Brug High Resolution Computed Tomography at visualisere de tredimensionelle struktur og funktion af dyrs vaskulatur

Summary

Høj opløsning røntgen computertomografi (HRCT) er en ikke-destruktiv diagnostisk billeddannelsesteknik, som kan anvendes til at studere strukturen og funktionen af ​​plante vaskulatur i 3D. Vi viser, hvordan HRCT letter udforskning af veddet netværk på tværs af en bred vifte af plantevæv og-arter.

Abstract

Høj opløsning x-ray computertomografi (HRCT) er en ikke-destruktiv diagnostisk billeddannelse teknik, med sub-micron opløsning kapacitet, der nu bruges til at evaluere strukturen og funktionen af anlægget xylem netværk i tre dimensioner (3D) (f.eks Brodersen et al . 2010; 2011; 2012a, b). HRCT billeddannelse er baseret på de samme principper som medicinsk CT-systemer, men en høj intensitet synkrotron x-ray kilde resulterer i højere rumlig opløsning og faldt billede erhvervelse tid. Her vil vi vise i detaljer, hvordan synkrotron-baserede HRCT (udføres på Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) i kombination med Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) bliver brugt til at udforske plante xylem i udskårne væv og levende planter. Dette nye imaging værktøj giver brugerne mulighed for at bevæge sig ud over traditionelle statiske, 2D lys eller elektronmikrofotografier og studere prøver ved hjælp af virtuelle serielle sektioner i ethvert plan. Et uendeligt antal skiver i en retning cen ske på den samme prøve, en funktion, der er fysisk umuligt anvendelse af traditionelle mikroskopi metoder.

Resultaterne viser, at HRCT kan anvendes på både urteagtige og træagtige plantearter, og en række planteorganer (dvs. blade, bladstilke, stængler, stammer, rødder). Tallene her bidrager til at påvise både en række repræsentative plante vaskulær anatomi og typen af detaljer udvundet af HRCT datasæt, herunder scanninger for kysten redwood (Sequoia sempervirens), valnød (Juglans spp.), Eg (Quercus spp.), Og ahorn ( acer spp.) plantemateriale til træer til solsikker (Helianthus annuus), vindruer (Vitis spp.), og bregner (Pteridium aquilinum og Woodwardia fimbriata). Udskåret og tørrede prøver fra træsorterne er lettest at scanne og typisk giver de bedste billeder. Imidlertid har de seneste forbedringer (dvs. hurtigere scanninger og prøve stabilisering) gjort det possenelig at bruge denne visualisering teknik på grønne væv (f.eks bladstilke) og i levende planter. Ved lejlighed nogle krympning af hydratiserede grønne plantevæv får billeder til at sløre og metoder til at undgå disse problemer er beskrevet. Disse nylige fremskridt med HRCT giver lovende nye indsigter i plante vaskulære funktion.

Introduction

Vandet transporteres fra planterødder til bladene i en karvæv kaldet xylem – et netværk af indbyrdes forbundne ledninger, fibre og levende, metabolisk aktive celler. Transport funktion af plante xylem skal opretholdes til at levere næringsstoffer og vand til blade til fotosyntese, vækst og i sidste ende overlevelse. Vand transport i veddet ledninger kan blive forstyrret, når veddet netværket kompromitteret af patogene organismer. Som svar på disse infektioner planter ofte producerer geler, gummier og tyloses som et middel til at isolere patogen spredning (f.eks McElrone et al 2008; 2010). Tørke stress kan også begrænse vandtransport i veddet. Som planter mister vand under langvarig tørke, spænding bygger i veddet saft. Vand under spænding er metastabile (dvs. ved en vis tærskel spændingen bliver stor nok til at kavitere vand kolonner i xylem ledninger). Efter kavitation opstår, kan en gas boble (emboli) danne og udfylde conduit, effektivt blokerer vandbevægelse (Tyree og Sperry 1989), et fænomen, analog med dykkersyge (dvs. "de bøjer sig") i dybe hav dykkere.

Trods betydningen af veddet vandtransport for optimal plante funktion påvist via et stort system af historisk og nutidig litteratur om dette emne (Tyree & Zimmermann, 2002;. Holbrook et al, 2005), er der stadig aspekter af veddet netværk, der forbliver undvigende . Flere forskergrupper har for nylig begyndt at anvende Høj opløsning x-ray computertomografi mikro-tomografi (HRCT) for at evaluere finere detaljer i træ anatomi og karvæv (f.eks Mayo et al; 2010, 2008; Mannes m.fl. 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012a, b; Maeda og Miyake, 2009; Steppe et al 2004).. HRCT er en destruktiv teknik, der anvendes til at visualisere funktioner i det indre af faste genstande og opnå digital information om deres 3D-strukturelle egenskaber. HRCTafviger fra konventionel medicinsk CAT-scanning i sin evne til at opløse detaljer så små som en mikron i størrelse, selv for high density objekter. Nylige fremskridt inden synkrotron HRCT-teknologi har forbedret billedopløsning og signal-støj-forholdet tilstrækkeligt, således at plante fartøj net og intervessel forbindelser kan visualiseres, tildelt 3D koordinater, og eksporteres til hydrauliske modelsimuleringer. Brodersen et al. (2011) for nylig fremført denne teknik ved at kombinere 3D rekonstruktioner genereret af synkrotron HRCT med et Fortran-model, der automatisk trækker data fra veddet netværk på meget højere opløsning end nogensinde var muligt med traditionelle anatomiske metoder (dvs. seriel sektionering med en microtome og billedoptagelse med lysmikroskopi, f.eks Zimmermann 1971). Dette arbejde er også blevet brugt til at optimere hydrauliske modeller af veddet, og identificeret unikke egenskaber transport (dvs. reverse flow i nogle vessels i perioder med spidsbelastning transpiration) (Lee et al., i gennemgang).

Synkrotron HRCT kan nu anvendes til at visualisere xylem funktionalitet, følsomhed over for kavitation, og en planternes evne til at reparere emboliserede ledninger. Manglende genetablere flow i emboliserede ledninger reducerer hydraulisk kapacitet, grænser fotosyntese, og resulterer i plante død i ekstreme tilfælde (McDowell et al. 2008). Planter kan klare emboli ved at omdirigere vand omkring blokeringer via gruber forbinder tilstødende funktionelle kanaler, og ved at dyrke nye xylem til at erstatte tabt hydraulisk kapacitet. Nogle planter har evnen til at reparere brud i vandet kolonner, men detaljerne i denne proces i veddet under spænding er forblevet uklart i årtier. Brodersen et al. (2010) for nylig visualiseret og kvantificeret genpåfyldning proces i levende vinstokke med HRCT. Vellykket fartøj genpåfyldning var afhængige af vand tilstrømning fra levende celler omgiver xylem ledninger, hvor individuelle vanddråber udvidet med tiden, fyldte kar og tvang opløsningen af ​​indesluttet gas. Kapaciteten af ​​forskellige planter til at reparere kompromitterede xylem fartøjer og de mekanismer, der styrer disse reparationer er i øjeblikket ved at blive undersøgt.

Beskrivelse af ALS facilitet beamline 8.3.2

Vores arbejde til dato er blevet udført på Hard X-ray Micro-Tomography beamline 8.3.2 på Advanced Light Source i Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA). Plant prøver anbringes i en bly-foret Hutch ligger 20 m fra x-ray kilde, der genereres af en 6 Tesla superledende bend magnet dipol inden for Advanced Light Source elektron lagerring opererer på et kritisk energi på 11,5 KeV. En skematisering af endestationen er vist i figur 1.. De røntgenstråler ind i bur med en stråle størrelse på 40x ~ 4,6 mm og passerer gennem prøven, der er monteret på en motoriseret roterende fase. Dentransmitterede røntgenstråler kolliderer med en krystal scintillator (to materialer, der almindeligvis anvendes, er LuAG eller CdWO _4), som omdanner røntgenstråler til synligt lys, som videresendes via linser over på en CCD til billedsamling. Kameraet, scintillator og optik er indeholdt i en lystæt boks, der er på skinner, der gør det muligt for prøve-til-scintillator afstand kan optimeres til fasekontrast billeddannelse.

Alle prøver er monteret på 10 cm diameter roterende fase, som igen er monteret på horisontale og vertikale oversættelse faser for prøve positionering. En levende plante prøve, med rodsystemet monteret i et specialbygget anlæg grydelap og løvet indeholdt i en akryl rør, kan ses i figur 2. Typiske eksponeringstider kan variere fra 0,1 til 1 sekund ved hjælp 10-18 KeV, og scanning varighed vil variere fra 5 til 40 minutter afhængigt af indstillingerne optimeret til en bestemt prøve. For høje prøver (typisk af plantebeskyttelsesmidler xylem net), kan data scanninger værefliser ved at gentage målingen med prøven i forskellige højder, som styres automatisk, så sømløse serielle sektioner langs en maksimal prøve højde på ~ 10 cm. Største prøve bredde, når billedbehandling på 4,5 um opløsning er ~ 1 cm for prøver, der er næsten perfekt i lodret retning. Datagenerering og forarbejdningen er afsluttet brug af protokollen anført nedenfor. På grund af forskellen i x-ray dæmpning mellem luft og vand, kan fremragende billedkontrast opnås i planter uden anvendelse af kontrastmidler opløsninger typiske medicinske CT-systemer. Det luftfyldte karhulrummet er let at skelne fra den omgivende vandfyldte væv i hydratiserede planter.

Protocol

Protokol detaljer beskrevet nedenfor, blev skrevet specielt til arbejde på Advanced Light Source 8.3.2 beamline. Tilpasninger kan være påkrævet for arbejde på andre synkrotron faciliteter. Korrekt sikkerhed og strålingsbeskyttelse uddannelse er nødvendig for anvendelsen af ​​disse faciliteter. 1. Sample Preparation for Levende Planter Dyrke planter i ~ 10 cm diameter pots, og sikre, at hovedstammen (eller del af planten, der skal scannes), som er centreret som muligt og…

Representative Results

Synchotron HRCT scanninger er blevet gennemført med succes på en bred vifte af plantevæv og-arter ved hjælp af beamline 8.3.2 (figur 5), og har givet ny indsigt i struktur og funktion af plante xylem på hidtil uset opløsning i 3D. Visualisering og udforskning kapaciteter tilvejebragt af 3D rekonstruktioner (som illustreret i figur 6-8, og film 1-3) giver mulighed for præcis bestemmelse af placering og orientering af strukturer med veddet netværk på begge udskårne prøver og i …

Discussion

Synchotron HRCT giver plantebiologer med en stærk, ikke-destruktiv værktøj til at udforske de indre funktioner af plante vaskulatur i utrolige detaljer. Denne teknologi er blevet brugt for nylig til at identificere tidligere ubeskrevet anatomiske strukturer i Grapevine xylem der differentielt ændrer xylem netværksforbindelse i forskellige vinavlsprodukter arter (Brodersen et al 2012b, i pressen.) – Dette tilslutningsmuligheder kan drastisk ændre evne vaskulære patogener og emboli at sprede destr…

Materials

Material Name/Equipment	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
			See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2