사멸 세포 간극의 실시간 녹음 고정 배아에서 기존의 면역 기법을 사용하여 수행 할 수없는 돌연변이 표현형에 대한 추가 정보를 추가합니다.
설명 프로토콜의 가장 어려운 단계 이미징 개발 CNS는 주입하기 전에 배아의 매우 정확한 위치입니다. 준비를 부착하는 동안 coverslip에 심지어 약간의 움직임접착제 배아 영상 CNS를 위하여는 적절하지 않을 것이라고 자신의 위치를 변경할 수 있습니다. 단계를 부착 배아가 최대 관심으로 수행해야합니다.
세포 사멸 및 식균 작용의 특정 단계에 대한 추가 마커의 개발은 미세한 절개 및 사멸 세포 간극의 수 조작에 매우 바람직 할 것이다. 여기에 제시 프로토콜은 미래의 발전을위한 좋은 기초 역할을합니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 마리 퀴리 재 통합 그랜트 (IRG249084)에 의해 지원되었다. 우리는 Kurant 실험실의 모든 구성원을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
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