Summary
Здесь мы опишем эффективным методом исследования динамики апоптоза клетки оформление
Abstract
Надлежащего устранения нежелательных или аберрантных клеток путем апоптоза и последующего фагоцитоза (апоптоза оформления ячейки) имеет решающее значение для нормального развития во всех многоклеточных организмов. Апоптотическая оформления ячейки весьма динамичный процесс тесно связан с гибелью клеток; unengulfed апоптоза клеток почти не видели в естественных условиях при нормальных условиях. Для того чтобы понять различные этапы оформления апоптоза клеток и сравнить "профессионального" фагоциты - макрофаги и дендритные клетки на "непрофессиональной" - ткани-резидент соседние клетки, в естественных условиях живого изображения процесса является чрезвычайно ценным. Здесь мы опишем протокол для изучения апоптоза оформления ячейки в живых эмбрионов дрозофилы. Чтобы проследить динамику различных этапов фагоцитоза мы используем для специфических маркеров апоптоза клеток и фагоцитов. Кроме того, мы можем контролировать два фагоцитов систем параллельно: "профессиональных" макрофагах и "полу-Professional 'глии в развитие центральной нервной системы (ЦНС). Метод, описанный здесь использует эмбриона дрозофилы как отличную модель для исследования реальных время апоптоза оформление клетки.
Introduction
Надлежащего устранения нежелательных или аберрантных клеток путем апоптоза и последующего фагоцитоза имеет решающее значение для эмбрионального развития, а также для тканевого гомеостаза у взрослых. Фагоцитоз апоптоза клеток или апоптоз оформления ячейки весьма динамичный процесс, который продолжается в четыре этапа: (1) набор фагоцитов апоптоза клетки ("находят меня '), (2) признания ячейки в качестве мишени для фагоцитоза ( 'есть-меня') и (3) охвате, а затем (4) фагосома созревания и деградации апоптоза частиц 1-5. Есть два типа фагоцитов: «профессиональный» макрофагов и незрелых дендритных клеток, и "непрофессиональной" ткани-резидент соседних клеток, которые имеют решающее значение для оформления апоптоза клеток во время развития многоклеточных 6,7.
В развитии дрозофилы, устранение лишних клеток путем апоптоза происходит в три мАйн этапа, первый в середине-конце эмбриона, а затем в середине куколки, а затем в начале взрослой. Во время эмбриогенеза апоптоз частицы удаляются "профессионального" фагоциты, макрофаги, а к "непрофессиональной" эктодермы и глии 8,9.
В нашей предыдущей работе мы определили фагоцитарного рецептора, шести-микрон-под (SIMU), которая выражается исключительно в фагоцитирующих клеток во время эмбриогенеза. Использование промоутер сима мы получили специфический маркер фагоцитарной клеточных популяций (симу-cytGFP), который позволяет нам отслеживать макрофаги, эктодермы и глии одновременно в живом развивающемся эмбрионе 8. Кроме того, с помощью специальных маркеров апоптоза клеток на разных стадиях апоптоза, мы можем проследить динамику апоптоза оформление клетки в живом организме.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Чтобы проследить динамику апоптоза оформление клетки в естественных условиях две популяции клеток должны быть помечены: фагоциты и апоптоза клеток.
Чтобы отметить фагоцитарной клеточных популяций мы используем линии Drosophila содержащие симу-cytGFP маркер, который называет исключительно фагоциты в зародыше: макрофаги, глии и эктодермы 8. Можно использовать различные маркеры для фагоцитов, включая строки, содержащие форменные элементы крови конкретного Gal4 драйвера (CRQ-Gal4) или глии конкретных Gal4 драйвера (РЕПО-Gal4) и генетически закодированы под люминесцентные репортер управления БАС (UAS-GFP).
Для контроля апоптоза клеток в процессе апоптоза клетка оформления мы используем различные апоптоза / фагоцитоза маркеров. Аннексина V (Molecular Probes) служит в качестве раннего маркера апоптоза клеток 10; Phiphilux (OncoImmunin) представляет собой флуорогенный каспазы-3 субстрате, который используется в качестве позже апоптозSIS маркером, и Lysotracker (молекулярные зонды) работает как фагосома маркер. Мы вводим эти реагенты помощью микроинъекции системы PicoPump PV 820.
1. Готовимся
- Гептан клея:
Разверните двухсторонней ленты и положить столько, сколько вы можете в сцинтилляционный флакон, залить гептан, запечатать флаконе парафильмом, и рок в течение 24 часов. Добавить гептана Если клей слишком густой. - Мы позволяем мух лежать на подогретого виноградного сока агара + дрожжи вставьте в течение 2 часов, а затем передачи пластины до 25 ° С в течение 10-12 ч (зависит от желаемой этап) до записи микроинъекции и промежуток времени введенных эмбрионов. Мы собираем эмбрионов из чашек с агаром выдерживают при 25 ° С, тем самым обеспечивая эмбрионов из стадии 15 или 16 развития.
- Иглы подготовки:
Для подготовки иглы для инъекций, иглы мы используем 'Саттер инструмент »съемник и тонкостенных стеклянных нитей (FHC капиллярной трубки). Кончик объединенных капилляр сломалн диаметром до 0,5-2 мкм. - Покровные с клеем:
С помощью кончика пипетки дисперсные капли гептан клей на одной линии в середине покровное. Дайте ему высохнуть в течение нескольких секунд. Подготовьте несколько из этих покровные.
2. Подготовка эмбрионов
- Сбор эмбрионов из агара и передавать их в ячейки фильтра (SPL Life Sciences) с помощью чистой кисти и водопровод. Фильтр, проходит за стакан для сбора сточных вод.
- Мытье эмбрионов в клеточный фильтр с использованием воды, пока все дрожжи пасты не будет удален.
- Сухие лишнюю воду, протирая пределами использованием фильтра Kimwipes.
- Поместите клеточный фильтр в чистую чашку Петри и добавить достаточно 50% отбеливателя для покрытия эмбрионов в ячейки фильтра. Dechorionate эмбрионов в течение 2 мин от времени (2-3 раза), перемешивая их.
- Промыть тщательно водой, пока свободные эмбрионы отбеливатель запах.
- Поместите ячейку ситечко в чистуюЧашка Петри и охватывают эмбрионов с водой, чтобы предотвратить высыхание.
- Перед началом настройки эмбрионов, загрузить 1 мкл нужного реагента в две иглы (иногда иглы может быть засорен). Она занимает около 5 мин для жидкости для достижения кончика иглы.
- Отрежьте прямоугольный кусок виноградного сока агара и поместить его на предметное стекло микроскопа. Передача dechorionated эмбрионов из чашки Петри с агаром кусок с помощью чистой кисти.
- Под флуоресцентным микроскопом рассечение выбора правильной постановке эмбрионов выражения GFP маркер использованием мокрого кисти и поместить каждого эмбриона близко к краю кусок агара в ряд один за другим (рис. 1А). Эмбрионы должны быть размещены с их брюшной стороне для работы с изображениями фагоцитоза глии в центральной нервной системе (ЦНС).
- Установка около 10 эмбрионов в один ряд.
- Закрепить эмбрионов покровное покрытие в середине с полосой гептан клеем (фиг.1В, C
- Поместите покровное при дегидратации камеры в течение примерно 5 мин (это зависит от влажности помещения и количество для инъекций).
- После высыхания покрытия эмбрионов с Галокарбоновое масло 700 (Sigma), чтобы избежать дальнейшего обезвоживания.
- Поместите покровное на предметное стекло микроскопа с эмбрионами вверх. Вы можете поместить каплю воды на слайд, чтобы предотвратить перемещение покровное. Эмбрионы теперь готовы для инъекций. Место впрыска, как правило, на боковой стороне в середине зародыша.
3. Эмбрион инъекций
- Прикрепить иглы микроманипулятор.
- Чтобы сломать кончик иглы положил краю покровного стекла в поле зрения и отрегулируйте иглу с тем же фокальной плоскости. Очень осторожно двигаться покровное, пока не встретит на кончике иглы и разбивает его.
- Ориентируясь на эмбрионах, поместите иглу в нефти и убедитесь, что вы получите каплю жидкости из иглы. Это означает, что кончик иглы былсломана хорошо.
- Не касаясь иглодержателе перемещения эмбриона в иглу и впрыснуть каплю в эмбрион. Переместить эмбриона в сторону и перейти к следующему, пока все эмбрионы не вводили.
4. Изображениями
Мы изображения эмбрионов на перевернутом конфокальной микроскопии с 40X или 100X цели. Мы ищем красиво расположены эмбриона с ЦНС в середине, который показывает сильное выражение GFP и хороший маркировке апоптоза клеток после инъекции.
Для длительной записи живых эмбрионов мы обычно выбираем 5 или 6 конфокальной ломтиками (толщиной 2 мкм каждый). После этого, мы делаем проекцию 3 ломтика (6 мкм толщиной), чтобы наблюдать целые клетки.
Мы используем маркеров апоптоза клеток, которые являются стабильными и не отбеливать легко. Чтобы избежать GFP отбеливания мы делать записи с интервалом в 60 сек.
В некоторых случаях эмбрионы могут начнет растиво время записи видео. Таким образом, мы взглянем раз в то время на записи для того, чтобы остановиться и начать все сначала, если это необходимо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель кадров из видеозаписи, в котором апоптотических клеток помечены аннексина V и глии, эктодермы и макрофагов помечены симу-cytGFP показаны на рисунке 2. Каждый кадр является проекцией 3 ломтика 2 мкм каждый.
Эмбриона 15 ступени правильно расположен показывающие эмбриональных ЦНС в середине с хорошо помечены глии (г). Макрофагов (м), которые являются в основном за пределами ЦНС, показать сильные цитоплазматической экспрессии GFP. Эктодермальная клетки также помечены с цитоплазматическими GFP (е). Многие аннексина V позитивные клетки видны внутри, так и вне центральной нервной системы. Чтобы следовать охвату событий не так просто. Мы подчеркивали одно событие с белым прямоугольником, где глиальные клетки захлестывает апоптоза частицы. Обратите внимание на поведение зондирования глиальные клетки: Прикосновение к апоптозу частицы несколько раз без охватили его, а затем в конечном итоге с поглощением из Аннексин V помечены апоптоза клетки (рис. 2
Дополнительные маркеры для различных стадий апоптоза могут быть использованы с той же процедуре.
Рисунок 1. Схематическое изображение эмбриона подготовки к микроинъекции. А. предметное стекло содержащие кусок агара, на которой эмбрионы переносятся после dechorionation. Примерно 20 эмбрионов находились на одной линии, близко к краю кусок агара, с их брюшной стороне, для работы с изображениями ЦНС. B. покровное содержащий полосу гептан клей в середине. С. покровное от B с эмбрионами прикреплены к гептан полосы клея.
Рисунок 2. Динамический анализ апоптоза оформление клетки. Записи со сжатием временис апоптотического оформление клетки в стадии эмбриона 15. Глии (G), макрофагов (M) и эктодермы (E) помечены симу-cytGFP (зеленый). Апоптотическая помеченных флуоресцентными Аннексин V (красный). А. Отдельные кадры из фильма представителя показаны. Глиальные клетки охватили апоптоза клетка изображается прямоугольником. B. Закройте вид на выделенный прямоугольник.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Апоптоза зазор клетка является критическим последней стадии апоптоза, который равен высокой динамичностью. Поэтому реальные исследования времени процесса имеют первостепенное значение. Здесь мы опишем протокол, который позволяет контролировать оформление апоптоза клетки в живых развивающихся эмбрионах дрозофилы. В этой процедуре, две популяции клеток должны быть помечены с использованием специфических маркеров: апоптотических клеток и фагоцитов. Симу-cytGFP репортер предназначен для мониторинга фагоцитарной макрофаги, глии и эктодермы одновременно в том же эмбрион, W акие позволяет следовать различным фагоцитарной клеточных популяций в то же время. Это большое преимущество для изучения "профессиональный" и "непрофессиональной" зазор одновременно, сравнивая конкретные аспекты процесса, такие как скорость, специфичность и деградации способности. Недостатком этого подхода является то, что симу-cytGFP маркер выражается чрезвычайно сильно в макрофагах и гораздо слабееглии, которые могли бы быть хитрым, чтобы настроить в том же фильме. Однако нельзя изображений апоптоза оформление клетки макрофаги отдельно от этого процесса в ЦНС, при движении GFP выражение с конкретными Gal4s (CRQ-Gal4 для макрофагов и репо-Gal4 для глии).
Различные маркеры апоптоза клеток отражает специфические молекулярные и морфологические изменения имеют большое значение для понимания динамики и обратимость апоптоза и клеточной оформления. Кроме того, реальные записи времени апоптотических зазор клеток с использованием этих маркеров добавить дополнительную информацию о мутантные фенотипы, что не могло быть достигнуто с помощью обычных методов иммуногистохимии в основной эмбрионов.
Самый сложный этап описан протокол, при визуализации развивающейся ЦНС, является чрезвычайно точного позиционирования эмбрионов перед инъекцией. Даже небольшое движение покровное при прикреплении подготовленнойэмбрионы клей может изменить свою позицию, которая не была бы подходящей для визуализации ЦНС. Зародыш есть шаг должен быть сделан с максимальным вниманием.
Разработка дополнительных маркеров для конкретных этапах апоптоза и фагоцитоза бы крайне желательно для вскрытия тоньше и возможных манипуляций апоптотического оформление клетки. Протокол, представленные здесь служит хорошей основой для будущего развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Марии Кюри реинтеграции Грант (IRG249084). Мы благодарим всех членов Kurant лаборатории.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A.
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
