Summary
Hier beschrijven we een effectieve methode voor het bestuderen dynamica van apoptotische cel klaring
Abstract
De correcte verwijdering van ongewenste of afwijkende cellen door apoptose en daaropvolgende fagocytose (apoptotische cel klaring) is cruciaal voor de normale ontwikkeling in alle metazoan organismen. Apoptotische cel klaring is een zeer dynamisch proces nauw verbonden celdood; unengulfed apoptotische cellen worden nauwelijks waargenomen in vivo onder normale omstandigheden. Om de verschillende stappen van apoptotische cellen klaring begrijpen en 'professionele' fagocyten vergelijken - macrofagen en dendritische cellen "niet-professionele" - tissue-resident naburige cellen, in vivo beeldvorming van levende het proces is zeer waardevol. Hier een protocol voor het bestuderen van apoptotische cel klaring in levende Drosophila embryo's beschrijven we. De dynamiek van verschillende stappen in fagocytose we specifieke merkers voor apoptotische cellen en fagocyten volgen. Daarnaast kunnen wij monitoren twee fagocytensysteem systemen parallel: 'professionele' macrofagen en 'semi-professional 'glia in de ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CNS). De hier beschreven methode maakt gebruik van het Drosophila embryo als een uitstekend model voor real time studie van apoptotische cel klaring.
Introduction
De goede verwijdering van ongewenste of afwijkende cellen door apoptose en daaropvolgende fagocytose is essentieel voor de embryonale ontwikkeling en voor weefsel homeostase in de volwassene. Fagocytose van apoptotische cellen of apoptotische cel klaring is een zeer dynamisch proces dat verloopt in vier stappen: (1) werving van fagocyten aan de apoptotische cel ('vind-me'), (2) de erkenning van de cel als doelwit voor fagocytose ( 'eet-me') en (3) engulfment, gevolgd door (4) phagosome rijping en afbraak van de apoptotische deeltje 1-5. Er zijn twee soorten fagocyten: 'professionele' macrofagen en onvolgroeide dendritische cellen, en de 'niet-professionele' tissue-resident naburige cellen, die cruciaal zijn voor apoptotische cel klaring tijdens metazoan ontwikkeling 6,7 zijn.
In Drosophila ontwikkeling, de eliminatie van overbodige cellen door apoptose optreedt in drie main fasen, eerst in het midden tot eind embryo, dan in het midden van de pop, en opnieuw in de vroege volwassenheid. Tijdens de embryogenese apoptotische deeltjes worden verwijderd door 'professionele' fagocyten, macrofagen, en door de 'niet-professionele' ectoderm en glia 8,9.
In ons voorgaande werk hebben we een fagocytische receptor, Six-micron-kader (SIMU), die uitsluitend wordt uitgedrukt in fagocytische cellen gedurende embryogenese geïdentificeerd. Met behulp van de simulatie promotor we gegenereerd een specifieke marker voor fagocyterende celpopulaties (simulatie-cytGFP), die ons in staat stelt gelijktijdig te volgen macrofagen, ectoderm en glia in een live ontwikkelende embryo 8. Bovendien, door specifieke merkers voor apoptotische cellen in verschillende stadia van apoptose, kunnen wij de dynamiek van gladde spiercellen in vivo klaring te volgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fagocyterende cellen en apoptotische cellen: de dynamiek van apoptotische cel klaring in vivo twee populaties van cellen moeten worden geëtiketteerd volgen.
Macrofagen, glia en ectoderm 8: naar fagocytaire celpopulaties we gebruik maken van een Drosophila regel met het simuleren cytGFP marker, die uitsluitend fagocytcellen labelt in het embryo te markeren. Men kan gebruik maken van verschillende markers voor fagocytcellen, waaronder regels met een hemocyte-specifieke Gal4 driver (CRQ-Gal4) of glia-specifieke Gal4 driver (repo-Gal4) en een genetisch gecodeerd fluorescerende reporter onder UAS controle (UAS-GFP).
Aan apoptotische cellen controleren tijdens de apoptotische cel klaring gebruiken we verschillende apoptose / fagocytose markers. Annexine V (Molecular Probes) dient als een vroege merker voor apoptotische cellen 10, Phiphilux (OncoImmunin) is een fluorogene caspase-3-substraat dat wordt gebruikt als een latere apoptosesis marker, en Lysotracker (Molecular Probes) werkt als een phagosome marker. We injecteren deze reagentia met behulp van de micro-injectie systeem picopump PV 820.
1. Voorbereidingen
- Heptaan lijm:
Rol dubbelzijdig plakband en zet zoveel als je kunt in een scintillatieflesje, vullen met heptaan, sluit de flacon met Parafilm, en rock voor 24 uur. Voeg heptaan als de lijm te dik. - We laten de vliegen te leggen op een voorverwarmde druivensap agar plaat + gist pasta voor 2 uur, en vervolgens over de plaat tot 25 ° C gedurende 10-12 uur (afhankelijk van de gewenste podium) voorafgaand aan micro-injectie en time lapse opnames geïnjecteerde embryo. Wij verzamelen embryos uit agarplaten gehandhaafd op 25 ° C, waardoor embryo van stap 15 of 16 ontwikkeling.
- Naald het preparaat:
Om naalden voor injectie te bereiden, gebruiken we een 'Sutter instrument' naald trekker en dunwandige glasfilamenten (FHC capillaire buizen). De tip van de gepoolde capillaire kapotn tot een diameter van 0,5-2 urn. - Dekglaasje met lijm:
Met behulp van een pipet tip verspreiden een daling van de heptaan lijm in een lijn in het midden van het dekglaasje. Laat het drogen voor een paar seconden. Bereid een paar van deze dekglaasjes.
2. Embryo Voorbereiding
- Verzamel embryo's uit agar platen en overbrengen naar een cel zeef (SPL Life Sciences) met een schone kwast en stromend water. De zeef wordt gehouden over een beker om afvalwater op te vangen.
- Wassen embryo's in de cel zeef met water totdat alle gist pasta wordt verwijderd.
- Uitdrogen van de overtollige water schoon door de buitenkant van de zeef met behulp Kimwipes.
- Plaats de cel zeef in een schone petrischaal en voeg genoeg 50% bleekmiddel op embryo's in de cel zeef dekken. Dechorionate de embryo's gedurende 2 min. af en toe (2-3 keer) te roeren.
- Spoelen met water uitgebreid tot embryo los het bleekmiddel geur.
- Plaats de cel zeef in een schonePetrischaal en hebben betrekking op de embryo's met water opdrogen te voorkomen.
- Voordat u begint met embryo instelling, laadt 1 ui van het gewenste reagens in twee naalden (soms een naald kan worden verstopt). Het duurt ongeveer 5 minuten om de vloeistof aan de punt van de naald bereiken.
- Knip een rechthoekig stuk druivensap agar en plaats het op een objectglaasje. Overdragen dechorionated embryo's uit de petrischaal op de agar stuk met een schone kwast.
- Onder een fluorescentie microscoop dissectie winkelwagentje goed georganiseerd embryo expressie de GFP merker met een natte kwast en plaats elk embryo dichtbij de rand van de agar stuk in een rij achter elkaar (figuur 1A). De embryo's voor imaging fagocytose worden geplaatst met hun buikzijde door glia in het centrale zenuwstelsel (CNS).
- Opgericht ongeveer 10 embryo's in een rij.
- Bevestig het embryo een dekglaasje bedekt in het midden met een strip van lijm heptaan (Figuur 1B, C
- Plaats het dekglaasje in de dehydratatie kamer gedurende 5 min (afhankelijk van de vochtigheid van de kamer en de te injecteren hoeveelheid).
- Na het opdrogen betrekking op de embryo's met halogene olie 700 (Sigma) om verdere uitdroging te voorkomen.
- Plaats het dekglaasje op een objectglaasje met het embryo naar boven. U kunt een druppel water op de dia om het verplaatsen van het dekglaasje te voorkomen. Embryo's zijn nu klaar voor injectie. Injectieplaats is meestal aan de laterale zijde in het midden van het embryo.
3. Embryo Injectie
- Bevestig de naald op een micromanipulator.
- Het doorbreken van de naald zet de rand van het dekglaasje in het gezichtsveld en de naald aan te passen aan dezelfde focal plane. Heel voorzichtig bewegen het dekglaasje totdat hij raakt de naald en breekt het.
- Focussen op de embryo's, plaatst u de naald in de olie en zorg ervoor dat je een vloeistof druppel uit de naald. Het betekent dat de naald is geweestgoed gebroken.
- Zonder het aanraken van de naaldhouder verplaatsen het embryo in de naald en injecteer een druppel in het embryo. Beweeg de embryo weg en ga verder naar de volgende totdat alle embryo's worden geïnjecteerd.
4. Imaging
We afbeelding van de embryo's op een omgekeerde confocale microscoop met een 40X of 100X doelstelling. We zoeken naar een mooi gepositioneerd embryo met de CNS in het midden, die een sterke GFP expressie en een goede etikettering van apoptotische cellen na injectie geeft.
Voor time lapse opnames van live embryo we meestal kiezen voor 5 of 6 confocale plakjes (2 micrometer dik elk). Daarna maken we een projectie van 3 sneetjes (6 micrometer dik) met het oog op volledige cellen te observeren.
We gebruiken merkers voor apoptotische cellen die stabiel en niet bleken gemakkelijk. Om GFP bleken we te maken opnames in intervallen van 60 sec te voorkomen.
In sommige gevallen embryo kan beginnen rollentijde van video-opname. Daarom nemen we een kijkje eens in de zoveel tijd bij de opname om te stoppen en opnieuw te beginnen, indien nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve beelden van een film waarin apoptotische cellen gelabeld met Annexine V en glia, ectoderm en macrofagen zijn voorzien van simu-cytGFP worden getoond in Figuur 2. Elk frame is een projectie van 3 segmenten 2 pm elk.
Het embryo van de etappe 15 is goed gepositioneerd met de embryonale CNS in het midden met goed gelabeld glia (g). Macrofagen (m), die meestal buiten het CNS, vertonen een sterke cytoplasmatische GFP expressie. Ectodermale cellen worden ook gelabeld met cytoplasmatische GFP (e). Veel Annexin V positieve cellen worden gezien binnen en buiten het CZS. Om de engulfment evenement te volgen is niet gemakkelijk. We gemarkeerd een gebeurtenis met een witte rechthoek waarin een gliacel wordt overspoelt een apoptotische deeltje. Let op de indringende gedrag van de gliale cel: het aanraken van de apoptotische deeltje een paar keer zonder overspoelt het en dan te eindigen met engulfment van de Annexine V gelabelde apoptotische cellen (Figuur 2
Extra markers voor verschillende apoptotische fasen gebruikt kunnen worden met dezelfde procedure.
Figuur 1. Schematische weergave van embryo voorbereiding voor micro-injecties. A. Een microscopisch preparaat met daarin een stukje agar waarop embryo's worden overgedragen na dechorionation. Ongeveer 20 embryo's worden in lijn geplaatst, dicht bij de rand van de agar stuk met hun buikzijde op voor beeldvorming het CZS. B. Een dekglaasje met een strook heptaan lijm in het midden. C. Het dekglaasje van B met embryo het heptaan lijmstrook bevestigd.
Figuur 2. Dynamische analyse van apoptotische cel klaring. Time-lapse opnames van apoptotische cel klaring in een stadium 15 embryo. Glia (g), macrofagen (m) en ectoderm (e) zijn voorzien van simulatie-cytGFP (groen). Apoptotische cellen zijn gemarkeerd met de fluorescerende annexine V (rood). A. Geselecteerde frames uit een representatieve film worden getoond. Een gliacellijn overspoelt een apoptotische cel wordt weergegeven door een rechthoek. B. Close-up uitzicht op de gemarkeerde rechthoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apoptotische cel klaring is een kritieke laatste fase van apoptose, die zeer dynamisch. Daarom real time studie van het proces van het grootste belang. Hier een protocol dat het toezicht van apoptotische cel klaring maakt in levende ontwikkelen Drosophila embryo's beschrijven we. In deze procedure moet twee populaties van cellen gekleurd met specifieke merkers: apoptotische cellen en fagocyten. Het simuleren cytGFP reporter is geschikt voor het bewaken fagocytische macrofagen, glia en ectoderm gelijktijdig in dezelfde embryo, d ie maakt het mogelijk verschillende fagocytische celpopulaties volgen tegelijk. Dit is een groot voordeel voor het bestuderen van 'professionele' en 'niet-professionele' klaring gelijktijdig, specifieke aspecten van het proces, zoals snelheid, specificiteit en degradatie vermogen vergelijken. Een nadeel van deze benadering is dat simuleren cytGFP marker zeer sterk uitgedrukt in macrofagen en veel zwakkerglia, die lastig te passen in dezelfde film kan zijn. Echter, men kan het imago van apoptotische cel klaring door macrofagen los van dit proces in het centraal zenuwstelsel, door het rijden GFP expressie met specifieke Gal4s (CRQ-Gal4 voor macrofagen en repo-Gal4 voor glia).
Verschillende merkers voor apoptotische cellen, waarbij specifieke moleculaire en morfologische veranderingen zijn van grote waarde voor het begrijpen van de dynamiek en de omkeerbaarheid van apoptose en cel klaring. Bovendien real time opname van apoptotische cel klaring met behulp van deze markers voeg extra informatie over mutantfenotypes, die niet kan worden bereikt door toepassing van gebruikelijke technieken in vaste immunohistochemie embryo.
De lastigste stap van de beschreven protocol bij het printen de ontwikkelende CZS, is het uiterst nauwkeurige positionering van de embryo voor injectie. Zelfs een lichte beweging van het dekglaasje tijdens bevestiging van de voorbereides naar de lijm kan hun positie, wat niet voor beeldvorming het CNS zou veranderen. Het embryo bevestigen stap moet worden gedaan met maximale aandacht.
Ontwikkeling van aanvullende merkers voor specifieke fasen van apoptose en fagocytose zou zeer wenselijk voor fijnere dissectie en mogelijke manipulatie van apoptotische cel klaring. Het protocol hier gepresenteerde dient als een goede basis voor de toekomstige ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Marie Curie Reïntegratie Grant (IRG249084). Wij danken alle leden van de Kurant laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A.
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
