Utilisation à haute résolution tomodensitométrie pour visualiser la structure tridimensionnelle et la fonction des vaisseaux sanguins des végétaux

Summary

Haute résolution x-ray tomodensitométrie (TDM-HR) est une technique non destructive d'imagerie diagnostique qui peut être utilisée pour étudier la structure et la fonction des vaisseaux des plantes en 3D. Nous montrons comment HRCT facilite l'exploration des réseaux du xylème dans un large éventail de tissus et espèces végétaux.

Abstract

Haute résolution x-ray tomodensitométrie (TDM-HR) est une technique non destructive d'imagerie diagnostique avec capacité de résolution inférieure au micron qui est maintenant utilisé pour évaluer la structure et la fonction de réseau du xylème des plantes en trois dimensions (3D) (par exemple Brodersen et al . 2010; 2011; 2012a, b). HRCT imagerie est basée sur les mêmes principes que les systèmes médicaux CT, mais une forte intensité de résultats synchrotron source de rayons X à haute résolution spatiale et une diminution du temps d'acquisition d'images. Ici, nous démontrons en détail comment synchrotron à base HRCT (effectué à l'avancée Source lumineuse LBNL-Berkeley, CA, USA) en combinaison avec le logiciel Avizo (VSG Inc, Burlington, MA, USA) est utilisé pour explorer le xylème des plantes dans tissu excisé et plantes vivantes. Ce nouvel outil d'imagerie permet aux utilisateurs de se déplacer au-delà statique traditionnelle, la lumière 2D ou micrographies électroniques et des échantillons d'étude en utilisant des coupes en série virtuels dans n'importe quel plan. Un nombre infini de coupes de tous les c orientationun être effectuées sur le même échantillon, une caractéristique qui est physiquement impossible à l'aide des méthodes de microscopie traditionnels.

Les résultats démontrent que HRCT peut être appliqué à la fois les espèces herbacées et ligneuses, et une gamme des organes végétaux (feuilles, pétioles, c.-à-tiges, troncs, racines). Les chiffres présentés ici aider à démontrer à la fois une gamme d'anatomie des plantes vasculaires représentant et le type de détail extraites de bases de données, y compris les analyses HRCT de séquoia (Sequoia sempervirens), noyer (Juglans spp.), Le chêne (Quercus spp.) Et l'érable ( jeunes arbres Acer spp.) aux tournesols (Helianthus annuus), la vigne (Vitis spp.), et les fougères (Pteridium aquilinum et Woodwardia fimbriata). Échantillons excisés et séché à partir des espèces ligneuses sont plus faciles à analyser et généralement d'obtenir les meilleures images. Cependant, des améliorations récentes (c.-à-scans plus rapides et la stabilisation de l'échantillon) ont rendu possble d'utiliser cette technique de visualisation des tissus écologiques (p. ex pétioles) et en plantes vivantes. À l'occasion de rétrécissement des tissus hydratés plantes vertes fera images de flou et les méthodes pour éviter ces problèmes sont décrits. Ces avancées récentes avec HRCT offrir de nouvelles perspectives prometteuses dans la fonction vasculaire des plantes.

Introduction

L'eau est transportée des racines des plantes aux feuilles dans un tissu vasculaire appelé xylème - un réseau de conduits interconnectés, de fibres et de vie, les cellules métaboliquement actives. Fonction de transport du xylème des plantes doit être maintenue pour fournir des éléments nutritifs et de l'eau sur les feuilles pour la photosynthèse, la croissance et la survie en fin de compte. Transport de l'eau dans les conduits du xylème peut être perturbé lorsque le réseau du xylème est compromise par des organismes pathogènes. En réponse à ces plantes produisent souvent des infections des gels, des gencives et thylles comme un moyen d'isoler la propagation des agents pathogènes (par exemple McElrone et al 2008; 2010). Le stress hydrique peut également limiter le transport de l'eau dans le xylème. Comme les plantes perdent de l'eau en période de sécheresse prolongée, la tension monte dans la sève du xylème. Eau sous tension est métastable (c'est à dire à un certain seuil la tension devient suffisamment grande pour cavitation colonnes d'eau contenues dans les conduits du xylème). Après cavitation, une bulle de gaz (embolie) peuvent se former et remplir les conduit, le mouvement de l'eau bloquant (Tyree et Sperry 1989), un phénomène analogue à la maladie de décompression (c.-à-«bends») chez les plongeurs en eaux profondes.

En dépit de l'importance du transport hydrique du xylème pour la fonction optimale de l'installation tel que démontré par un vaste corpus de littérature historique et contemporain sur ce sujet (Tyree et Zimmermann, 2002;. Holbrook et al, 2005), il ya encore des aspects de réseaux xylème qui restent insaisissables . Plusieurs groupes de recherche ont récemment commencé à utiliser à haute résolution des rayons X micro-tomographie informatisée (TDM-HR) pour évaluer les moindres détails de l'anatomie du bois et des tissus vasculaires (par exemple, Mayo et al; 2010, 2008; Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012a, b; Maeda et Miyake, 2009; Steppe et al 2004).. HRCT est une technique non destructive utilisée pour visualiser les caractéristiques de l'intérieur de corps solides et à obtenir des informations numériques sur les 3-D des propriétés structurelles. HRCTdiffère de classiques CAT-imagerie médicale dans sa capacité à résoudre des détails aussi petits qu'un micron, même pour des objets à haute densité. Les progrès récents dans la technologie synchrotron HRCT ont amélioré la résolution d'image et de rapport signal sur bruit suffisamment pour que les réseaux et les connexions des navires de plantes intervasculaires peuvent être visualisés, attribué des coordonnées 3D, et exportées pour des simulations de modèles hydrauliques. Brodersen et al. (2011) a récemment avancé cette technique en combinant des reconstructions 3D générés par synchrotron HRCT avec un modèle Fortran qui extrait automatiquement les données du réseau xylème à une résolution beaucoup plus élevée que ne l'était jamais possible avec les méthodes traditionnelles anatomiques (ie coupe de série avec un microtome capture d'image et en microscopie optique, par exemple, Zimmermann, 1971). Ce travail a également été utilisé pour optimiser les modèles hydrauliques du système de xylème et identifié des caractéristiques uniques de transport (flux inverse c'est à dire dans une certaine vexelles pendant les périodes de pointe de la transpiration) (Lee et al., en révision).

Synchrotron HRCT peut maintenant être utilisé pour visualiser les fonctionnalités du xylème, la sensibilité à la cavitation et la capacité d'une des plantes pour réparer les conduits embolisés. Le défaut de rétablir la circulation dans les conduits embolisés réduit la capacité hydraulique, photosynthèse limites, et entraîne la mort des plantes dans des cas extrêmes (McDowell et al. 2008). Les plantes peuvent faire face à une embolie en détournant l'eau autour des blocages via connexion fosses adjacentes conduits fonctionnels, et par la croissance du xylème pour remplacer la perte de capacité hydraulique. Certaines plantes possèdent la capacité de réparer les ruptures dans les colonnes d'eau, mais les détails de ce processus dans le xylème sous tension sont restés clair depuis des décennies. Brodersen et al. (2010) a récemment visualisés et quantifiés dans le processus de remplissage vignes en direct en utilisant HRCT. Navire succès remplissage dépend de l'apport d'eau à partir de cellules vivantes entourant le xyllui conduits, où des gouttelettes d'eau individuelles développées au fil du temps, des navires remplis, et forcé la dissolution du gaz piégé. La capacité des usines différentes pour réparer les vaisseaux du xylème compromis et les mécanismes de contrôle de ces réparations sont actuellement à l'étude.

Description de l'installation de la SLA Beamline 8.3.2

Notre travail à ce jour a été effectuée sur le Hard X-ray micro-tomographie Beamline 8.3.2 à la source de lumière avancée à Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA). Des échantillons de plantes sont placées dans une cage plombée situé à 20 m de la source de rayons X, généré par un aimant 6 Tesla courbure dipôle supraconducteur à l'intérieur de la Source de Lumière exploitation avancée anneau d'électrons de stockage à une énergie critique de 11,5 keV. Un schéma de la station terminale est illustré à la figure 1. Les radiographies entrer dans la huche avec une taille de faisceau de 40x ~ 4,6 mm et de passer à travers l'échantillon qui est monté sur une platine motorisée en rotation. Latransmis les rayons X empiètent sur ​​un cristal scintillateur (deux matériaux couramment utilisés sont LuAG ou CdWO ₄₎ qui convertit les rayons X en lumière visible qui est transmise par l'intermédiaire de lentilles sur un capteur CCD de collecte d'image. L'appareil photo, et l'optique de scintillateur sont contenus dans une boîte étanche à la lumière qui est sur des rails qui permettent la distance échantillon-à-scintillateur à être optimisé pour l'imagerie à contraste de phase.

Tous les échantillons sont montés sur l'étage 10 cm de diamètre tournant à son tour est monté sur des platines de translation horizontale et verticale pour le positionnement de l'échantillon. Un échantillon de plante vivante, avec le système racinaire monté dans un support adapté usine construite pot et le feuillage contenue dans un tube acrylique, on peut le voir dans la figure 2. Temps d'exposition typiques peuvent aller de 0,1 à 1 sec utilisant 10-18 keV, et les durées de balayage iront de 5 à 40 min en fonction des paramètres optimisés pour un échantillon particulier. Pour les échantillons de grande taille (typiquement des réseaux xylème des plantes), des analyses de données peuvent êtrecarrelage en répétant la mesure de l'échantillon à des hauteurs différentes, qui est commandé automatiquement, sans soudure, en permettant des coupes en série le long d'une hauteur maximale de l'échantillon de ~ 10 cm. Largeur maximale de l'échantillon lorsque l'imagerie à 4,5 um résolution est de ~ 1 cm pour des échantillons qui sont presque parfait en position verticale. Génération et traitement des données est réalisée en utilisant le protocole ci-dessous. En raison de la différence de x-ray atténuation entre l'air et l'eau, excellent contraste d'image peut être obtenue de plantes sans l'utilisation de solutions de contraste typique des systèmes CT médicaux. La lumière du vaisseau rempli d'air se distingue aisément de la rempli d'eau entourant les tissus des plantes hydratées.

Protocol

Détails du protocole décrit ci-dessous ont été écrits spécifiquement pour le travail à l'Advanced Light Source 8.3.2 ligne de lumière. Des adaptations peuvent être nécessaires pour le travail dans les installations de rayonnement synchrotron autres. De sécurité et une formation appropriée rayonnement est nécessaire pour l'utilisation de ces installations.

1. Préparation des échantillons des plantes vivantes

1. Pousser des plantes dans des pots de 10 ~ cm de diamètre, et de veiller à ce que la tige principale (ou une partie de la plante à numériser) est aussi centré que possible et orienté verticalement dans le pot. Les dimensions physiques de l'instrument HRCT huche aux limites avancée Source de Lumière plantes vivantes à ~ 1 m de hauteur. En conséquence, l'imagerie de plantes vivantes est préférable d'effectuer le semis / plants cultivés dans des petits pots. Selon l'expérience, différents types de sols peuvent être utilisées pour contrôler l'humidité du sol (par exemple, dans les expériences de la sécheresse) et pour certaines plantes avec des pousses flexibles (par exemple vignes) pousses plus longues peuvent être soigneusement tutoyercked dans le tube acrylique décrit ci-dessous (voir les figures 1 et 2).
2. Monter les plantes vivantes en pot dans un support sur mesure en aluminium rigide pot. La hauteur de la plaque supérieure peut être ajustée pour tenir compte d'une gamme de hauteurs pot. La partie supérieure de la plaque est conçue pour s'aligner sur le haut de la surface du sol et les plantes en saillie du centre de la plaque en deux parties. Le but de la manique est d'assurer la tige de la plante est maintenu fermement en place pour minimiser les vibrations ou le mouvement de l'échantillon. Minimiser les mouvements échantillon lors d'une analyse est essentielle.
3. Une fois monté dans le support, mesurer le potentiel hydrique de tige ou de la transpiration foliaire à l'aide d'une chambre de pression Scholander style ou une pince poromètre feuille, respectivement, pour déterminer l'état physiologique de la plante avant la numérisation.
4. Placer un cylindre à paroi mince acrylique sur l'usine et sur le dessus du support de l'usine d'aluminium et fixez-le en place avec de l'argile à mastic pour stabiliser leéchantillon (figure 2). Toute vibration ou déplacement du feuillage supérieur sont transmis sur la tige et provoquer le tissu végétal à l'intérieur de la zone balayée pour déplacer, conduisant finalement à la distorsion d'image. Le cylindre est utilisé pour contenir le feuillage des plantes et empêcher les feuilles des plantes de se frotter contre d'autres pièces d'équipement dans le clapier qui aboutiraient à des vibrations pendant un balayage. Une pellicule de plastique supplémentaires, des serviettes en papier et le ruban doit être utilisé pour réduire encore les vibrations et le mouvement des parties de la plante (voir les problèmes associés au mouvement exemple de la figure 4). Afin de réduire son absorption des rayons X (qui peut diminuer la qualité d'image à une durée d'exposition donnée), le cylindre contenant doit avoir des parois minces que possible tout en conservant une rigidité suffisante pour remplir sa fonction.
5. Fixer le support de pot personnalisé à l'étape de coussin d'air et le verrouiller (vis) en place entre la source de rayons X et le détecteur d'imagerie et matériel photographique. Positisur la tige aussi vertical que possible et au centre de mandrin de base magnétique de sorte que l'échantillon reste dans le champ de vision lors de la rotation.

2. Préparation de l'échantillon pour Fresh, tissus végétaux excisés

1. Matériel végétal frais, généralement des tiges ou des pétioles, peuvent être scannées après le retrait immédiat d'une plante vivante. Si l'objectif de l'expérience est de visualiser l'ensemble du réseau du xylème, eau dans les récipients doivent être entièrement évacué et remplacé par de l'air. Pour ce faire, monter l'échantillon dans une chambre de pression Scholander style et pousser l'air comprimé ou de l'azote à travers l'échantillon à basse pression (<0,05 MPa) pendant environ 5 min. Espèces diffèrent dans le temps nécessaire pour évacuer le réseau vasculaire. Si l'intention est d'évaluer le degré de formation embolie dans le tissu végétal frais, puis des échantillons d'accise de l'usine à l'aide d'une lame de rasoir propre et faire les coupes sous l'eau.
2. Envelopper l'échantillon dans une couche de Parafilm à prdessiccation cas lors de l'analyse.
3. Monter l'échantillon dans un forage de mandrin fixé à une plaque de métal qui est vissée dans l'étape de coussin d'air. Centre et orienter l'échantillon verticalement comme décrit ci-dessus pour assurer l'échantillon reste dans le champ de vision.

3. Préparation de l'échantillon pour les tissus ligneux séchés

1. Pour la visualisation des tissus optimale de l'échantillon et de contraste de l'image, il est nécessaire de déshydrater lentement l'échantillon boisé ensemble des tissus. Couper les échantillons d'environ 6 cm de longueur. Sélectionner des échantillons qui sont aussi rectiligne que possible dans la région de balayage cible et ont un diamètre ≤ 1 cm.
2. Placer l'échantillon de tissu ligneux dans un four de séchage à basse température pour sécher lentement l'échantillon sans provoquer de fissuration ou de séparation du tissu. Ce processus est susceptible de varier entre les espèces et les tissus. Pour les tiges ligneuses, de 12 h dans un four à 40 ° C est généralement suffisante pour fournir un excellent contraste sans causer d'importantes changes dans la structure physique de la tige (voir les problèmes avec un séchage rapide démontré dans la figure 3).
3. Dans certaines situations, il est souhaitable d'avoir un marqueur de fiduciaire au sein de l'échantillon tel que la dissection ultérieure et la visualisation microscopie électronique à balayage peut être orienté vers des points spécifiques de l'image HRCT. Pour ce faire, apposer un métal ou de verre ou de fil à l'extérieur de la tige à l'aide Parafilm. Une autre méthode consiste à utiliser une résine de silicone (RTV-141 par exemple, Bluestar Silicones, East Brunswick, NJ) qui peut être injecté dans une conduite xylème unique (voir les exemples dans Brodersen et al 2010). Une fois durcie, la résine de silicone est clairement visible dans l'échantillon et les distingue facilement des autres bateaux remplis d'air. Utilisez ce marqueur pour localiser précisément les régions spécifiques de l'échantillon.
4. Monter l'échantillon dans le mandrin de perçage et de centre comme décrit ci-dessus.

4. Préparation de l'échantillon pour Leaf Tissue pour les deux dimensions (2D) Radiographies

1. Pour visualiser le contenu des navires dans les feuilles en quasi-temps réel, les feuilles peuvent être scannées pour produire un radiogramme 2D, semblable à une radiographie dentaire. Monter la feuille entre deux feuilles de plastique acrylique mince, et fixer les bords avec des pinces. Fixez ensuite l'échantillon monté sur un système de post-porte et la position de la carte de test optique à côté du système d'imagerie et de radiologie source.

5. Numérisation de l'échantillon dans la Hutch 8.3.2

1. Décidez le grossissement qui fonctionnera le mieux pour votre application. SLA Beamline 8.3.2 a la capacité de numériser des lentilles avec un grossissement de 2x, 5x, et 10x. Il en résulte des tailles de pixel d'image de 4,5, 2,25 et 0,9 um, respectivement. Selon l'agrandissement, l'échantillon doit être de taille appropriée, comme le champ de vision diminue avec l'augmentation de grossissement. Voir les détails pour le choix de la caméra et de l'objectif et les paramètres d'image résultante dans le tableau 1.

	PCO.4000 (4008x2672)		PCO.Edge (2560x2160) (Optique Peter)
Lentille	pixel (pm)	champ de vision (mm)	pixel (pm)	champ de vision (mm)
10x	0,9	3,6	0.65 (0.69)	1.7 (1.7)
5x (4x)	1,8	7,2	1.3 (1.72)	3.3 (4.4)
2x	4,5	18	3.25 (3.44)	8.3 (8.8)
1x	9	36	6,5 (-)	16,6 (-)

Détails Tableau 1. Concernant disponiblecaméras et objectifs de la SLA 8.3.2.

2. Réglez l'énergie des rayons X à 15 keV. Ceci a été montré pour offrir un contraste d'image excellente pour la plupart des applications végétales (voir Brodersen et al. 2010, 2011, 2012a, b). Les temps d'exposition sont généralement fonction de l'épaisseur et de la densité de l'échantillon (et donc le grossissement utilisé) compris entre 100 et 1.000 ms. Temps d'exposition plus longs (tant que pixels détecteurs ne sont pas saturés) entraînera généralement plus le rapport signal sur bruit, mais au prix d'une augmentation des temps de scan.
3. Choisissez un incrément angulaire qui est approprié pour votre application. Les échantillons sont tournées de 180 ° lors d'une analyse, et le nombre d'images prises lors de la rotation peut avoir un impact significatif sur la taille du jeu de données, la longueur de l'intervalle de balayage, et la qualité de l'image finale, mais il ya généralement des rendements décroissants de la qualité. Balayages typiques sont effectués à incréments de 0,25 °, ce qui donne 721 images par balayage. Diminuer les incrét à 0,125 ° les résultats dans de meilleures images pour visualiser les détails fins, mais les rendements 1440 des images et donc un ensemble de données beaucoup plus grande (pour une région typique de l'intérêt, cela signifie ~ 10-30 Go de données par rapport à 5 Go). Toutefois, le rapport signal sur bruit est souvent améliorée et la valeur à la fois le temps de cycle a augmenté et la taille des données. Tiges sèches qui sont peu susceptibles de se déformer / rétrécir lors d'une analyse peut être soumise à des intervalles plus longs (plus petit incrément angulaire) sans porter préjudice. Lorsque les plantes d'imagerie en direct, où les processus biologiques (réparation embolie, par exemple) se déroulent sur ​​des échelles de temps courtes, en optant pour les courts intervalles de balayage est préférable de limiter les effets potentiellement néfastes de rayons X sur ce tissu-bien que cela arrive à un risque de perte de qualité de l'image. Plus courts intervalles de balayage peut être obtenu en utilisant le paramètre de tomographie en continu au cours de laquelle l'échantillon tourne de façon continue pendant que les images sont capturées.
4. Pour chaque analyse, "champ clair" et "foncé" sur le terrain les images doivent être Corrected. Images de champ lumineux sont des images sans l'échantillon dans le faisceau. Ceux-ci sont souvent collectées avant et après l'analyse de l'échantillon par translation horizontale de l'échantillon. Champs sombres sont collectées par la fermeture de la radiographie obturateur cette mesure la quantité de signal de la caméra montre avec aucun des radiographies.

6. Traitement de l'information

1. Transférez les "premières" images 2D. TIF, qui ont été exportés à partir de l'ordinateur d'acquisition d'un serveur de fichiers, d'un ordinateur de traitement de données. Si l'ordinateur dispose de suffisamment de RAM, les données peuvent être copiées sur un soi-disant «Disque RAM" (une partie de la RAM apparaît comme un disque dur sur l'ordinateur). De cette façon, le logiciel n'a pas besoin d'accéder à un lecteur de filature dur, ce qui est relativement lent par rapport à un lecteur à état solide ou mémoire flash. Cette étape permet de réduire considérablement la quantité de temps nécessaire pour traiter des données.
2. Les images doivent être convertis en une échelle de transmission pour cent. Beamline 8.3.2 a une ba personnaliséenormalisation ckground plug-in qui peut être téléchargé et utilisé avec les logiciels librement disponibles ou ImageJ Fidji ( http://fiji.sc/ ). Il soustrait les chiffres de sombres des images et normalise les images de l'échantillon par les champs lumineux pour produire des images qui montrent la transmission pour cent. Charger les images normalisées dans le logiciel Octopus ( http://www.inct.be/en/software/octopus ) et «reconstruire» l'ensemble de données 3D à partir des premières 2D. TIF fichiers en utilisant les étapes de traitement désignés (Normaliser images, la suppression anneau sinogramme création, la reconstruction faisceau parallèle). Ce procédé donne ensuite une série de. TIF transversale (transversale) des images composées de "voxels" (éléments de pixels volumétriques), chacune avec une des valeurs de x, y, z de coordonnées et l'intensité représentant le coefficient de x-ray absorption linéaire.

7. Visualisation

1. Visualisaze la pile d'images de l'une d'une variété de progiciels. Freeware (par exemple Drishti, http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml ) peut être utilisé pour visualiser les volumes ou individuels ou des piles d'images (par exemple ImageJ ou FIDJI). Les autres logiciels peuvent être utilisés pour la visualisation 3D. Notre groupe de recherche utilise le logiciel Avizo ( http://www.vsg3d.com/avizo/overview ), mais d'autres comme Amira ( http://www.amira.com/ ) et VGStudioMax ( http://www. volumegraphics.com / ) sont aussi couramment utilisés.
2. Chargez ensembles de données dans la mémoire système et afficher l'échantillon virtuel transversal, longitudinal ou orientations tranches radiales. En raison des attributs du jeu de données 3D, coupes virtuelles à travers le sample peut être tourné dans n'importe quel plan de s'aligner sur les régions d'intérêt, une amélioration significative par rapport microscopie optique traditionnelle de série (voir Films 1-3 pour des exemples détaillés).
3. À visualiser l'échantillon en fonction des besoins en 3D, "segment" l'échantillon en utilisant la série de routines semi-automatiques et manuelles à Avizo lumens pour séparer des navires ou d'autres structures du tissu environnant. Se réfère à la segmentation définissant les limites entre des objets d'intérêt, ou les séparant ainsi la segmentation en régions distinctes. Volumes de rendu en 3D est réalisée par le logiciel de visualisation. Une méthode pour le faire est rendu volumique direct, où chaque point dans un volume est supposé émettre et absorber la lumière, la quantité et la couleur d'émission et d'absorption peuvent être définies à l'aide d'une "palette de couleurs", et la projection résultant dans une direction donnée est affiché sur l'écran. Alternativement, un fil de fer ou de la surface maillage 3D représentant les limites segmentés est construit pour montrer un modèle 3D de til structure d'intérêt. Le maillage 3D est composé d'éléments polygonaux, et le nombre total d'éléments affecte à la fois la structure de fidélité de la reproduction et de la taille du fichier de données associé (c'est à dire des éléments plus conduit à une plus grande fidélité mais de plus grande taille de fichier). Une variété de modules de traitement d'image sont disponibles dans le logiciel de visualisation pour contrôler les sorties de rendu de volume, ainsi que le contrôle de luminosité, le contraste, la transparence, la réduction du bruit, etc

8. Quantification

1. Une fois la segmentation a été accompli, il est possible de quantifier les structures végétales cibles ou des changements fonctionnels dans le volume, la longueur, la largeur, la présence ou l'absence d'eau, d'air, etc Par exemple, Brodersen et al. (2010) a utilisé le logiciel Avizo à quantifier le changement de volume de gouttelettes d'eau à l'intérieur de vaisseaux vigne remplissage. Les plantes ont été analysés toutes les 30 min pendant quatre à huit heures la création d'un temps-laséquence pse du navire remplissage. Chaque scan a été reconstruit et chargé dans Avizo, où des gouttelettes individuelles ont été mesurées au cours du temps que leur volume augmente.

Representative Results

Rayonnement synchrotron scans HRCT ont été mis en œuvre avec succès sur une grande variété de tissus végétaux et des espèces en utilisant ligne de lumière 8.3.2 (figure 5), et ont fourni de nouveaux aperçus sur la structure et la fonction du xylème des plantes à une résolution sans précédent en 3D. Les capacités de visualisation et d'exploration prévus par les reconstructions 3D (comme illustré dans les figures 6-8; 1-3) et films permettent de déterminer avec précision l'emplacement et l'orientation des structures avec les réseaux du xylème des deux échantillons excisés et plantes vivantes.

Dans certaines situations, mouvement de l'échantillon ou des vibrations non désirées ont causé des distorsions dans les images finales, ce qui rend inutilisables les analyses (par exemple la Figure 4), mais les améliorations pour réduire le temps de balayage (avec tomographie continue) ont minimisé les effets néfastes de ces pertes de données en raison de nombreux plus de scans peuvent maintenant être achevé dans le temps de faisceau limitéeattribuer à chaque utilisateur. Ces temps d'analyse plus courts permettent également de mesures répétées d'une réplique unique dans le temps pour saisir la dynamique des processus tels que la propagation embolie et la réparation.

Figure 1. Schématique d'échantillonnage par balayage procédure de configuration et à l'intérieur de la cage à la SLA ligne de lumière 8.3.2 En haut à gauche:. La source de faisceau de rayons X (1) est projeté à travers l'échantillon (2) qui est fixé à la table d'air avec un mandrin qui tourne pendant le balayage. Les rayons X qui passent à travers l'échantillon frapper un cristal scintillateur (4) qui émet une fluorescence visible, qui est redirigé par un miroir (5) à travers des lentilles (6) à une caméra CCD (7) qui capture une image numérique. Les «premières» en 2D des images radiographiques (en haut à droite l'image-exemple est un exemple de tige de la plante tourné de 180 ° lors d'un analyse complète à une augmentation de 0,25 ° résultant en 720 images 2D) sont transformés et se traduire par une pile d'images transversales (en bas à droite) qui sont utilisées pour les reconstructions 3D. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. Image prise à l'intérieur de la cage de la ligne de lumière SLA 8.3.2 montrant un live, la vigne en pot prêt pour la numérisation. La vigne est contenue dans un tube acrylique (1). Le faisceau de rayons X pénètre dans la cage vers la gauche (2), puis passe à travers l'échantillon (par exemple, la tige de vigne) (3), puis pénètre dans une boîte étanche à la lumière contenant la caméra, scintillateur et l'optique (case non représentée sur cette image ).

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Figure 3. Exemple de fissuration de l'échantillon (notée avec les flèches blanches) quand une racine ligneuse (voir ici) a été soumis à un séchage trop longtemps et / ou à une température trop élevée. Afin d'éviter ces dommages et à maintenir l'intégrité structurelle et la fidélité à la structure des tissus en déshydratation vivo nécessite quelques essais à l'avance. Barre d'échelle = 1 mm.

Figure 4. Distorsions de l'image, comme on le voit ici, pour de nombreuses petites racines ligneuses, résultent de déplacement de l'échantillon au cours de la période de balayage. Dans cet exemple, une colonne de racines ligneuses de petite taille (chaque tache lumineuse blanche est une racine unique) encore attachés à une plante vivante ont été scannés et apparemment déplacé lors de l'analyse et de résultated dans l'image déformée. Pour surmonter ce échantillons d'émission doivent être solidement stabilisé avec un rembourrage supplémentaire à l'intérieur du tube acrylique autour de l'usine.

Figure 5. Exemples d'images transversales de tiges ligneuses recherché (A) Coastal Redwood et (B) Oak Valley. Barres d'échelle blancs sont de 1,0 mm dans les deux images. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 6. Reconstruction 3D d'une tige généré à partir d'une analyse HRCT d'un jeune arbre vivant côte séquoia représenté avec une longitudinale et trplan ansverse exposés. La plupart du xylème vu dans cette image est rempli d'eau, alors qu'il ya des conduits d'air remplis au centre de la tige (flèche noire) qui a résulté de la cavitation lors d'une expérience de sécheresse. Cette analyse a également capturé conduits dans l'acte de cavitation-voir les conduits intermédiaires de gris formant un anneau à mi-chemin entre le centre et la tige extérieure (flèche blanche).

Figure 7. Image de Brodersen et al 2012 -. Plant, Cell & Environnement démontrant la reconstruction 3D d'arrangement xylème vasculaire chez deux espèces de fougères numérisées à deux endroits différents de la fronde faisceaux vasculaires sont visibles en bleu tandis que le tissu environnant est en vert. En Pteridium aquilinum, le chignon vasculairegnées sont optimisés pour une conductivité élevée avec des liaisons à la fois dans de nombreux thalles la pointe (a) et la base (c). En revanche, Woodwardia fimbriata a conclu une entente beaucoup plus conservatrice vasculaire avec peu de liens entre les paquets dans la pointe fronde (b) et la base (d). Les dispositions vasculaires résultant donner lieu à des taux de photosynthèse dans P. aquilinum, mais au détriment de la faible tolérance à la sécheresse, tandis que W. fimbriata est optimisé pour la longévité fronde avec les taux de photosynthèse plus faibles, mais plus de tolérance sécheresse. Pointe Fronde et des articles de base sont d'environ 4 mm et 9 mm de diamètre, respectivement.

Figure 8. Reconstruction 3D générés à partir d'une analyse HRCT du xylème tige noyer. Cette image permet de démontrer la capacité d'explorer le tissu dans la résolution incroyable que ce sont deux conduits du xylème adjacents qui partagent un mur interconnectés pour une grande partie de leur longueur. Ici, le traitement d'image et de lissage avoir enlevé la mince paroi de la cuve commune dans le rendu de volume. Emplacement précis et de l'épaisseur de cette paroi de la cuve est retenue dans les premières données d'image et peuvent être utilisées pour étudier la connectivité. Chacun des vases communicants dans cette image ont un diamètre ~ um 40.

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Discussion

Synchotron HRCT fournit phytobiologistes avec une puissante non destructive outil pour explorer les rouages ​​du système vasculaire des plantes en détail incroyable. Cette technologie a été utilisée récemment pour identifier auparavant non décrite structures anatomiques dans le xylème vigne qui modifient de façon différentielle la connectivité réseau du xylème chez les espèces de vigne diverses (Brodersen et al 2012b, sous presse.) - Cette connectivité peut considérablement altérer la capacité des pathogènes vasculaires et embolies de se propager destructive à travers les réseaux du xylème. Les premiers balayages de plantes vivantes qui ont également révélé détail à échelle fine des processus dynamiques comme la propagation d'embolie et de réparation (Brodersen et al 2010; McElrone et al 2012 New Phytologist 196 (3) :661-665), et a aidé à mettre en cause le rôle de un type spécifique de cellules vivant dans la réparation de l'embolie-la résolution spatiale fournie par HRCT à la SLA 8.3.2 rendu cela possible. Des détails sur ces processus et d'autres aspects de réseaux xylème demeurent insaisissables-HRCT jouera probablement un rôle clé dans la découverte continue en particulier lorsqu'il est associé à d'autres techniques de haute résolution (par exemple la capture microdissection laser), et pourrait être jumelé avec d'autres récemment mis au point des techniques de visualisation avancées pour une utilisation en biologie végétale ( par exemple, Lee et al, 2006; Truernit et al, 2008; Jahnke et al, 2009;. Iyer-Pascuzzi et al 2010).

Materials

See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2