Summary
Her beskriver vi en effektiv metode for å studere dynamikken i apoptotiske cellen klaring
Abstract
Riktig eliminering av uønskede eller avvikende celler gjennom apoptose og påfølgende phagocytosis (apoptotiske celle clearance) er avgjørende for normal utvikling i alle metazoan organismer. Apoptotiske celle clearance er en svært dynamisk prosess nært forbundet med celledød; unengulfed apoptotiske celler er knapt sett in vivo under normale forhold. For å forstå de ulike trinnene i apoptotiske cellen klarering og sammenligne "profesjonell" fagocytter - makrofager og dendrittiske celler til "ikke-profesjonelle" - vev-resident nabocellene, in vivo levende avbildning av prosessen er meget verdifull. Her beskriver vi en protokoll for å studere apoptotiske celle klaring i levende Drosophila embryoer. Å følge dynamikken i forskjellige trinnene i fagocytose vi bruker spesifikke markører for apoptotiske celler og phagocytes. I tillegg kan vi overvåke to phagocyte systemer i parallell: "profesjonell" makrofager og "semi-professional 'gliaceller i den tredje sentrale nervesystemet (CNS). Metoden beskrevet her benytter Drosophila embryo som en utmerket modell for sanntids studier av apoptotisk celle klaring.
Introduction
Riktig eliminering av uønskede eller avvikende celler gjennom apoptose og påfølgende phagocytosis er avgjørende for embryonal utvikling så vel som for vev homeostase i voksen. Fagocytose av apoptotiske celler eller apoptotiske celle klaring er en svært dynamisk prosess som fortsetter i fire trinn: (1) rekruttering av fagocytter til apoptotiske cellen ('finne-meg "), (2) anerkjennelse av cellen som et mål for fagocytose ( 'spise-me') og (3) engulfment, etterfulgt av (4) phagosome modning og nedbrytningen av apoptotiske partikkel 1-5. Det finnes to typer av fagocytter: "profesjonell" makrofager og umodne dendrittiske celler, og "ikke-profesjonelle 'vev-resident nabocellene, som er avgjørende for apoptotiske celle klaring under metazoan utvikling 6,7.
I Drosophila utvikling, skjer eliminering av overflødige celler gjennom apoptose i tre main faser, først i midten til slutten av embryo, deretter i midten av puppe, og igjen i tidlig voksen. Under embryogenese apoptotic partiklene er fjernet av "profesjonell" fagocytter, makrofager, og av de "ikke-profesjonell" ectoderm og gliaceller 8,9.
I vårt tidligere arbeid har vi identifisert en fagocytisk reseptor, Six-mikron-under (SIMU), som uttrykkes utelukkende i fagocyttiske celler under embryogenese. Ved hjelp av simulatoren promoter vi generert en spesifikk markør for fagocyttiske celle populasjoner (simulere cytGFP) som gjør oss i stand til å overvåke makrofager, ectoderm og gliaceller samtidig i en live utvikling av embryo 8. I tillegg, ved hjelp av spesifikke markører for apoptotiske celler i ulike stadier av apoptose, er vi i stand til å følge dynamikken i apoptotiske cellen klaring in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Å følge dynamikken i apoptotiske cellen klaring in vivo to populasjoner av celler må merkes: fagocyttiske celler og apoptotiske celler.
For å markere fagocyttiske celle populasjoner vi bruker en Drosophila linje som inneholder simulere cytGFP markør, som betegner utelukkende fagocyttiske cellene i embryoet: makrofager, gliaceller og ectoderm åtte. Man kan bruke ulike markører for fagocyttiske celler, inkludert linjene som inneholder en hemocyte-spesifikk Gal4 driver (crq-Gal4) eller gliaceller-spesifikk Gal4 driver (repo-Gal4) og en genetisk kodet fluorescerende reporter i henhold UAS kontroll (UAS-GFP).
For å overvåke apoptotiske celler i løpet av apoptotiske celle klaring vi bruker forskjellige apoptose / fagocytose markører. Annexin V (Molecular Probes) tjener som en markør for tidlig apoptotiske celler 10; Phiphilux (OncoImmunin) er en Fluorogenic caspase-3-substrat, som anvendes som et senere apoptosis markør, og LysoTracker (Molecular prober) fungerer som en phagosome markør. Vi injisere disse reagenser ved hjelp av mikroinjeksjon system PicoPump PV 820.
En. Klargjøring
- Heptane lim:
Rull dobbeltsidig tape og sette så mye du kan i en scintillasjonsflaske, fyll med heptan, forsegle hetteglass med Parafilm og rock for 24 hr. Legg heptan hvis limet er for tykt. - Vi tillater fluene til å legge på en forvarmet drue juice agar plate + gjær lim for 2 timer, og deretter overføre plate til 25 ° C i 10-12 timer (avhengig av den ønskede scenen) før mikroinjeksjon og tid lapse opptak av injisert embryoer. Vi samler embryoer fra agarskålene holdt ved 25 ° C, og dermed gi embryoer fra trinn 15 eller 16 av utviklingen.
- Needle forberedelse:
For å forberede nåler for injeksjon, bruker vi en "Sutter instrument 'nål avtrekker og tynne vegger glassfilamenter (FHC kapillarrør). Tuppen av den sammenslåtte kapillær er blakkn til en diameter på 0,5-2 um. - Dekkglass med lim:
Ved hjelp av en pipettespiss dispergere en dråpe av den heptan limet i en linje i midten av dekkglasset. La det tørke i noen sekunder. Forbered noen av disse Dekkglass.
2. Embryo Forberedelse
- Samle embryoer fra agarplater og overføre dem til en celle sil (SPL Life Sciences) med en ren pensel og rennende vann. Silen holdes over et begerglass for å samle avløpsvannet.
- Vask embryoer i cellen sil med vann inntil all gjær pastaen er fjernet.
- Tørke ut overflødig vann ved å tørke utsiden av silen ved hjelp Kimwipes.
- Plasser celle sil i en ren petriskål og tilsett nok 50% blekemiddel for å dekke embryoer i celle sil. Dechorionate embryoene for 2 min av og til (2-3 ganger) rører dem.
- Skyll med vann i stor utstrekning til embryoer løse blekemiddel lukt.
- Plasser celle sil inn i en renPetriskål og dekke embryoer med vann for å hindre uttørking.
- Før du starter embryoer innstilling, legger en ul av den ønskede reagensen inn to nåler (noen ganger en nål kan være tilstoppet). Det tar omtrent 5 min for væsken å nå spissen av nålen.
- Skjær et rektangulært stykke drue juice agar og plassere den på et objektglass. Overfør dechorionated embryoer fra petriskål til agar stykke ved hjelp av en ren pensel.
- Under et fluorescerende disseksjon mikroskop velge riktig iscenesatt embryoer uttrykker GFP markeringen med en våt pensel og plassere hver embryo nær kanten av agar stykke på rad etter hverandre (figur 1A). Embryoene bør plasseres med sin ventral siden opp for bildebehandling fagocytose av gliaceller i sentralnervesystemet (CNS).
- Satt opp ca 10 embryoer i en rad.
- Fest embryoene til et dekkglass belagt i midten med en stripe av heptan lim (Figur 1B, C
- Plasser dekkglass i dehydrering kammer i ca 5 min (dette avhenger av fuktigheten i rommet og beløpet som skal injiseres).
- Etter tørking opp dekke embryoer med halocarbon olje 700 (Sigma) for å unngå ytterligere dehydrering.
- Plasser dekkglass på et objektglass med embryoene vendt opp. Du kan sette en dråpe vann på lysbildet for å hindre flytting av dekkglass. Embryoet er nå klar for injeksjon. Injeksjon stedet er vanligvis på den laterale siden i midten av embryoet.
3. Embryo Injection
- Fest nålen til en micromanipulator.
- For å bryte nålespissen sette kanten av dekkglasset i synsfeltet og justere nålen til det samme fokalplan. Veldig nøye flytte dekkglass før den treffer nålespissen og bryter den.
- Fokus på befruktede egg, plasserer nålen inn i olje og sørg for at du får en væske dråpe fra nålen. Det betyr at nålespissen har værtbrutt godt.
- Uten å berøre nålholderen flytte embryo inn nålen og injisere en dråpe i embryo. Flytt embryo bort og gå videre til den neste før alle embryoer blir injisert.
4. Imaging
Vi image embryoene på en omvendt konfokalmikroskop med en 40X eller 100X mål. Vi ser etter en pent plassert embryo med CNS i midten, som viser sterk GFP uttrykk og en god merking av apoptotiske celler etter injeksjon.
For repeterte opptak av levende embryoer vi vanligvis velge fem eller seks konfokale skiver (2 mikrometer tykke hver). Etterpå gjør vi en projeksjon av 3 skiver (6 mikrometer tykkelse) for å observere hele celler.
Vi bruker markører for apoptotiske celler som er stabile og ikke blekemiddel lett. For å unngå GFP bleking vi gjøre opptak i intervaller på 60 sek.
I noen tilfeller embryoer kan begynne å rulleløpet av tiden av video-opptak. Derfor tar vi en titt en gang i blant på opptak for å stoppe og starte på nytt hvis det er nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative rammer fra en film der apoptotiske celler er merket med Annexin V, og gliaceller, ectoderm og makrofager er merket med simulere cytGFP er vist i figur 2. Hver ramme er en projeksjon av tre skiver 2 mikrometer hver.
Embryo av scenen 15 er riktig plassert viser embryonale CNS i midten med godt merket gliaceller (g). Makrofager (m), som er det meste utenfor CNS, viser sterk cytoplasmic GFP uttrykk. Ectodermal celler er også merket med cytoplasmatisk GFP (e). Mange Annexin V positive celler blir sett i og utenfor sentralnervesystemet. Å følge engulfment hendelsen er ikke lett. Vi merket en hendelse med en hvit firkant der en glial celle er henger en apoptotiske partikkel. Legg merke til sondering oppførselen til glial celle: berøre apoptotiske partikkel et par ganger uten henger den og så ender opp med engulfment av Annexin V merket apoptotiske celler (figur 2
Andre markører for forskjellige stadier apoptotiske kunne brukes med den samme fremgangsmåte.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av embryo forberedelse til microinjections. A. En mikroskopisk lysbilde som inneholder et stykke agar som embryoer blir overført etter dechorionation. Ca 20 embryoer er plassert i kø, nær kanten av agar stykke, med sin ventral siden opp for bildebehandling CNS. B. En dekkglass inneholder en stripe av heptan lim i midten. C. dekkglass fra B med embryoer festet til heptan lim stripen.
Figur 2. Dynamisk analyse av apoptotiske celle klaring. Time-lapse-opptaks av apoptotiske celle klaring i en scene 15 embryo. Gliaceller (g), makrofager (m) og Ektoderm (e) er merket med simulere cytGFP (grønn). Apoptotiske celler er merket med fluorescerende Annexin V (rød). A. Utvalgte bilder fra en representant filmen blir vist. En glial celle henger en apoptotiske celle er merket med et rektangel. B. Nærbilde utsikt over den markerte rektangelet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apoptotisk celle klaring er en kritisk siste stadium av apoptose, noe som er svært dynamisk. Derfor sanntid studier av prosessen er av største betydning. Her beskriver vi en protokoll som muliggjør overvåkning av apoptotiske celle klaring i levende utviklingsland Drosophila embryoer. I denne fremgangsmåte må to populasjoner av celler merkes med spesifikke markører: apoptotiske celler og fagocytter. De simu-cytGFP reporter er egnet til å overvåke fagocytiske makrofager, gliaceller og Ektoderm samtidig i samme embryo, med saltholdig jør det mulig å følge forskjellige fagocyttiske cellepopulasjoner samtidig. Dette er en stor fordel for å studere "profesjonell" og "ikke-profesjonelle" klarering samtidig, sammenligne spesifikke aspekter av prosessen for eksempel hastighet, spesifisitet og nedbrytning evne. En ulempe med denne tilnærmingen er at simulere cytGFP markør er uttrykt seg svært sterkt i makrofager og mye svakere igliaceller, som kan være vanskelig å justere i samme film. Imidlertid kan ett bilde apoptotiske celle clearance av makrofager separat fra denne prosessen i CNS, ved å kjøre GFP uttrykk med spesifikke Gal4s (crq-Gal4 for makrofager og repo-Gal4 for gliaceller).
Ulike markører for apoptotiske celler reflekterer spesifikke molekylære og morfologiske forandringer er av stor verdi for å forstå dynamikken og reversibilitet av apoptose og celle klaring. Videre sanntid opptak av apoptotiske cellen klaring ved hjelp av disse markørene legge til ytterligere informasjon om mutant fenotyper, som ikke kunne oppnås ved hjelp av konvensjonelle immunhistokjemi teknikker i faste embryoer.
Den vanskeligste trinn av den beskrevne protokoll, da tenkelig u-CNS, er den ekstremt presis posisjonering av embryoer før injeksjon. Selv en liten bevegelse av dekkglass under vedlegg av den tilberedteEmbryoene som limet kunne forandre sin stilling, noe som ikke ville være egnet for avbilding CNS. Embryoet feste trinnet bør gjøres med maksimal oppmerksomhet.
Utvikling av flere markører for spesifikke stadier i apoptose og fagocytose ville være svært ønskelig for finere disseksjon og mulig manipulasjon av apoptotiske celle klaring. Protokollen presenteres her fungerer som et godt fundament for videre utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Marie Curie Reintegrering Grant (IRG249084). Vi takker alle medlemmer av Kurant laboratoriet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A.
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
