Summary
Här beskriver vi en effektiv metod för att studera dynamiken i apoptotisk cell clearance
Abstract
Den korrekt eliminering av oönskade eller avvikande celler genom apoptos och efterföljande fagocytos (apoptotiska celler clearance) är avgörande för normal utveckling i alla flercelliga organismer. Apoptotisk cell clearance är en mycket dynamisk process intimt förknippade med celldöd, unengulfed apoptotiska celler knappt sett in vivo under normala förhållanden. För att förstå de olika stegen i apoptotiska celler clearance och jämföra "professionella" fagocyter - makrofager och dendritiska celler till "icke-professionell" - vävnad bosatta angränsande celler, in vivo levande avbildning av processen är oerhört värdefull. Här beskriver vi ett protokoll för att studera apoptotiska celler clearance i levande Drosophila embryon. För att följa dynamiken i olika steg i fagocytos vi använder specifika markörer för apoptotiska celler och fagocyter. Dessutom kan vi följa två phagocyte system parallellt: "professionella" makrofager och "semi-professional 'Glia i utvecklingsländerna centrala nervsystemet (CNS). Den metod som beskrivs här använder Drosophila embryot som en utmärkt modell för verkliga tidsstudier av apoptotiska celler avslut.
Introduction
Den korrekt eliminering av oönskade eller avvikande celler genom apoptos och efterföljande fagocytos är avgörande för embryonal utveckling samt för vävnad homeostas i den vuxna. Fagocytos av apoptotiska celler eller apoptotiska celler clearance är en mycket dynamisk process som sker i fyra steg: (1) rekrytering av fagocyter till apoptotiska celler ("hitta-mig"), (2) erkännande av cellen som ett mål för fagocytos ( "äta-me ') och (3) helt omslutande följt av (4) phagosome mognad och nedbrytning av den apoptotiska partikeln 1-5. Det finns två typer av fagocyter: "professionella" makrofager och omogna dendritiska celler, och den "icke-professionella" tissue hemmahörande angränsande celler, vilket är avgörande för apoptotiska celler clearance under metazoan utveckling 6,7.
I Drosophila utveckling sker eliminering av överflödiga celler genom apoptos i tre main faser, först i mitten eller slutet av embryo, sedan i mitten av puppa, och igen i tidig vuxen. Under fosterutvecklingen apoptotiska partiklar avlägsnas genom "professionella" fagocyter, makrofager, och av "icke-professionell" ektoderm och glia 8,9.
I vårt tidigare arbete har vi identifierat ett fagocytisk receptor, Six-mikron-under (SIMU), vilket uttrycks enbart i fagocytiska celler under fosterutvecklingen. Använda simu promotorn vi genererat en specifik markör för fagocytiska cell populationer (simu-cytGFP) vilket gör att vi kan övervaka makrofager, ektoderm och glia samtidigt i ett levande embryo under utveckling 8. Dessutom, genom att använda särskilda markörer för apoptotiska celler i olika stadier av apoptos, kan vi följa dynamiken i apoptotiska celler clearance in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För att följa dynamiken i apoptotiska celler clearance in vivo två populationer av celler skall märkas: fagocytiska celler och apoptotiska celler.
För att markera fagocytiska cellpopulationer vi använder en Drosophila rad som innehåller simu-cytGFP markör, som märker uteslutande fagocytiska celler i embryot: makrofager, glia och ectoderm 8. Man kan använda olika markörer för fagocytceller, inklusive linjer som innehåller en hemocyte-specifik Gal4 drivrutin (CRQ-Gal4) eller glia-specifika Gal4 förare (repo-Gal4) och ett genetiskt kodade fluorescerande reporter i UAS kontroll (UAS-GFP).
Att övervaka apoptotiska celler under apoptotiska cellen clearance vi använder olika apoptos / markörer fagocytos. Annexin V (Molecular Probes) tjänar som en tidig markör för apoptotiska celler 10, Phiphilux (OncoImmunin) är ett fluorogent kaspas-3-substrat, som används som ett senare apoptosis markör, och Lysotracker (molekylära sonder) fungerar som en phagosome markör. Vi injicera dessa reagens med hjälp av mikroinjektion systemet PicoPump PV 820.
Ett. Förberedelser
- Heptan lim:
Rulla dubbelhäftande tejp och satte så mycket du kan i ett scintillationsvial, fyll med heptan, försegla flaskan med Parafilm, och rock under 24 timmar. Lägg heptan om lim är för tjockt. - Vi tillåter flugorna att lägga på en förvärmd druvsaft agarplatta + jäst pasta för 2 timmar, och sedan överföra plattan till 25 ° C under 10-12 h (beroende på önskad scen) före mikroinjektion och time lapse inspelningar av injicerade embryon. Vi samlar embryon från agarplattorna hölls vid 25 ° C, vilket ger embryon från steg 15 eller 16 av utvecklingen.
- Needle preparatet:
För att framställa nålar för injektion, använder vi en "Sutter instrument" nål avdragare och tunnväggiga trådar glas (FHC kapillärrör). Spetsen på poolade kapillären är trasigtn till en diameter av 0,5-2 um. - Täckglas med lim:
Med hjälp av en pipettspets dispergera en droppe av heptan lim i en linje i mitten av täckglas. Låt det torka i några sekunder. Förbered ett fåtal av dessa täckglas.
2. Embryo Framställning
- Samla embryon från agarplattor och överföra dem till en cell sil (SPL Life Sciences) med en ren pensel och rinnande vatten. Silen hålls över en bägare för att samla in avloppsvatten.
- Tvätta embryon i cellen sil med användning av vatten tills all jästen pastan avlägsnas.
- Torka ut överflödigt vatten genom att torka av utsidan av silen med hjälp Kimwipes.
- Placera cell sil i en ren petriskål och tillsätt tillräckligt 50% blekmedel för att täcka embryon i cell sil. Dechorionate embryona under 2 min ibland (2-3 gånger) omrörning dem.
- Skölj med vatten utförligt tills embryon lösa blekmedel lukt.
- Placera cell sil i en renPetriskål och omfatta embryon med vatten för att förhindra uttorkning.
- Innan du börjar embryon inställning, fyller 1 pl av önskad reagens i två nålar (ibland en nål kan vara igensatt). Det tar ca 5 min för att vätskan skall nå nålspetsen.
- Skär en rektangulär bit av druvsaft agar och placera den på ett objektglas. Överför dechorionated embryon från petriskål till agar bit med en ren pensel.
- Enligt en fluorescerande dissektion mikroskop välja korrekt iscensatt embryon som uttrycker GFP markör med en våt pensel och placerar varje embryo nära kanten av agar lappar i en rad efter varandra (Figur 1A). De embryon bör placeras med sin ventrala sidan uppåt för avbildning fagocytos av glia i det centrala nervsystemet (CNS).
- Ställ upp ca 10 embryon i en rad.
- Fäst de embryon som ett täckglas belagt i mitten med en remsa av heptan lim (Figur 1B, C
- Placera täckglas i uttorkning kammaren i ca 5 min (detta beror på luftfuktigheten i rummet och det belopp som skall injiceras).
- Efter torkning täcka embryon med Halocarbon olja 700 (Sigma) för att undvika ytterligare uttorkning.
- Placera täckglas på ett objektglas med embryona uppåt. Du kan sätta en droppe vatten på bilden för att förhindra förflyttning av täckglas. Embryon är nu redo för injektion. Injektion platsen är typiskt på den laterala sidan i mitten av embryot.
Tre. Embryo Injektion
- Fäst nålen på en mikromanipulator.
- För att bryta nålspetsen sätta kanten av skyddsremsan på synfältet och justera nålen till samma fokalplan. Mycket försiktigt flytta täckglas tills den träffar nålspetsen och bryter det.
- Fokusera på embryona, placera nålen i olja och se till att du får en flytande droppe ur nålen. Det betyder att nålspetsen har varitbryts väl.
- Utan att vidröra nålen innehavaren flytta embryot in nålen och injicera en droppe i embryot. Flytta embryot bort och gå vidare till nästa ett tills alla embryona injiceras.
4. Imaging
Vi bilden embryona på ett inverterat konfokalmikroskop med 40X eller 100X mål. Vi letar efter en snyggt placerad embryo med CNS i mitten, som visar stark GFP uttryck och en bra märkning av apoptotiska celler efter injektionen.
För inspelningar time lapse av levande embryon vi väljer vanligtvis 5 eller 6 konfokala skivor (2 ^ m tjocka vardera). Efteråt gör vi en projektion av 3 skivor (6 ìm tjocklek) för att observera hela celler.
Vi använder markörer för apoptotiska celler som är stabila och inte blekmedel lätt. För att undvika GFP blekning vi gör inspelningar i intervaller om 60 sek.
I vissa fall kan embryon får börja rullaunder tiden för videoinspelning. Därför tar vi en titt då och då vid inspelning för att stoppa och börja om vid behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa bildrutor från en film, i vilken apoptotiska celler är märkta med Annexin V och glia, ektoderm och makrofager är märkta med simu-cytGFP visas i figur 2. Varje ram är en projektion av tre skivor 2 pm vardera.
Embryot i steget 15 är korrekt placerad visar embryonala CNS i mitten med väl märkta glia (g). Makrofager (m), som oftast utanför CNS, visa stark cytoplasmic GFP uttryck. Ektodermala celler är också märkta med cytoplasmiskt GFP (e). Många annexin V positiva celler förekommer i och utanför CNS. För att följa engulfment händelsen är inte lätt. Vi betonade en händelse med en vit rektangel där en gliacell har drabbat en apoptotiska partikel. Notera sondera beteende gliacell: vidröra apoptotiska partikeln några gånger utan uppslukar den och sedan hamna med engulfment av Annexin V märkt apoptotiska celler (Figur 2
Ytterligare markörer för olika apoptotiska stadier skulle kunna användas med samma förfarande.
Figur 1. Schematisk representation av embryo inför microinjections. A. En mikroskopisk bild som innehåller en bit agar på vilka embryon överförs efter dechorionation. Om 20 embryon placeras i linje, nära kanten av agar stycke med sin ventrala sidan uppåt, för avbildning CNS. En täckglas innehållande en remsa av heptan lim i mitten B.. C. täckglas från B med embryon fäst till heptan limremsan.
Figur 2. Dynamisk analys av apoptotiska celler avslut. Time-lapse inspelnings av apoptotiska celler clearance i ett skede 15 embryo. Glia (g), makrofager (M) och ektoderm (e) har en märkning med simu-cytGFP (grön). Apoptotiska celler är märkta med fluorescerande Annexin V (röd). Visas A. Utvalda bilder från en representativ film. En gliacell uppslukar en apoptotiska cellen visas med en rektangel. Närbild utsikt över den markerade rektangeln B..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apoptotisk cell clearance är en kritisk sista stadiet av apoptos, vilket är mycket dynamisk. Därför realtid studier av processen är av yttersta vikt. Här beskriver vi ett protokoll som möjliggör övervakning av apoptotiska celler clearance i levande utvecklingsländer Drosophila embryon. I den här proceduren måste två populationer av celler märkas med specifika markörer: apoptotiska celler och fagocyter. Den simu-cytGFP reportern är lämplig för övervakning av fagocytiska makrofager, glia och ektoderm samtidigt i samma embryo, gör w hich det möjligt att följa olika fagocytiska cellpopulationer samtidigt. Detta är en stor fördel för att studera "professionella" och "icke-professionella" clearance samtidigt, att jämföra specifika aspekter av processen som till exempel hastighet, specificitet och nedbrytning förmåga. En nackdel med detta tillvägagångssätt är att simulera cytGFP markör uttrycks mycket starkt i makrofager och mycket svagare iglia, vilket kan vara svårt att anpassa sig i samma film. Dock kan en bild apoptotiska cellen clearance av makrofager separat från denna process i CNS, genom att driva GFP uttryck med specifika Gal4s (CRQ-Gal4 för makrofager och repo-Gal4 för glia).
Olika markörer för apoptotiska celler återspeglar specifika molekylära och morfologiska förändringar är av stort värde för att förstå dynamiken och reversibilitet apoptos och cell clearance. Dessutom realtid inspelningar av apoptotiska celler clearance använder dessa markörer lägga till ytterligare information om muterade fenotyper, vilket inte kan uppnås genom användning av konventionella immunohistokemi tekniker i fasta embryon.
Den svåraste steget i beskrivna protokollet, när imaging utvecklingsländerna CNS, är den extremt exakt positionering av embryona före injektion. Även en liten flyttning av täckglas under fastsättning av det bereddaembryon till limmet kunde ändra sin ståndpunkt, vilket inte skulle vara lämpligt för avbildning av CNS. Embryot fäster steget bör göras med maximal uppmärksamhet.
Utveckling av ytterligare markörer för olika stadier i apoptos och fagocytos vore ytterst önskvärt för finare dissekering och eventuell manipulation av apoptotiska celler avslut. Protokollet presenteras här utgör en god grund för framtida utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett Marie Curie återintegreringsbidrag (IRG249084). Vi tackar alla medlemmar i Kurant laboratoriet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A.
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
