Summary
Burada apoptotik hücre boşluk dinamikleri eğitim için etkili bir yöntem tarif
Abstract
Apoptoz ve sonraki fagositoz yoluyla istenmeyen veya anormal hücrelerin uygun ortadan kaldırılması (apoptotik hücre boşluk) Tüm metazoan organizmaların normal gelişimi için çok önemlidir. Apoptotik hücre boşluk yakından hücre ölümü ile ilgili son derece dinamik bir süreçtir; unengulfed apoptotik hücrelerin ancak normal şartlar altında in vivo olarak görülür. Apoptotik hücre boşluk farklı adımları anlamak için ve 'profesyonel' fagositler karşılaştırmak için - için makrofajlar ve dendritik hücreler 'profesyonel olmayan' - doku yerleşik komşu hücreler, sürecin in vivo canlı görüntüleme son derece değerlidir. Burada canlı Drosophila embriyolar apoptotik hücre boşluk eğitim için bir protokol açıklar. Biz apoptotik hücreleri ve fagositler için özel işaretleri kullanmak fagositoz farklı adımların dinamiklerini takip etmek. Ayrıca, paralel olarak iki fagosit sistemleri izleyebilirsiniz: 'profesyonel' makrofajlar ve 'yarı-profeGelişmekte olan merkezi sinir sisteminde ssional 'glial (MSS). Burada anlatılan yöntemi apoptotik hücre boşluk gerçek zamanlı çalışmalar için mükemmel bir model olarak Drosophila embriyo kullanır.
Introduction
Apoptoz ve sonraki fagositoz yoluyla istenmeyen veya anormal hücrelerin ortadan kaldırılması uygun embriyo gelişimi için hem de yetişkin doku homeostazında için çok önemlidir. Apoptotik hücreler veya apoptotik hücre boşluk fagositoz dört adımda ilerler son derece dinamik bir süreçtir: apoptotik hücreye fagositler (1) işe ('bulmak-me'), fagositoz için bir hedef olarak hücrenin (2) tanıma ( '-Bana yemek') ve (3) yutulmasına, apoptotik parçacık 1-5 (4) phagosome olgunlaşma ve yıkımı izledi. 'Profesyonel' makrofajlar ve olgunlaşmamış dendritik hücreler, ve 'profesyonel olmayan' doku yerleşik komşu hücreleri, metazoan geliştirme 6,7 sırasında apoptotik hücre izni için önemli olan: fagositler iki türü vardır.
Drosophila gelişimi apoptoz yoluyla gereksiz hücrelerin giderilmesi üç m oluşurgeç embriyo için orta ilk, sonra orta pupa ve yine erken yetişkin ain aşamaları,. Embriyogenez sırasında apoptotik parçacıklar 'profesyonel' fagositler, makrofajlar, ve 'profesyonel olmayan' ektoderm ve glia 8,9 ile çıkarılır.
Daha önceki çalışmada biz embriyogenez sırasında fagositik hücrelerde sadece ifade bir fagositik reseptör, Altı mikron-altı (SIMU), belirledik. Simu organizatörü kullanarak bize canlı bir gelişen embriyonun 8 eş zamanlı olarak makrofajlar, ektoderm ve glia izlemeniz için fagositik hücre popülasyonlarının (simu-cytGFP) için özel bir belirteç oluşturulur. Buna ek olarak, apoptoz farklı aşamalarında apoptotik hücreler için özel işaretleri kullanarak, in vivo apoptotik hücre boşluk dinamiklerini takip edebiliyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fagositik hücreler ve apoptotik hücre: hücre iki nüfus etiketlenmelidir in vivo apoptotik hücre boşluk dinamiklerini takip etmek.
Makrofajlar, glia ve ektoderm 8: biz simu-cytGFP embriyo sadece fagositik hücreleri etiketler işaretleyici içeren bir Drosophila satırını kullanın fagositik hücre popülasyonlarının işaretlemek için. Biri hemocyte özel Gal4 sürücü (CRQ-Gal4) içeren satırları veya glia özel Gal4 sürücü (repo-Gal4) ve UAS kontrol (UAS-GFP) altında genetik olarak kodlanmış floresan muhabiri de dahil olmak üzere fagositik hücreler, farklı işaretleri kullanabilirsiniz.
Apoptotik hücre temizleme sırasında apoptotik hücreleri izlemek için farklı apoptoz / fagositoz işaretleri kullanın. Annexin V (Molecular Probes) 10 apoptotik hücreler için erken bir göstergesi olarak hizmet eder; Phiphilux (OncoImmunin) daha sonra apo olarak kullanılan florojenik substrat, kaspaz-3, olduğusis işaretleyici ve Lysotracker (Molecular Probes) bir phagosome göstergesi olarak çalışır. Biz mikroenjeksiyon sistemi picopump PV 820 kullanarak bu reaktifler enjekte.
1. Hazırlanmak
- Heptan tutkal:
Çift taraflı bant göz önüne sermek ve bir sintilasyon flakon, 24 saat Parafilm ile flakon ve kaya mühür, heptan ile doldurabilirsiniz kadar koydu. Tutkal çok kalın ise heptan ekleyin. - Biz sinekler önceden ısıtılmış üzüm suyu agar plaka + maya 2 saat yapıştırmak bırakmaya izin ve sonra 25 plaka aktarmak ° C 10-12 saat (istenilen evresine bağlıdır) için önce mikroenjeksiyon ve zaman atlamalı kayıtları enjekte edilen embriyoların. Böylece sahne 15 veya gelişme 16 embriyo sağlayan, 25 ° C 'de muhafaza agar plakaları embriyolar toplamak.
- İğne hazırlanması:
Enjeksiyon için iğne hazırlamak için, bir 'Sutter aracı' iğne çektirmesi ve ince duvarlı cam filamentler (FHC Kılcal boru) kullanın. Toplanmış kılcal ucu kırdı0.5-2 mikron arasında bir çapa n. - Yapıştırıcı ile lamel:
Bir pipet kullanarak lamel ortasında bir satırda heptan tutkal bir damla dağıtmak. Birkaç saniye kurumasını bekleyin. Bu lamelleri birkaç hazırlayın.
2. Embriyo Hazırlık
- Agar embriyolar toplayın ve temiz bir boya fırçası ve su kullanarak bir hücre süzgeç (SPL Yaşam Bilimleri) aktarabilirsiniz. Süzgeç atık su toplamak için bir beher üzerinde tutulur.
- Tüm maya hamur kaldırılır gelene kadar su kullanılarak hücre süzgecinden embriyolar yıkayın.
- Kimwipes kullanarak süzgeç dış silerek aşırı su kurur.
- Temiz bir Petri kabındaki hücre süzgeç yerleştirin ve hücre süzgecinden içinde embriyo karşılamak için yeterli% 50 çamaşır suyu ekleyin. Bazen 2 dakika (2-3 kez) karıştırarak için embriyo Dechorionate.
- Embriyolar çamaşır suyu kokusu gevşek kadar yoğun su ile durulayın.
- , Temiz bir hücre süzgecinden yerleştirinPetri kadar kurumasını önlemek için su ile embriyo çanak ve kapsamaktadır.
- Embriyo ayar başlamadan önce, iki iğne (bazen bir iğne tıkanmış olabilir) içine istenen reaktif 1 ul yükleyin. Bu iğne ucu ulaşmak için sıvı için yaklaşık 5 dakika sürer.
- Üzüm suyu agar dikdörtgen bir parça kesin ve bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Petri kabı temiz bir boya fırçası kullanarak agar parça dechorionated embriyolar transfer.
- Bir floresan diseksiyon mikroskop altında düzgün seçin ıslak bir boya fırçası kullanarak GFP işaretleyici ifade embriyo sahnelenen ve yakın başka bir (Şekil 1A) sonra arka arkaya birinde agar parçasının kenarına her embriyo yerleştirin. Embriyolar Santral Sinir Sistemi (SSS) glia tarafından görüntüleme fagositozu için kendi ventral yüzü ile yerleştirilmelidir.
- Bir satır yaklaşık 10 embriyo ayarlayın.
- Heptan bir tutkal şeridi (Şekil 1B, C orta kaplanmış bir lamel embriyolar takın
- Yaklaşık 5 dakika (bu odanın nem ve enjekte edilecek miktarına bağlıdır) için dehidrasyon odasına lamel yerleştirin.
- Kuruyor sonra daha dehidratasyonu önlemek için halokarbon petrol 700 (Sigma) ile embriyoların kapsamaktadır.
- Yukarı bakacak şekilde embriyolar ile bir mikroskop lamı üzerine lamel yerleştirin. Bu lamel hareket önlemek için slayt üzerinde bir damla su koymak olabilir. Embriyolar artık enjeksiyon için hazır. Enjeksiyon yer embriyo ortasında yan tarafında tipik olarak.
3. Embriyo Enjeksiyon
- Bir micromanipulator için iğne takın.
- Iğne ucu görüş alanı içinde lamel kenarına koymak ve aynı odak düzlemine iğne ayarlamak kırmak için. Bu iğne ucu vurur ve tatili kadar çok dikkatli bir şekilde lamel hareket ettirin.
- Embriyoların odaklanarak, yağ içine iğne yerleştirin ve iğne bir sıvı damla olsun emin olun. Bu iğne ucu olmuştur anlamına gelirde kırık.
- Dokunmadan iğne tutucu iğne içine embriyo hareket ve embriyo içine bir damla enjekte. Uzak embriyo hareket ettirin ve tüm embriyolar enjekte kadar bir sonrakine geçin.
4. Görüntüleme
40X veya 100X amacı ile ters bir konfokal mikroskop Biz görüntü embriyolar. Biz güçlü GFP ifade ve enjeksiyonu takiben apoptotik hücrelerin iyi bir etiketleme gösterir ortasında, merkezi sinir sistemi ile bir güzel konumlandırılmış embriyo arayın.
Canlı embriyoların zaman atlamalı kayıtları için biz genellikle 5 veya 6 konfokal dilim (kalın 2 mikron her) seçin. Daha sonra, biz bütün hücreleri gözlemlemek için 3 dilim (6 mikron kalınlığında) bir projeksiyon yapmak.
Biz istikrarlı ve kolayca çamaşır suyu yok apoptotik hücreler için işaretleri kullanın. Biz 60 sn aralıklarla kayıt yapmak beyazlatma GFP önlemek için.
Bazı durumlarda embriyo haddeleme başlayabilirvideo kayıt döneminde. Bu nedenle, durdurmak ve gerekirse yeniden başlamak için kayıt bir arada bir göz atın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Apoptotik hücre Annexin V ile etiketlenir ve glia ektoderm ve makrofajlar simu-cytGFP ile etiketlenmiş olan bir filmden Örnek çerçeve, Şekil 2'de gösterilmiştir. Her kare 3 dilim 2 mikron her bir yansımasıdır.
Sahne 15 embriyo düzgün şekilde etiketlenmiş glia (g) ile ortada embriyonik MSS gösteren konumlandırılmış. MSS dışında çoğunlukla makrofajlar (m), güçlü sitoplazmik GFP ifade gösterir. Ektodermal hücreler de sitoplazmik GFP (e) ile etiketlenir. Birçok Annexin V pozitif hücreler, CNS içinde ve dışında görülür. Yutulma olayı takip etmek kolay değildir. Biz bir glial hücre bir apoptotik parçacık içine çeken bir beyaz dikdörtgen olan bir olay vurgulanır. Glial hücre sondalama davranışı Not: bu içine çeken olmadan apoptotik parçacık birkaç kez dokunarak ve sonra Annexin V yutulma ile biten apoptotik hücre (Şekil 2 etiketli
Farklı apoptotik aşamaları için ek işaretleri aynı prosedüre kullanılabilir.
Şekil 1. Microinjections için embriyo hazırlık şematik. A. embriyo dechorionation sonra transfer edildiği agar bir parça içeren bir mikroskopik slayt. Yaklaşık 20 Embriyolar görüntüleme CNS, en fazla kendi ventral yüzü, yakın agar parçası kenarına, hat üzerine yerleştirilir. B. ortasında heptan yapıştırıcı bir şerit içeren bir lamel. ° C. embriyolar ile B lamel heptan tutkal şeridi eklenmelidir.
Şekil 2. Apoptotik hücre boşluk dinamik analizi. Time-lapse kayıtbir sahne 15 embriyo apoptotik hücre boşluk s. Glia (g), makrofajlar (m) ve ektoderm (e) simu-cytGFP (yeşil) ile etiketlenir. Apoptotik hücreler floresan Annexin V (kırmızı) ile işaretlenmiştir. Temsili bir filmden A. Seçili kare gösterilir. Bir apoptotik hücre içine çeken bir glial hücre bir dikdörtgen ile gösterilir. B. işaretli dikdörtgen manzarasına kadar kapatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apoptotik hücre boşluk son derece dinamik apoptoz, kritik bir son aşamadır. Bu nedenle işlem gerçek zamanlı çalışmalar büyük önem taşımaktadır. Burada gelişmekte olan Drosophila embriyolar canlı apoptotik hücre boşluk izlenmesi sağlayan bir protokol açıklar. Apoptotik hücreleri ve fagositler: Bu prosedürde, hücrelerin iki nüfus özel işaretleri kullanılarak işaretlenmiş olmalıdır. Simu-cytGFP raportör aynı embriyo eş zamanlı olarak fagositik makrofajlar, glia ve ektoderm izlenmesi için uygundur, W milliyetçilik, mümkün olan aynı anda farklı fagositik hücre popülasyonlarının takip kolaylaştırır. Bu, oran, özgüllük ve bozulması yeteneği gibi sürecin belirli yönlerini karşılaştırarak, aynı anda 'profesyonel' ve 'profesyonel olmayan' boşluk eğitim için büyük bir avantaj. Bu yaklaşımın bir dezavantajı, simu-cytGFP işaretleyici makrofajlar son derece güçlü bir şekilde ifade edilen ve çok daha düşük olmasıdırAynı filmde ayarlamak için zor olabilir glia,. Ancak, belirli bir Gal4s (makrofajlar ve glia için repo-Gal4 için CRQ-Gal4) ile GFP ifade sürerek MSS bu süreçten ayrı olarak makrofajlar tarafından görüntü apoptotik hücre boşluk, can.
Spesifik moleküler ve morfolojik değişiklikler yansıtan apoptotik hücreler için farklı işaretleri apoptoz ve hücre temizlenmesi dinamikleri ve reversibilite anlamak için büyük bir değer taşımaktadır. Ayrıca, bu işaretleri kullanarak apoptotik hücre boşluk gerçek zamanlı kayıtları sabit embriyolarda geleneksel immünohistokimyasal teknikler kullanılarak elde edilemedi mutant fenotip, hakkında ek bilgi ekleyin.
Açıklanan protokol en zor adım, görüntüleme gelişmekte olan sinir sistemi, enjeksiyon öncesi embriyoların son derece hassas konumlandırma. Hazırlanan eki sırasında lamel bile hafif bir harekettutkal embriyoların görüntüleme merkezi sinir sistemi için uygun olmaz konumlarını, değişebilir. Adım bağlama embriyo azami dikkat ile yapılmalıdır.
Apoptoz ve fagositoz belirli aşamaları için ek markörlerin gelişimi ince disseksiyon ve apoptotik hücre boşluk manipülasyonu mümkün için son derece arzu edilen bir husustur. Burada sunulan protokol gelecekteki gelişimi için iyi bir temel olarak hizmet vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Marie Curie (IRG249084) tarafından desteklenmiştir. Biz Kurant laboratuar tüm üyeleri teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A.
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
